基因工程及其在醫(yī)藥學(xué)中的應(yīng)用

基因工程及其在醫(yī)藥學(xué)中的應(yīng)用

重組DNA技術(shù)DNARecombinationTechnique

2我的課件，講義，多媒體教程◆基因工程相關(guān)概念◆基因工程相關(guān)的酶學(xué)◆基因工程的載體◆目的基因的制備和分離方法◆載體與目的基因的連接◆重組體的鑒定與分析◆隆基因的表達(dá)本章主要內(nèi)容3我的課件，講義，多媒體教程重組DNA技術(shù)的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1973年美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個重組DNA分子1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉4我的課件，講義，多媒體教程一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念

克隆(clone)

來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆2.克隆化(cloning)5我的課件，講義，多媒體教程(1)分子克隆(molecularclone),即DNA克隆;(2)細(xì)胞克?。?3)個體克?。▌游锘蛑参铮?/p>

技術(shù)水平:6我的課件，講義，多媒體教程7我的課件，講義，多媒體教程8我的課件，講義，多媒體教程9我的課件，講義，多媒體教程

細(xì)胞的分化潛能

全能性(totipotency)一個細(xì)胞在一定條件下具有發(fā)育成完整個體的潛能，稱為細(xì)胞的全能性(totipotency)。具有這種潛能的細(xì)胞稱為全能性細(xì)胞。10我的課件，講義，多媒體教程細(xì)胞核全能性11我的課件，講義，多媒體教程12我的課件，講義，多媒體教程3.DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增，提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)。

13我的課件，講義，多媒體教程DNA克隆目的:①分離獲得某一感興趣的基因或DNA;②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）。14我的課件，講義，多媒體教程重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目錄15我的課件，講義，多媒體教程（二）工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶ⅠDNA連接酶逆轉(zhuǎn)錄酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶16我的課件，講義，多媒體教程1.限制性核酸內(nèi)切酶

(restrictionendonuclease,RE)(1)定義識別DNA的特異序列,并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ17我的課件，講義，多媒體教程與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)：限制外源DNA，保護(hù)自身DNA，穩(wěn)定細(xì)菌遺傳性狀。(2)分類、作用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）18我的課件，講義，多媒體教程第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。(3)命名EcoRⅠ

屬種株序Escherichia

coli

RY13株大腸桿菌RY13株的第一種酶19我的課件，講義，多媒體教程(4)Ⅱ類酶識別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG20我的課件，講義，多媒體教程BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口21我的課件，講義，多媒體教程同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ22我的課件，講義，多媒體教程同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGG

AGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA23我的課件，講義，多媒體教程合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端2.DNA聚合酶Ⅰ24我的課件，講義，多媒體教程3.TaqDNA聚合酶

(TagDNApolymerase)是一種耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶，具有５‘→３’聚合酶活性，該酶最適反應(yīng)溫度為75°～80°25我的課件，講義，多媒體教程合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析4.逆轉(zhuǎn)錄酶26我的課件，講義，多媒體教程(1)具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而無53

外切活性.。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等.5.Klenow片段27我的課件，講義，多媒體教程6.DNA連接酶(DNA

ligase)功能:催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接.28我的課件，講義，多媒體教程功能:催化多聚核苷酸5′羥基

末端磷酸化，或標(biāo)記探針.7.多聚核苷酸激酶29我的課件，講義，多媒體教程功能:在3′羥基末端進(jìn)行種核

苷酸多聚物加尾8.末端轉(zhuǎn)移酶30我的課件，講義，多媒體教程（三）目的基因

cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)31我的課件，講義，多媒體教程功能:切除5’末端磷酸基團(tuán)9.堿性磷酸酶32我的課件，講義，多媒體教程

（三）基因載體(cloningvector)1.概念：攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。33我的課件，講義，多媒體教程來源分類：質(zhì)粒載體噬菌體載體病毒載體人工染色體載體用途分類：克隆載體表達(dá)載體穿梭載體2.常用載體:34我的課件，講義，多媒體教程克隆載體(cloningvector)能使插入的外源DNA序列被復(fù)制、擴(kuò)增而不能表達(dá)，這樣的載體為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)

使插入的外源DNA序列轉(zhuǎn)錄翻譯，表達(dá)出多肽鏈，這樣的載體稱為表達(dá)載體。35我的課件，講義，多媒體教程這類載體中含有來源不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，即具備原核細(xì)胞復(fù)制所需的序列結(jié)構(gòu)，又具有能使外源片段在真核細(xì)胞表達(dá)所需的結(jié)構(gòu)元件和相應(yīng)的選擇標(biāo)記基因,所以能在兩種受體細(xì)胞中復(fù)制并檢測，克隆的外源基因在此類載體直接從一種受體轉(zhuǎn)入另一種受體中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)．穿梭載體（shuttlevector)36我的課件，講義，多媒體教程3.載體具備以下條件:1.具有自我復(fù)制能力２．具有多個單一限制性酶切位點(diǎn)３．具有選擇性遺傳標(biāo)記４．分子量小，拷貝數(shù)高．５．具有較高的遺傳穩(wěn)定性37我的課件，講義，多媒體教程松弛型的復(fù)制子、多克隆位點(diǎn)、篩選標(biāo)記.

