豬-干擾素成熟多肽基因mpoifn的表達(dá)載體構(gòu)建及多貝

豬-干擾素成熟多肽基因mpoifn的表達(dá)載體構(gòu)建及多貝

干預(yù)（ifn）是一種具有抗炎性、腫瘤、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和免疫功能的細(xì)胞因子。根據(jù)其產(chǎn)生細(xì)胞、抗原特異性和分子結(jié)構(gòu)的不同分為3種類型:(1)白細(xì)胞干擾素(IFN-α);(2)纖維母細(xì)胞干擾素(IFN-β);(3)由激活的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生的免疫干擾素(IFN-γ)。從人干擾素的研究進(jìn)入基因水平以來(lái),一系列干擾素制劑已成功應(yīng)用于臨床。對(duì)豬β干擾素基因的研究始于1992年,Artursson等從基因組文庫(kù)中擴(kuò)增到豬β干擾素基因,研究發(fā)現(xiàn)豬β干擾素基因不含內(nèi)含子,僅以單拷貝的形式存在于豬的基因組中,每2000個(gè)經(jīng)偽狂犬病毒(PRV)刺激的豬淋巴細(xì)胞僅能產(chǎn)生1分子的β干擾素mRNA。我國(guó)于2000年克隆到豬β干擾素基因,夏春等研究證實(shí)豬β干擾素基因全長(zhǎng)561bp,共編碼186個(gè)氨基酸的前體蛋白,其中含21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和165個(gè)氨基酸的成熟多肽。迄今為止,獲得大量表達(dá)的豬β干擾素的方法多為原核表達(dá)。畢赤酵母系統(tǒng)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種表達(dá)系統(tǒng),它作為另一類異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)有其獨(dú)到之處。一方面,它屬于單細(xì)胞生物,因而保留了細(xì)菌系統(tǒng)易于操作和生長(zhǎng)快速的特點(diǎn);另一方面,酵母又具有真核生物細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),故具有翻譯后正確的加工和修飾功能;而且由于畢赤酵母分泌的內(nèi)源性蛋白少,故而外源蛋白分泌表達(dá)后比較易于純化。本研究利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)豬β-干擾素,實(shí)現(xiàn)了豬β-干擾素的高效表達(dá),對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Westernblot分析和微量病變抑制試驗(yàn)分析,結(jié)果表明重組畢赤酵母豬β-干擾素具有較強(qiáng)的抗病毒活性,不僅可保護(hù)MDBK細(xì)胞抵抗VSV的攻擊,還可保護(hù)IBRS-2細(xì)胞抵抗口蹄疫病毒(FMDV)的攻擊,從而為豬β-干擾素的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1ppc9k9.3kmpcDNA3.1-PoIFNβ質(zhì)粒含有豬β干擾素(GenBank:AY687281)全長(zhǎng)片段,由本室保存。pPIC9K(9.3kb)載體為攜帶α因子啟動(dòng)子,同時(shí)具備Amp和Kan雙重抗性的酵母-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒。畢赤酵母菌株GS115/His-4及其畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K均購(gòu)自Invitrogen公司。1.2水炎病毒的篩選牛腎細(xì)胞(MDBK)及豬腎細(xì)胞(IBRS-2)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。水泡性口炎病毒(VSV)和口蹄疫病毒(FMDV)為本室保存。VSV的TCID50為10-7.383/mL。FMDV的TCID50為10-5.8/mL。1.3試劑與檢測(cè)試劑各種限制性內(nèi)切酶,T4DNA連接酶,DNAMarker均為T(mén)aKaRa(大連)公司產(chǎn)品;TaqDNA聚合酶購(gòu)自Promega公司;dNTPs、DNA快速回收試劑盒購(gòu)自上海生工公司;胰蛋白胨、酵母浸出粉為OXID公司產(chǎn)品;YNB購(gòu)自Difco公司;鮭魚(yú)精DNA(ssDNA)為GIBCOL公司產(chǎn)品;D-葡萄糖、LiCl購(gòu)自上海生工生物工程有限公司,聚乙二醇4000為上海浦東高南化工廠產(chǎn)品;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)于Sigma公司。