葉葉樹子層積過程中生理響應(yīng)的研究

葉葉樹子層積過程中生理響應(yīng)的研究

香樹種是樟科多年生灌木和小型植物，樹皮呈淺棕色。產(chǎn)于粵華、華南和西南部各省。主要生長在潮濕的山地和稀疏的森林中。耐陰,適應(yīng)性強(qiáng),喜溫暖氣候及濕潤、酸性土壤,耐修剪,生長速度中等偏快。全果出油量為40%~60%,種子榨油可食用,也可作為制皂、潤滑、油墨、醫(yī)藥等工業(yè)原料。香葉樹適應(yīng)性強(qiáng)、生長快,既是優(yōu)良速生用材和園林綠化樹種,又是化工、制藥的優(yōu)質(zhì)原料,因而開發(fā)前景廣闊種子休眠是指具有生活力的成熟種子在適宜的萌發(fā)條件下仍不萌發(fā)的特性,是植物在長期演化過程中為適應(yīng)環(huán)境變化及抵抗不良環(huán)境條件所獲得的生物學(xué)特性。種子休眠的原因很復(fù)雜,一般認(rèn)為導(dǎo)致種子休眠的原因主要有:(1)種皮結(jié)構(gòu)特殊,不透水和氣,胚不能吸漲,因而不能進(jìn)入活躍狀態(tài);(2)果皮或胚中有抑制萌發(fā)的物質(zhì)存在;(3)胚未發(fā)育完全或某些生理生化過程尚未完成1材料和方法1.1種子層積萌發(fā)香葉樹果實(shí)采于云南省保山市騰沖縣,每年10月成熟。收集的果實(shí)堆放待果實(shí)腐熟變軟,搗碎水浸,漂洗出果皮和果肉,多次沖洗去雜,得到純凈種子,自然晾干后貯藏于冷柜中(4℃)備用。首先對(duì)種子沙藏的沙土進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%高錳酸鉀消毒,于2009年12月10日將種子埋入沙中進(jìn)行低溫層積處理。層積條件為0~10℃濕藏,保持沙土和種子濕潤。每10d對(duì)沙藏花盆進(jìn)行重新倒盆、澆水、混合;每3周取1批種子,共取6次。種子取出后置于4℃冰箱密封保存。層積過程中有胚根萌發(fā)時(shí)將萌發(fā)的種子取走并進(jìn)行記錄,統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。當(dāng)胚根突出珠孔1mm時(shí),種子視為已萌發(fā)。1.2方法1.2.1種子萌發(fā)率測定不同層積時(shí)間的種子均先用0.1%高錳酸鉀消毒20min,然后用蒸餾水沖洗干凈。發(fā)芽在培養(yǎng)皿中進(jìn)行,以2層濾紙作發(fā)芽床,每皿處理50粒種子,重復(fù)3次,最后轉(zhuǎn)入16L-8D光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)。每2d澆1次水,每4d更換1次濾紙。分別于20、40、60d之后記錄發(fā)芽率。以胚根突破種皮、長度為種子一半時(shí)為萌發(fā)指標(biāo),并對(duì)發(fā)芽情況進(jìn)行觀測、記錄。1.2.2吸脹劑的吸收劑為復(fù)合液濕法溫床取完整種子(去除假種皮,但中種皮完整的種子)25粒,稱其氣干狀態(tài)下的干質(zhì)量,加50mL蒸餾水,放在27℃恒溫箱中吸脹,在前12h內(nèi)每隔4h取出1次,用濾紙吸干表面水分后稱其濕重,隨后每隔12h取出1次,直至吸水飽和為止。通過對(duì)種子吸脹至飽和速率的對(duì)比,證明種皮是否對(duì)種子萌發(fā)具有機(jī)械阻礙作用1.2.3胚軸的發(fā)育情況取層積不同階段的種子,解剖觀察種胚的形態(tài)和大小,以判斷在層積過程中胚軸的發(fā)育情況。并將層積種子剝?nèi)シN皮,分離兩片子葉,于10倍體視顯微鏡下觀察其胚軸形態(tài)。1.2.4實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組隨機(jī)取90粒種子,做3組平行試驗(yàn),沿種胚中央切開,一半作染色組,一半作對(duì)照組。將種子切面向下,置于鋪有1層濾紙的培養(yǎng)皿中,實(shí)驗(yàn)組用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的TTC溶液浸泡,對(duì)照組用水浸泡。置于室溫下,于12h后觀察染色情況1.2.5總研磨物的蒸發(fā)為了檢測種子萌發(fā)抑制物是否存在,將種子的種胚與種皮分離,各稱取7g,置于--20℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇中,4℃浸提48h,提取液于培養(yǎng)皿中蒸發(fā)濃縮至7mL(此時(shí)對(duì)應(yīng)總研磨物濃度為1g/mL)。6000r/min4℃離心10min取上清,稀釋至0.2、0.4、0.6g/mL。