常見:質(zhì)粒、噬菌體◆克隆載體必需結(jié)構(gòu):38我的課件，講義，多媒體教程

具有復(fù)制子，篩選標(biāo)記，位于多克隆位點(diǎn)的上下游具有轉(zhuǎn)錄效率較高的啟動子，起始密碼子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止子結(jié)構(gòu)．◆表達(dá)載體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：39我的課件，講義，多媒體教程①概念:

存在于細(xì)菌染色體外的能獨(dú)立復(fù)制的雙鏈閉環(huán)的DNA分子。質(zhì)粒

(plasmid)40我的課件，講義，多媒體教程◆分子量相對較小，能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在◆能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制◆具有某些遺傳標(biāo)志,會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀；◆具有多個限制酶的單一位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)）②質(zhì)粒特點(diǎn):41我的課件，講義，多媒體教程42我的課件，講義，多媒體教程細(xì)菌質(zhì)粒43我的課件，講義，多媒體教程質(zhì)粒的復(fù)制類型

◆嚴(yán)謹(jǐn)型（strigentplasmid)：復(fù)制與宿主染色體同步受宿主染色體復(fù)制的限制，在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)低約１～３份拷貝．44我的課件，講義，多媒體教程◆松弛型（relaxedplasmid):復(fù)制不受宿主染色體復(fù)制的限制可獨(dú)立復(fù)制，在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)高．基因工程常用載體．45我的課件，講義，多媒體教程常用質(zhì)粒載體種類：pBR322pUC46我的課件，講義，多媒體教程pBR322:人工構(gòu)建重要質(zhì)粒優(yōu)點(diǎn)：具有較小的分子量．具有兩種抗生素抗性基因，可作為篩選標(biāo)記．具有高拷貝數(shù)．是松弛型質(zhì)粒．47我的課件，講義，多媒體教程目錄48我的課件，講義，多媒體教程pUC質(zhì)粒特點(diǎn)：１．來源于pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起始點(diǎn)２．具有兩種抗生素抗性基因，但基因內(nèi)無核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)３．含有大腸桿菌β－半乳糖苷酶α-肽段編碼基因統(tǒng)稱LacZ’基因４．靠近LacZ’基因５‘端有一段多克隆位點(diǎn)，影響LacZ’基因功能49我的課件，講義，多媒體教程５．含有一個調(diào)節(jié)LacZ’基因表達(dá)的阻遏蛋白基因LacIpUC質(zhì)粒優(yōu)點(diǎn)：１．具有更小的分子，更高的拷數(shù)２．適于組織化學(xué)檢測重組體．３．50我的課件，講義，多媒體教程51我的課件，講義，多媒體教程噬菌體(phage)

52我的課件，講義，多媒體教程◆λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克隆）噬菌體(phage)載體系統(tǒng)分類：◆M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列53我的課件，講義，多媒體教程左臂右臂非必需序列重組分子左臂右臂不能包裝的病毒顆粒左臂右臂插入單一酶切位點(diǎn)或一對內(nèi)切酶位點(diǎn)λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)５‘５‘左臂右臂54我的課件，講義，多媒體教程粘性質(zhì)粒(cosmid)55我的課件，講義，多媒體教程

結(jié)合質(zhì)?？寺≥d體和λ噬菌體克隆載體的優(yōu)點(diǎn)．結(jié)構(gòu)：質(zhì)粒DNA接上λ噬菌體粘性末端(cos).粘性質(zhì)粒(cosmid)：56我的課件，講義，多媒體教程◆具有λ噬菌體粘性末端特性◆具有質(zhì)粒耐藥性標(biāo)記◆具有多個限制性酶切位點(diǎn)◆具有高容量的克隆能力◆接上真核細(xì)胞復(fù)制子和啟動子及選擇標(biāo)記，就能在真核細(xì)胞中存在和表達(dá)．粘性質(zhì)粒的特點(diǎn)57我的課件，講義，多媒體教程酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其它58我的課件，講義，多媒體教程（四）目的基因

cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)59我的課件，講義，多媒體教程（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)（見第22章）