1.4pcr擴(kuò)增環(huán)境根據(jù)筆者已克隆測(cè)序的梅山豬β-干擾素序列,在其成熟蛋白序列兩端合成引物對(duì)。上游引物PL:5′-TTTGAATTCATGAGCTATGATGTG-3′,含有EcoRⅠ位點(diǎn);下游引物PR:5′-TTTGCGGCCGCTCAGTTCCGGAGGTA-3′,含有NotⅠ位點(diǎn)。以pcDNA3.1-PoIFNβ為模板進(jìn)行PCR,擴(kuò)增梅山豬β干擾素成熟肽基因mPoIFNβ。PCR反應(yīng)條件:95℃5min;94℃30s,56℃30s,72℃30s,30個(gè)循環(huán);72℃10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳。切割目的片段(約498bp),再以DNA快速回收試劑盒回收。1.5ppc9k陽(yáng)性重組質(zhì)粒的構(gòu)建PCR回收產(chǎn)物分別用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后,回收目的片段(mPoIFNβ),并與同樣雙酶切回收的穿梭質(zhì)粒pPIC9K在16℃連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化DH5α菌株,提取質(zhì)粒,進(jìn)行PCR、雙酶切鑒定和測(cè)序,將獲得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-mPoIFNβ。取5～10μgpPIC9K-mPoIFNβ,用SalⅠ酶切,電泳回收9.8kb片段,置-20℃?zhèn)溆谩?.6gs115/ppc9k-mpoifn基因組的制備參照EasySelectTMPichiaExpressionKitIntroductionMannual的說(shuō)明,用0.1mol/L的LiC1致敏畢氏酵母菌株GS115制備成感受態(tài)細(xì)胞,將它與線性化的pPIC9K-mPoIFNβ混合,在50%PEG與2mg/mLssDNA的輔助下,通過(guò)42℃熱激轉(zhuǎn)化,最后涂布于His-的MD平板,28～30℃培養(yǎng)2～4d。將長(zhǎng)出的酵母菌落(挑取白色大菌落)挑于2mLMD培養(yǎng)基中28～30℃培養(yǎng)24h,依照劉秋云等報(bào)道的方法提取重組酵母菌GS115/pPIC9K-mPoIFNβ基因組。以此基因組為模板并以酵母載體引物(5′α-factorprimer:5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′;3′AOX1Primer:5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,重組在理論上應(yīng)擴(kuò)出693bp(195+498)的片段。挑取空白表達(dá)載體pPIC9K轉(zhuǎn)化的重組菌GS115/9K作為對(duì)照,進(jìn)行相同處理,應(yīng)擴(kuò)出195bp片段。PCR反應(yīng)條件:95℃5min;94℃1min,56℃1min,72℃1min,30個(gè)循環(huán);72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂凝膠電泳鑒定。1.7多貝各原料濃度的mdp篩選將通過(guò)MD平板初步篩選獲得的約700個(gè)轉(zhuǎn)化子經(jīng)含不同濃度G418(0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL)的MD平扳進(jìn)一步篩選多拷貝插入的重組子。在4.0mg/mL的MD平板上獲得高抗菌株。1.8離心收集測(cè)定將此高抗菌株菌落挑入2mLBMGY,28～30℃培養(yǎng)24h,待OD630達(dá)到10后,以1∶10的比例轉(zhuǎn)入BMMY中連續(xù)培養(yǎng)4d,期間每隔24h加甲醇1次,使其終濃度為1%,離心收集上清。進(jìn)行SDS及Westernblot分析。1.9免疫組化免疫家兔以pcDNA3.1-PoIFNβ按200μg/只肌肉免疫家兔,每周注射1次,共免疫3次。心臟采血收集兔抗豬β-干擾素血清,分裝于-80℃?zhèn)溆谩?.10豬-干預(yù)的理化性質(zhì)的評(píng)價(jià)1.10.1對(duì)胰酶的敏感性向重組豬β-干擾素中加入0.25%的胰酶液37℃水浴作用30min后,立即在MDBK-VSV系統(tǒng)上測(cè)定效價(jià),并設(shè)立對(duì)照。1.10.2.熱的滲透性將重組豬β-干擾素水浴(56℃)加熱2h,測(cè)定效價(jià),并設(shè)立對(duì)照。