用油菜(Brassicacampestris)種子做生物鑒定材料,分別取0.2、0.4、0.6g/mL濃度的香葉樹種皮與種胚提取液,并以蒸餾水、體積分?jǐn)?shù)為40%、80%甲醇作為對(duì)照,對(duì)油菜種子進(jìn)行常溫浸泡2h后,于培養(yǎng)皿中做萌發(fā)實(shí)驗(yàn),每個(gè)培養(yǎng)皿中放置50粒種子,24h后統(tǒng)計(jì)油菜種子發(fā)芽率。1.2.6種子在睡覺過程中改變了抗酶系統(tǒng)1.2.6.種子層積的制備在綜合4種抗氧化酶提取液配方的基礎(chǔ)上,我們統(tǒng)一了提取液配方,即在單一的提取系統(tǒng)中得到粗酶液。提取液配方為:50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0),質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP),1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),1mmol/L抗壞血酸(AsA)取不同層積階段種子各15粒(約1g),去皮。液氮中將種子研磨成粉末,分別稱取0.2g粉末置于2mL離心管中,每個(gè)梯度做3個(gè)平行對(duì)照。每支離心管中加入2mL提取液,充分混合后14000r/min4℃離心30min;吸取上清1mL于2mL離心管中,并加入提取液1mL,14000r/min4℃再次離心30min,取上清1.5mL,再加入1.5mL由提取液稀釋過的體積分?jǐn)?shù)為40%的甘油,混勻即為酶的粗提液。置于超低溫冰箱中凍存。1.2.6.活性成分的測定1)超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定:顯色反應(yīng)時(shí),在體系中加入:0.05mol/L磷酸緩沖液(pH7.8)1.75mL,130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液0.3mL,0.75mmol/L氮藍(lán)四唑(NBT)溶液0.3mL,0.1mmol/LEDTA溶液0.3mL,0.02mmol/L核黃素0.3mL,粗提酶液0.05mL。另取兩管以緩沖液代替酶液的體系做為對(duì)照,將其分別置于暗處和照光處。將加入酶液的18只試管和照光對(duì)照置于2000lx日光燈下反應(yīng)20min(確保各管照光均勻)。至反應(yīng)結(jié)束后,以不照光的對(duì)照管做空白,分別測定其他各管的吸光度A2)過氧化氫酶(CAT)活性的測定:顯色反應(yīng)時(shí),在體系中加入0.2mol/L磷酸緩沖液(pH7.8)2.65mL,粗酶液0.05ml,最后加入0.1mol/LH3)過氧化物酶(POD)活性的測定:顯色反應(yīng)時(shí),在體系中加入0.05mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)1.0mL,0.05mol/L愈創(chuàng)木酚2.5mL,粗酶液0.1mL,最后加入體積分?jǐn)?shù)2%過氧化氫啟動(dòng)反應(yīng)。以磷酸緩沖液代替酶液作為空白對(duì)照。在體系中加入過氧化氫后立即倒入比色皿開始讀數(shù),隨后每1min讀數(shù)1次,讀4min,記錄5組數(shù)據(jù)。反應(yīng)結(jié)束后,以每分鐘A4)抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的測定:顯色反應(yīng)時(shí),在體系中加入0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)2.65mL(含1mmol/L抗壞血酸AsA),粗酶液0.05mL,最后加入25mmol/L過氧化氫啟動(dòng)反應(yīng)。以磷酸緩沖液作為空白對(duì)照。在體系中加入過氧化氫后立即倒入比色皿開始讀數(shù),之后每1min讀數(shù)1次,讀4min,記錄5組數(shù)據(jù)。反應(yīng)結(jié)束后,以每分鐘A1.2.7硫代巴比妥酸t(yī)ba取不同時(shí)間梯度種子各15粒(約1g),去皮后研碎,分別稱取0.2g于4mL離心管中,每個(gè)梯度做3個(gè)平行對(duì)照。加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的三氯乙酸溶液4mL,混合后12000r/min離心20min;吸取上清2mL,加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.67%硫代巴比妥酸(TBA)溶液2mL,在100℃沸水浴上煮沸30min,冷卻后再12000r/min離心20min。