60我的課件，講義，多媒體教程化學(xué)合成獲取目的基因61我的課件，講義，多媒體教程*化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列62我的課件，講義，多媒體教程分子文庫63我的課件，講義，多媒體教程基因組DNA文庫獲取目的基因(genomicDNAlibrary)64我的課件，講義，多媒體教程組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫獲取目的基因目錄65我的課件，講義，多媒體教程EcoRIGenomicLibraryInfectcells66我的課件，講義，多媒體教程限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫目錄67我的課件，講義，多媒體教程cDNA文庫獲取目的基因(cDNAlibrary)68我的課件，講義，多媒體教程mRNAcDNA

雙鏈cDNA

重組DNA分子cDNA文庫反轉(zhuǎn)錄酶載體

受體菌

復(fù)制*從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄引物69我的課件，講義，多媒體教程cDNA文庫70我的課件，講義，多媒體教程基于核酸雜交的篩選;基于抗原抗體反應(yīng)的篩選。在文庫中篩選目的基因原理71我的課件，講義，多媒體教程72我的課件，講義，多媒體教程

聚合酶鏈反應(yīng)獲取(polymerasechainreaction,PCR)73我的課件，講義，多媒體教程5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

5

5

5

5

5

TemplateDNA5

5

5

5

5

5

5

5

PCR基本工作原理目錄74我的課件，講義，多媒體教程Cycle35

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。目錄75我的課件，講義，多媒體教程

PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C76我的課件，講義，多媒體教程模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分77我的課件，講義，多媒體教程（五）目的基因與載體的連接78我的課件，講義，多媒體教程

經(jīng)限制酶作用于目的基因與載體DNA，在連接酶催化下，來源不同雙鏈DNA片段，斷端重新形成３‘，５’－磷酸二酯鍵的過程．連接原理79我的課件，講義，多媒體教程

◆粘性末端連接

◆平端連接

◆一端粘性末端與另一端平端連接

連接方式：80我的課件，講義，多媒體教程方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接粘性末端連接81我的課件，講義，多媒體教程BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接目錄82我的課件，講義，多媒體教程不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。目錄定向克隆83我的課件，講義，多媒體教程適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端或粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端T4DNA連接酶催化平端連接．

平端連接84我的課件，講義，多媒體教程目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄85我的課件，講義，多媒體教程在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。同聚物加尾連接86我的課件，講義，多媒體教程5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′′5′′T(T)nTT(T)nT5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄87我的課件，講義，多媒體教程由平端加上新的含有限制性酶切位點(diǎn)的接頭，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

人工接頭(linker)連接88我的課件，講義，多媒體教程人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄89我的課件，講義，多媒體教程（六）重組DNA導(dǎo)入受體菌90我的課件，講義，多媒體教程受體菌條件：◆安全宿主菌◆限制酶和重組酶缺陷◆受體菌處于感受態(tài)(competent)

91我的課件，講義，多媒體教程感受態(tài)(competent):指細(xì)胞在一定的生理狀態(tài)可攝取外源性遺傳物質(zhì)經(jīng)體內(nèi)重組成為染色體中的一部分,導(dǎo)致受體細(xì)胞某些遺傳性狀的改變.經(jīng)人工處理能吸收重組DNA分子敏感狀態(tài)的宿主細(xì)胞，稱之為人工感受態(tài)細(xì)胞．92我的課件，講義，多媒體教程導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)93我的課件，講義，多媒體教程◆轉(zhuǎn)化(transformation)：以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入原核細(xì)胞的過程.◆轉(zhuǎn)染(transfection):以噬菌體或病毒為載體構(gòu)建重組DNA分子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程.94我的課件，講義，多媒體教程感染(infection):以人工改造的噬菌體或病毒為載體構(gòu)建重組DNA分子,經(jīng)體外包裝成具有感染性噬菌體或病毒顆粒后,借助于噬菌體或病毒的蛋白外殼將重組DNA分子注入細(xì)菌或真菌細(xì)胞,從而使目的基因得以復(fù)制的過程.95我的課件，講義，多媒體教程（七）重組體的篩選96我的課件，講義，多媒體教程(1)抗藥性標(biāo)記選擇(2)標(biāo)志補(bǔ)救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡1.直接選擇法97我的課件，講義，多媒體教程

2.免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等３.限制性內(nèi)切酶圖譜４.雙脫氧終止法測序（sanger法）98我的課件，講義，多媒體教程目錄(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇99我的課件，講義，多媒體教程組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體標(biāo)志補(bǔ)救目錄100我的課件，講義，多媒體教程101我的課件，講義，多媒體教程102我的課件，講義，多媒體教程

