一株絲狀藍(lán)藻的分離鑒定及其對(duì)原油的耐受性

一株絲狀藍(lán)藻的分離鑒定及其對(duì)原油的耐受性

藍(lán)藻對(duì)石油污染物的降解作用1991年，科維那半島戰(zhàn)爭期間發(fā)生了溢油事故，約770公里。藍(lán)藻在生長過程中往往伴隨大量可降解烴類的細(xì)菌,細(xì)菌生長在藍(lán)藻的粘液、藻鞘中,被藻絲裹著與藻形成了一個(gè)緊密結(jié)合的菌藻共生體系.盡管藍(lán)藻本身并不能直接代謝石油污染物,但對(duì)細(xì)菌降解石油污染物起著非常積極的促進(jìn)作用(Radwan等發(fā)現(xiàn)在阿拉伯海灣水體中,表層水體藍(lán)藻的附生菌較深層水體的更多.藍(lán)藻可先將石油烴富集在藻細(xì)胞,細(xì)菌再獲得這些物質(zhì),因而在與藍(lán)藻共生時(shí),降解菌的生長速率以及對(duì)原油的降解效率要高于其單獨(dú)培養(yǎng).他們認(rèn)為這種在環(huán)境中四處可見的藻-菌微生物體系,對(duì)控制海洋石油污染有非常積極的作用(本研究從石油污染港口水域分離篩選到一株藍(lán)藻,通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)藍(lán)藻進(jìn)行鑒定,并對(duì)藍(lán)藻的原油耐受性能進(jìn)行了研究,為該藍(lán)藻用于石油污染修復(fù)的研究奠定基礎(chǔ).杏仁2.1藍(lán)藻的分離培養(yǎng)樣品采自廣州黃埔港口,文沖船廠溢油事件20d左右.取表層水體當(dāng)天進(jìn)行藍(lán)藻的富集培養(yǎng).培養(yǎng)基選用BG11培養(yǎng)液(g·L實(shí)驗(yàn)所用原油為廣石化提供的奧斯柏格(Oseberg)原油(密度為:0.863g·cm單種藍(lán)藻用平板分離法得到:取100μL培養(yǎng)液于固體BG11培養(yǎng)基上涂布,等長出藻絲后挑取藻絲轉(zhuǎn)接,顯微鏡鏡檢確認(rèn)無其它藻即得到單種藻.2.2藍(lán)藻的鑒定2.2.1社會(huì)學(xué)觀察所用的顯微鏡為OlympusCX41,放大倍數(shù)為400倍.2.2.2生物鑒定11dna提取其操作步驟為:取培養(yǎng)液2mL,14000r·min2pcr擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建藍(lán)藻特異性引物(NübelCYA359F:GGGGAATYTTCCGCAATGGGCYA781R:CYA781(a)CYA781(b)等量混合CYA781R(a):GACTACTGGGGTATCTAATCCCATTCYA781R(b):GACTACAGGGGTATCTAATCCCTTTPCR反應(yīng)體系為50μL體系:25μLpremixtapenzyme(takara),1μL模板,正反向引物各1μL,22μL去離子水.PCR擴(kuò)增程序(Nübel瓊脂糖電泳檢測PCR結(jié)果后聚丙稀酰胺電泳檢測PCR產(chǎn)物純度,挖膠回收,委托上海生工測序.所得序列通過Blast程序與GenBank()中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析.MEGA軟件UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.2.3原油對(duì)藍(lán)藻生理指標(biāo)的影響2.3.1可溶性蛋白質(zhì)含量測定用乙醇分光光度法測定葉綠素含量.預(yù)處理好的藻液5mL中加入無水乙醇5mL聚四氟膜封口,錫箔紙遮光,置于冰箱中4℃下抽提24h,抽提液用紫外-可見分光光度計(jì)于645nm和663nm波長處測定吸光值(采用考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白質(zhì)含量.將藻液加入5mL0.05mol·L對(duì)含初始體積濃度為0.3%原油的樣品和空白樣品,在0～20d內(nèi)選取3、5、7、10、15、20d分別測定顫藻的生長情況,每樣品3個(gè)平行.選擇初始原油濃度為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.8%、1%的樣品,第7天測定顫藻的生長情況,每樣品3個(gè)平行.2.3.2抗氧化酶活性的測定將藻細(xì)胞液放入離心管中,4000r·min對(duì)含初始體積濃度為0.3%原油的樣品和空白樣品,在0～20d內(nèi)選取3、5、7、10、15、20d分別測定顫藻抗氧化酶活性,每樣品3個(gè)平行.