1.10.3酸的敏感性將重組豬β-干擾素用HCl調(diào)pH值至2.0,4℃放置24h,用NaOH將pH值調(diào)回后,測(cè)定效價(jià),并設(shè)立對(duì)照。1.10.重組豬-干擾雙標(biāo)回復(fù)突變?cè)囼?yàn)分別制備抗豬β-干擾素抗體和抗豬γ-干擾素抗體(以pcDNA-PoIFNβ、pcDNA-PoIFNγ免疫兔體收取血清)。將重組豬β-干擾素分別等量與上述抗體混合后,37℃水浴作用1h,然后測(cè)定效價(jià)。同時(shí)設(shè)陰性兔血清做對(duì)照。1.11活性單位檢測(cè)微量細(xì)胞病變抑制法測(cè)定重組酵母豬β-干擾素生物學(xué)活性,采用牛腎細(xì)胞MDBK-VSV系統(tǒng)測(cè)定。將抑制50%細(xì)胞病變(CPE50)出現(xiàn)孔的干擾素最高稀釋度定為1個(gè)干擾素活性單位(U)。分別以鏡下觀察結(jié)果和甲基紫染色法測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物活性單位。甲基紫染色法:用100μLPBS洗滌各孔1次。每孔加入100μL甲基紫染液(5g/L結(jié)晶紫溶于70%甲醇),染色1min,傾除染液,以自來(lái)水輕輕洗滌96孔板,自然干燥,肉眼觀察結(jié)果,標(biāo)準(zhǔn)同上。1.12豬-干擾對(duì)抗口蹄疫病毒的效價(jià)觀察IBRS-2細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,待細(xì)胞長(zhǎng)至單層后,加入不同稀釋滴度的豬β-干擾素,24h后以100TCID50FMDV攻毒,觀察其抗口蹄疫病毒的效價(jià)。2結(jié)果2.1山楂豬干擾成熟肽基因檢測(cè)以PL(含有EcoRⅠ位點(diǎn))和PR(含有NotⅠ位點(diǎn))為引物擴(kuò)增到梅山豬β干擾素成熟肽基因mPoIFNβ(498bp),如圖1所示。2.2因子切割位點(diǎn)pPIC9K-mPoIFNβ重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建見(jiàn)圖2;α因子切割位點(diǎn)如圖3所示。用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pPIC9K-mPoIFNβ,1%瓊脂糖凝膠電泳在9.3kb和498bp處發(fā)現(xiàn)條帶,與預(yù)計(jì)結(jié)果相符(圖4)。2.3md-pcr法檢測(cè)基因片段將pPIC9K-mPoIFNβ重組質(zhì)粒及pPIC9K空載體分別用SalⅠ線性化后,回收線性化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化畢氏酵母GS115,利用MD選擇性培養(yǎng)基挑選出生長(zhǎng)快,菌落白、大、圓的菌株,并提取其基因組,以5′端α-factorprimer和3′AOX1Primer為上下游引物進(jìn)行PCR鑒定,篩選含有目的基因片段的重組子。若mPoIFNβ與酵母成功重組則應(yīng)擴(kuò)增出693bp(195+498)的片段,若未重組則只能擴(kuò)出195bp的小片段,從圖5可見(jiàn)成功重組。2.4型mds-pcr的表達(dá)純化挑取GS115/pPIC9K-mPoIFNβ陽(yáng)性酵母菌及GS115/pPIC9K對(duì)照菌落,用1%甲醇連續(xù)誘導(dǎo)4d后離心取上清進(jìn)行SDS,結(jié)果如圖6A所示?？梢?jiàn)與空白菌比較,重組菌誘導(dǎo)表達(dá)上清液在分子量約22ku和26ku2處有明顯特異性條帶出現(xiàn),比預(yù)期的mPoIFNβ分子量(19.1ku)稍大。分泌表達(dá)的豬β干擾素的量約為80mg/L,占可溶性總蛋白的29.4%～30.8%。取表達(dá)的上清用75%硫酸銨4℃沉淀過(guò)夜,以PBS(pH7.4)透析24h,然后進(jìn)行Westernblot分析。確證GS115/pPIC9K-mPoIFNβ分泌表達(dá)了有免疫活性的PoIFNβ(圖6B)。2.5mdbk細(xì)胞和mds細(xì)胞中的抗體活性檢測(cè)GS115/pPIC9K-mPoIFNβ陽(yáng)性菌株以1%甲醇連續(xù)誘導(dǎo)4d后取上清,經(jīng)0.22μm的濾膜過(guò)濾后,以不同的稀釋滴度與MDBK細(xì)胞共孵育24h,然后以100TCID50的水泡性口炎病毒(VSV)攻擊,檢測(cè)結(jié)果表明,上清中表達(dá)的蛋白對(duì)VSV表現(xiàn)出較高的抗病毒活性,能夠有效抑制VSV病毒對(duì)MDBK細(xì)胞的致病作用,將抑制50%細(xì)胞病變的干擾素的最高稀釋度定為1個(gè)干擾素單位,顯微鏡下觀察結(jié)果與結(jié)晶紫染色后肉眼觀測(cè)結(jié)果一致,其抗病毒效價(jià)達(dá)到1.6×105U/mL,比活性達(dá)到2.0×106U/mg。