碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌的耐藥機制及其與類整合子的相關性分析

碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌的耐藥機制及其與類整合子的相關性分析

銅綠假單胞菌是常見的細菌，是引起細胞菌感染的常見病原體。由于碳綠霉素的廣泛應用，這種類抗劑的耐候性植物繼續(xù)增加，銅綠假單胞菌的感染容易重復，難以控制。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，整合子在介導銅綠假單胞菌從單一耐藥向多重耐藥轉變過程中發(fā)揮了重要作用1數(shù)據(jù)和方法1.1來源及菌株鑒定選取2018年10月至2019年2月湖南省腦科醫(yī)院臨床分離的110株非重復銅綠假單胞菌。入組菌株經(jīng)全自動細菌鑒定儀鑒定，根據(jù)1.2細菌成像、分光光度計和細菌dna提取試驗實驗儀器包括全自動細菌鑒定儀(法國梅里埃公司，型號:VITEK-2compact);JUNYI電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司，型號:JY600C);凝膠成像儀(美國柯達公司，型號:GelLogic212);超微量分光光度計(美國賽默飛世爾科技有限公司，型號:NanoDropLite)。試劑包括美羅培南藥敏紙片(英國Oxoid公司，批號:2408075);細菌DNA提取試劑盒(美國Omega公司，批號:00D3350010000G20R079);PremixExTaq試劑盒(日本TaKaRa公司，批號:AI51239A);100bpDNALadder(北京Solarbio公司);引物由上海生工及湖南擎科公司合成。1.3方法1.3.1碳綠霉酶的檢測(1)改良Hodge法:依據(jù)2017年CLSI標準1.3.2dna模板和整合酶基因檢測采用聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)技術檢測Ⅰ類整合子。(1)制備DNA模板。參考提取細菌DNA試劑說明書提取細菌DNA，使用超微量分光光度計檢測模板純度，A260/A280在1.7～1.9，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?2)擴增整合酶基因。PCR反應體系為25μL,PremixExTaq12.5μL，模板DNA0.7μL，上下游引物各0.8μL(引物序列見表11.3.3．4整合子陽性菌株的基因組dna可變區(qū)PCR反應體系為25μL:PremixExTaq12.5μL，上述Ⅰ類整合子陽性菌株的基因組DNA為模板DNA0.7μL，上下游引物各0.8μL,RNaseFreeddH1.4統(tǒng)計方法采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料比較采用χ2結果2.1細菌鑒定試驗110株臨床分離的銅綠假單胞菌中，經(jīng)VITEK-2compact細菌鑒定儀以及藥敏試驗檢出CRPA39株，其中15.38%(6/39)表現(xiàn)為mCIM法和改良Hodge試驗同步陽性，僅1株表現(xiàn)為mCIM法陽性，部分實驗結果見圖1。2.2碳青霉烯類耐藥株類整合子和耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌類整合子的檢出情況Ⅰ類整合子檢出率為19.09%(21/110)，其中碳青霉烯類敏感株Ⅰ類整合子的檢出率為9.86%(7/71)，耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌Ⅰ類整合子的檢出率為35.90%(14/39)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2.3碳青霉烯類耐藥株可變區(qū)檢測以檢出的21株Ⅰ類整合子陽性菌株基因組DNA為模板擴增可變區(qū)，結果顯示，57.14%(12/21)可變區(qū)成功擴增，可變區(qū)片段長度為800～4500bp，大小不等，見圖3，其中碳青霉烯類敏感株可變區(qū)檢出率為2.82%(2/71)，而碳青霉烯類耐藥株可變區(qū)檢出率為25.64%(10/39)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2.4類整合子與單胞菌的關系在39株CRPA中，7株檢出碳青霉烯酶銅綠假單胞菌，且均攜帶Ⅰ類整合子，碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌產(chǎn)碳青霉烯酶與Ⅰ類整合子的攜帶具有一定相關性(r=0.530,P<0.01)，見表3。3類整合子與碳青霉烯酶耐藥前后關系銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染的主要病原菌之一，常引起皮膚黏膜、呼吸道、泌尿道等感染。碳青霉烯類藥物是臨床治療銅綠假單胞菌感染的常用抗菌藥物，具有抗菌譜廣、抗菌活性強的特點銅綠假單胞菌的耐藥機制復雜，整合子作為一種可移動的遺傳元件，是介導細菌耐藥的重要因素之一。有研究顯示，與未攜帶Ⅰ類整合子菌株相比，攜帶Ⅰ類整合子菌株對多數(shù)抗生素的耐藥率較高，提示Ⅰ類整合子在銅綠假單胞菌耐藥形成中發(fā)揮著重要作用本研究結果顯示，Ⅰ類整合子和碳青霉烯酶的攜帶在銅綠假單胞菌對碳青霉烯酶類耐藥甚至多重耐藥中發(fā)揮了重要作用，兩者具有中度一致性。但本研究樣本量較小，仍需進行大樣本量各類整合子分析，通過基因測序技術分析可變區(qū)相關耐藥基因盒的攜帶情況，從而進一步明確銅