測定吸光度時(shí),分別測定離心后上清液在450、532和600nm處的吸光度值,并按照公式C=6.45(A2結(jié)果與分析2.1種子發(fā)芽率的影響從圖1可以看出:隨著種子層積時(shí)間的延長,種子發(fā)芽率有了明顯的增加。未層積前,種子僅有1%的發(fā)芽率;當(dāng)種子層積達(dá)到11周時(shí),種子發(fā)芽率達(dá)到15%;到層積16周時(shí),種子發(fā)芽率增加一倍。這表明層積低溫層積處理可以有效地打破種子休眠,層積后期效果更為顯著。2.2種子的吸水性從圖2可以看出:完整的香葉樹種子前10h種子的吸水速率直線上升,10~40h之間種子的吸水速度減慢,吸脹40h后達(dá)到飽和。由此可見,香葉樹種皮的機(jī)械硬度較小,吸水至飽和的時(shí)間較短,可判定種皮對(duì)發(fā)芽幾乎沒有機(jī)械抑制作用。2.3種子胚軸的變化通過對(duì)層積過程中的種子進(jìn)行胚軸發(fā)育情況觀察,發(fā)現(xiàn)在整個(gè)層積過程中,種子胚軸大小變化較小(圖3),表明香葉樹種子不具有胚形態(tài)后熟的現(xiàn)象,休眠源于生理原因的后熟。2.4不同種子缺少氧化應(yīng)因子通過TTC對(duì)種胚進(jìn)行染色,可觀察到隨著種子層積時(shí)間增長,被染紅種子數(shù)量增加,種子內(nèi)脫氫酶活性呈增加趨勢(shì),種子活力不斷加強(qiáng)。染色率由未進(jìn)行層積種子的37%,上升至層積16周種子的79%(圖4)。2.5種子萌發(fā)率的測定以油菜種子作為生物鑒定材料,測定香葉樹種皮與種胚中抑制物的存在。從油菜種子的萌發(fā)率可以看出,香葉樹種胚與種皮中都含有一定量的抑制物,種胚中抑制物的含量要高于種皮。當(dāng)抑制物濃度較小時(shí),幾乎沒有抑制作用,但當(dāng)其積累到一定量后,會(huì)對(duì)種子萌發(fā)產(chǎn)生一個(gè)較為明顯的抑制作用(表1)。2.6種子活性的變化從圖6可以看出:在種子低溫層積過程中,種子內(nèi)代謝活動(dòng)增加,其抗氧化酶系統(tǒng)的4種酶(SOD、CAT、POD、APX)活性產(chǎn)生了不同的變化趨勢(shì)。在層積過程中,SOD和CAT兩種酶的活性均是在出現(xiàn)一個(gè)下降過程后又開始逐步上升,推測可能是休眠種子的一種自我保護(hù)機(jī)制。而POD和APX兩種酶的活性整體呈增加趨勢(shì),但是增加過程中出現(xiàn)了不同幅度的波動(dòng),推測出現(xiàn)波動(dòng)的原因與層積時(shí)水分條件及溫度的變化有關(guān)。2.7過氧化mda植物器官衰老時(shí)或在逆境條件下,往往發(fā)生質(zhì)膜過氧化作用。丙二醛(MDA)是其產(chǎn)物之一,通常利用它作為脂質(zhì)過氧化指標(biāo),表示細(xì)胞質(zhì)膜過氧化程度。隨著層積時(shí)間的延長,MDA的含量下降。但在層積處理后期,MDA含量變化不明顯,表明種子活力已經(jīng)基本恢復(fù)(圖7)。3種子后熟的影響種子萌發(fā)和TTC染色結(jié)果表明,隨著層積時(shí)間增長,種子活力有了較大幅度的增加,當(dāng)層積達(dá)到16周時(shí),種子發(fā)芽率達(dá)到最大。從層積后期中取出的、未進(jìn)行任何發(fā)芽措施的種子已經(jīng)具有約32%的發(fā)芽率,這一結(jié)果說明低溫層積處理對(duì)打破香葉樹種子休眠具有重要作用。香葉樹種子在收獲后,種子的胚軸還不具備發(fā)育的條件,雖然有適宜的溫度及水分,但仍然難以萌發(fā),即種子存在生理后熟現(xiàn)象。種胚的發(fā)育需要經(jīng)過一個(gè)低溫(4℃)濕藏過程,將內(nèi)在的抑制種子萌發(fā)的因素消除,種子開始萌發(fā)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他有花林木種子休眠萌發(fā)結(jié)果相一致從種子吸水性測定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),香葉樹種子能較快吸脹飽和;對(duì)種子進(jìn)行剝皮時(shí)也能發(fā)現(xiàn),香葉樹種皮機(jī)械強(qiáng)度較小,非常易于去皮。因此可以得出結(jié)論:在香葉樹種子的萌發(fā)抑制中,其種皮的機(jī)械抑制作用可以忽略。在導(dǎo)致種子生理休眠的