2.6豬-干擾抗體將上清經(jīng)胰酶處理后完全失去活性;pH2的鹽酸處理過(guò)夜其抗病毒活性下降很少(耐酸);56℃作用2h,其抗病毒活性下降一半(對(duì)熱部分敏感);與特異性的抗豬β干擾素抗體37℃作用1h后,活性完全被中和,說(shuō)明特異性的抗豬β-干擾素抗體能特異性地與之相結(jié)合,而抗豬γ-干擾素的抗體或陰性兔血清都不能降低它的抗病毒活性,這也證明所表達(dá)的蛋白是豬β-干擾素(表1)。TheseassaysutilizedvesicularstomatitisvirusonMDBKcell2.7fmdv毒種將酵母上清經(jīng)1000～64000倍倍比稀釋后加入長(zhǎng)滿的IBRS-2細(xì)胞,24h后以100TCID50的FMDV攻毒,可見(jiàn)32000倍稀釋的重組豬β干擾素尚可保護(hù)IBRS-2細(xì)胞(表2)。+.CPE50positive;-.CPE50negative3--信號(hào)肽檢測(cè)ca-rendth小鼠gs115/ppc9k-mpoifn的表達(dá)畢赤酵母Pichiapastoris是近幾年發(fā)展起來(lái)的真核表達(dá)系統(tǒng)。作為一種新型真核表達(dá)系統(tǒng),能對(duì)所表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行加工、折疊、翻譯后修飾(信號(hào)肽切割、蛋白折疊、二硫鍵的形成、某些脂類的添加以及O-聯(lián)和N-聯(lián)糖基化等),并將其分泌到培養(yǎng)基中,分離純化簡(jiǎn)便,因而是一種較為理想的真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)。本試驗(yàn)中所選用的酵母菌GS115由NRRL-Y11430(NorthernRegionalResearchLaboratory,Peoria,IL)衍生而來(lái),是一種營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株,本身不能合成組氨酸,只有當(dāng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母后利用載體上所攜帶的編碼HIS4基因(2.4kb)才能合成組氨酸。利用GS115的此種生長(zhǎng)特點(diǎn),使用缺乏組氨酸的選擇性MD平板就可以篩選到重組的酵母菌株。然而在缺乏組氨酸的平板上長(zhǎng)出的His+轉(zhuǎn)化子并非100%發(fā)生重組,一般有50%～80%發(fā)生重組,余下的His+轉(zhuǎn)化子可能是標(biāo)記基因HIS4整合到宿主的同源位點(diǎn)而其他的載體序列沒(méi)有整合的緣故。即使正確重組,也可能由于重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)低而造成外源基因的低量表達(dá)。因此,利用pPIC9K是Kanr的表達(dá)載體,而細(xì)菌的卡那霉素抗性基因也可抵抗與真核抗生素G418相關(guān)的藥物的特點(diǎn),可以認(rèn)為對(duì)G418抗性的高低與卡那霉素抗性基因的拷貝數(shù)相關(guān),也就是與載體的拷貝數(shù)相關(guān)。通過(guò)這種方法,在本試驗(yàn)中選用700個(gè)轉(zhuǎn)化子在含高濃度G418(4.0mg/mL)的平板中篩選到1株高表達(dá)的酵母菌株,利用G418篩選及PCR鑒定的方法大大減少篩選高表達(dá)的酵母工程菌的工作量。與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比,P.pastoris最重要的優(yōu)點(diǎn)在于它的高效分泌表達(dá)。本試驗(yàn)中將豬β-干擾素成熟蛋白基因與α-分泌信號(hào)肽融合表達(dá),使重組蛋白在α-分泌信號(hào)肽的引導(dǎo)下穿過(guò)細(xì)胞膜被分泌到培養(yǎng)基中,易于分離和純化,可獲得高活性重組蛋白。若采用發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)技術(shù),可進(jìn)一步提高表達(dá)量。由于酵母分泌的內(nèi)源性蛋白比較少,所以分泌的異源蛋白在培養(yǎng)基中占絕大部分。因此,引導(dǎo)異源蛋白分泌到培養(yǎng)基中,其實(shí)也達(dá)到了初步純化的效果。本試驗(yàn)中,將重組菌GS115/pPIC9K-mPoIFNβ的誘導(dǎo)上清經(jīng)SDS與Westernblot分析,證實(shí)表達(dá)的重組蛋白mPoIFN-β(22ku和26ku)在α-factor信號(hào)肽的引導(dǎo)下被分泌到P.pastoris胞外,分泌表達(dá)豬β干擾素的量約為80mg/L,占可溶性總蛋白的29.4%～