選擇初始原油濃度為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.8%、1%的樣品,第7天測定顫藻的抗氧化酶活性,每樣品3個(gè)平行.2.4統(tǒng)計(jì)與分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析,采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),比較原油樣品與空白樣品之間的差異顯著性,顯著性水平為*貴3.1藍(lán)藻的分離和鑒定3.1.1藻絲的形態(tài)特征利用固體平板法分離得到一株絲狀單種藍(lán)藻,命名為GH1,藍(lán)藻以絲狀蔓廷生長在固體培養(yǎng)基平板上(圖1),顯微鏡下(放大400倍)觀察其形態(tài)(圖2)藻絲藍(lán)綠色,單條,直或略彎曲,無鞘,無偽分枝,橫壁處不收縊,頂端細(xì)胞鈍圓,無帽狀體.藻絲由圓柱形細(xì)胞組成,細(xì)胞長大于寬,細(xì)胞頂部具氣囊.根據(jù)上述形態(tài)特征,參照文獻(xiàn)(3.1.2dna序列及系統(tǒng)發(fā)育樹取7d培養(yǎng)藻液,對(duì)其DNA基因組提取,用藍(lán)藻特異性引物對(duì)其16SrDNA片斷擴(kuò)增.圖3為基因組DNA電泳圖(a)和PCR產(chǎn)物電泳圖(b).基因組DNA對(duì)應(yīng)的Mark大約23KB,可見總DNA提取相對(duì)比較完整.通過PCR擴(kuò)增,得到396bp長的DNA片斷,提交至Genbank并獲得登錄號(hào)為GU596950.與Genbank數(shù)據(jù)庫Blast比對(duì)結(jié)果見表1.通過聚類分析法構(gòu)建了絲狀藍(lán)藻GH1和同源性較高的10個(gè)藻株的系統(tǒng)發(fā)育樹.由圖4可知,GH1與顫藻目中的湖生藍(lán)絲藻、偽項(xiàng)圈藻同源性都高達(dá)99%,但其親緣關(guān)系都不在一個(gè)小分支上,故而不屬于同一種.因而暫確定其隸屬顫藻目.3.2振動(dòng)藻gh1對(duì)原油的耐心研究3.2.1原油對(duì)浮藻gh1生長的影響1藻附生菌對(duì)原油的降解效果葉綠素和蛋白質(zhì)含量是表征浮游植物生物量的指標(biāo),葉綠素表征生物量,可溶性蛋白更能體現(xiàn)細(xì)胞存活情況(藻附生菌對(duì)原油的降解主要集中在前7天,細(xì)菌代謝產(chǎn)生的CO2原油對(duì)顫藻gh1生長和代謝的影響原油濃度對(duì)顫藻GH1生長情況的影響如圖6所示.在0～0.3%體積濃度范圍內(nèi),顫藻的葉綠素和可溶性蛋白含量都隨原油濃度增加呈上升趨勢,原油含量高于0.3%體積濃度時(shí),曲線趨于平緩.在0～1%體積濃度范圍內(nèi),葉綠素和可溶性蛋白含量均高于空白值,這表明在0～1%濃度范圍內(nèi)原油對(duì)顫藻GH1生長均有促進(jìn)作用.在低濃度(低于0.3%體積濃度)原油培養(yǎng)條件下,隨著原油濃度的增加,被細(xì)菌代謝產(chǎn)生的CO3.2.2原油對(duì)藍(lán)藻氧化酶系統(tǒng)的影響許多化合物對(duì)生物體的毒性機(jī)理都與誘導(dǎo)體內(nèi)自由基(O1抗氧化酶系統(tǒng)圖7所示為顫藻GH1三種抗氧化酶活性隨生長時(shí)間變化情況.在空白培養(yǎng)條件下,三種酶的變化都是比較平緩的,并未隨時(shí)間增加出現(xiàn)非常明顯的增加或者下降的趨勢.在原油培養(yǎng)條件下,顫藻GH1的三種酶對(duì)原油都表現(xiàn)出非常敏感的應(yīng)答.SOD酶對(duì)原油剛開始表現(xiàn)出“應(yīng)激”作用,第3天活性極顯著高于空白樣(2低濃度有機(jī)污染物抗氧化酶系統(tǒng)圖8所示為原油濃度對(duì)顫藻GH1三種抗氧化酶活性的影響.在原油體積濃度低于0.3%范圍內(nèi),三種酶均隨原油濃度增加而上升,低濃度有機(jī)污染物刺激抗氧化酶活性升高,被認(rèn)為是微藻對(duì)有機(jī)污染物脅迫的可能反應(yīng)之一(微藻自身防御酶系統(tǒng)對(duì)有機(jī)污染物脅迫響應(yīng)具有一定的個(gè)體差異性,聶湘平等曾報(bào)道多氯聯(lián)苯在低濃度劑量時(shí)能刺激蛋白核小球藻和斜生柵藻SOD、POD酶,而高濃度劑量時(shí)又抑制這兩種酶的活性(本研究中,在原油脅迫下,藻體中O原油對(duì)顫藻gh1葉綠素含量的影響1)從石油污染的港口水域分離篩選到一株絲狀藍(lán)藻,通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)分析鑒定為顫藻.2)原油對(duì)顫藻GH1的生長有一定的促進(jìn)作用.原油培養(yǎng)條件下,顫藻GH1葉綠素含量的增長更快,原油樣品比空白樣品提前