α互補(bǔ)的檢測目錄103我的課件，講義，多媒體教程原位雜交目錄核酸雜交104我的課件，講義，多媒體教程Southern印跡目錄105我的課件，講義，多媒體教程雞的β肌球蛋白的克隆和檢出目錄106我的課件，講義，多媒體教程重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目錄107我的課件，講義，多媒體教程

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程108我的課件，講義，多媒體教程重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基因

切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌

篩篩選重組體

109我的課件，講義，多媒體教程（八）克隆基因的表達(dá)110我的課件，講義，多媒體教程

將外源目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程稱為外源基因的表達(dá)．外源基因的表達(dá)外源基因的表達(dá)涉及目的基因的克隆、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)產(chǎn)物的加工及分離純化等過程，111我的課件，講義，多媒體教程表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化外源基因的表達(dá)步驟112我的課件，講義，多媒體教程外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)113我的課件，講義，多媒體教程原核表達(dá)系統(tǒng)就是將克隆的外源基因?qū)朐思?xì)胞，使其在細(xì)胞內(nèi)快速、高效地表達(dá)基因產(chǎn)物，主要有大腸桿菌、芽孢桿菌及鏈霉菌系統(tǒng)等．114我的課件，講義，多媒體教程

E.coli表達(dá)體系最為常用組成：選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動子翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點(diǎn)原核表達(dá)體系115我的課件，講義，多媒體教程表達(dá)載體pFASTBACI的物理圖譜116我的課件，講義，多媒體教程◆不宜表達(dá)真核基因組DNA◆不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)◆表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體

(inclusionbody)

◆很難表達(dá)大量可溶性蛋白E.coli表達(dá)體系的不足117我的課件，講義，多媒體教程外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)1．融合型表達(dá)蛋白所謂融合型表達(dá)是指將外源目的基因與宿主結(jié)構(gòu)基因相拼接構(gòu)建成融合基因進(jìn)行表達(dá)．這樣產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的N末端為宿主基因序列（可以是原核DNA或其它DNA序列）編碼，C末端由外源目的基因編碼。118我的課件，講義，多媒體教程2．非融合型表達(dá)蛋白

是指外源目的基因不與宿主基因融合，直接從起始密碼AUG開始在原核調(diào)控元件控制之下表達(dá)外源基因蛋白質(zhì)。

非融合型表達(dá)的蛋白質(zhì)具有類似天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其生物學(xué)功能也更接近于體內(nèi)的天然蛋白質(zhì)。但其缺點(diǎn)是容易被細(xì)菌蛋白酶降解。119我的課件，講義，多媒體教程3．分泌型表達(dá)蛋白分泌型表達(dá)是利用具有信號肽編碼序列的分泌型表達(dá)載體，將表達(dá)的蛋白質(zhì)由細(xì)胞質(zhì)跨膜分泌到細(xì)胞基質(zhì)或細(xì)胞周質(zhì)中。120我的課件，講義，多媒體教程

◆強(qiáng)啟動子及其調(diào)控序列、

◆SD序列

◆SD序列下游攜帶有一段信號肽序列。常用的信號肽有OmpA、PelB、PhoA和Hly等。分泌型表達(dá)載體組成:需注意是，不同蛋白質(zhì)的分泌需要不同的信號肽，121我的課件，講義，多媒體教程大鼠胰島素原cDNA的表達(dá)和分泌 目錄122我的課件，講義，多媒體教程123我的課件，講義，多媒體教程外源基因在真核表達(dá)124我的課件，講義，多媒體教程克隆基因含有:原核克隆載體的復(fù)制子

抗性篩選基因

限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)序列，

真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體大多是穿梭載體.125我的課件，講義，多媒體教程

表達(dá)基因

真核細(xì)胞的啟動子、增強(qiáng)子、剪接信號、轉(zhuǎn)錄終止信號PolyA化信號遺傳選擇標(biāo)記等組件，126我的課件，講義，多媒體教程真核表達(dá)體系：酵母、昆蟲、乳類動物細(xì)胞真核表達(dá)體系優(yōu)點(diǎn)：

◆可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當(dāng)修飾,表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累．127我的課件，講義，多媒體教程◆真核細(xì)胞具有翻譯后加工系統(tǒng)，可進(jìn)行糖基化、磷酸化、乙?；刃揎?，使表達(dá)蛋白形成正確的天然構(gòu)象，具有完整的生物學(xué)活性?！裟承┱婧思?xì)胞可將外源基因表達(dá)產(chǎn)物直接分泌至細(xì)胞培養(yǎng)基中，簡化了分離純化的操作。128我的課件，講義，多媒體教程真核表達(dá)體系缺點(diǎn)：操作技術(shù)難費(fèi)時經(jīng)濟(jì)129我的課件，講義，多媒體教程目錄130我的課件，講義，多媒體教程表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞方法