炎癥性腸病與腸道淋巴細胞歸巢研究進展

炎癥性腸病與腸道淋巴細胞歸巢研究進展

0腸道細胞回復(fù)突變試驗20世紀60年代，桂克斯和keel從正常大鼠的輸出淋巴管中分離淋巴結(jié)，注入受體動物的血循環(huán)，然后通過光線成像和輻射自變成像來觀察這些細胞的分布。觀察到，這些細胞的分布在全身的二級淋巴結(jié)組織中，激活的免疫母細胞選擇性地轉(zhuǎn)移到粘膜部位。受實驗啟發(fā)，許多科學(xué)家進行了一系列生物研究。這些實驗為i級細胞疾病的形成和回歸奠定了基礎(chǔ)?，F(xiàn)在，已經(jīng)證明，炎癥（ibd）的發(fā)生與易感細胞的異常免疫反應(yīng)有關(guān)。雙殼類動物（lh）作為免疫反應(yīng)的一個重要組成部分，在預(yù)防和復(fù)發(fā)缺陷疾病方面發(fā)揮著重要作用。1lh.lh的分子基礎(chǔ)成熟淋巴細胞離開中樞免疫器官后,經(jīng)血液循環(huán)趨向性遷移并定居于外周免疫器官或組織特定區(qū)域,稱為LH.LH的分子基礎(chǔ)是淋巴細胞與內(nèi)皮細胞黏附分子的相互作用.介導(dǎo)LH的黏附分子稱為淋巴細胞歸巢受體(lymphocytehomingreceptor),其相應(yīng)配體為血管地址素(vscularaddressin),主要表達于血管內(nèi)皮細胞表面.2趨化因子的激活淋巴細胞從循環(huán)募集到目標組織是一個高度調(diào)節(jié)的過程,依賴一系列黏附分子的相繼作用.需經(jīng)歷貼壁,滾動(rolling);趨化因子對整合素的激活(activing);整合素介導(dǎo)的淋巴細胞牢固黏附(adhereing);淋巴細胞于高內(nèi)皮靜脈(highendothelialvenules,HEV)內(nèi)皮細胞間隙的游出該過程涉及到一系列歸巢受體、地址素及趨化因子的級聯(lián)作用.各亞群的具體歸巢步驟有所不同.2.2地址素2.3尋求因素3炎癥性腸病中淋巴結(jié)回歸3.1巴基斯坦3.1.1th1型免疫反應(yīng)大量的實驗性結(jié)腸炎模型都表現(xiàn)為Th型炎癥,其炎癥特征在肉眼和光鏡水平下均和CD相似.研究的較多的有三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonicacid,TNBS)結(jié)腸炎和IL-10基因敲除小鼠發(fā)生的結(jié)腸炎.IL-10是Th2型反應(yīng)的促進因子,Th1型反應(yīng)的抑制因子.通過動物試驗技術(shù)把編碼IL-10的基因敲除后,小鼠可自發(fā)腸道炎癥,病變以直腸和結(jié)腸為主,病理學(xué)特征與人類CD十分相似,炎癥部位T浸潤分泌高水平IFN-γ和TNF-α,表現(xiàn)為顯著的Th1型免疫反應(yīng).IFN-γ是Thl型炎癥的關(guān)鍵因子,其產(chǎn)生過度主要與兩個分子有關(guān),一個為T-bet,另一個為STAT4(signaltransducerandactivatoroftranscription4).Furutaetal比較同一遺傳背景下T-bet(-/-)、STAT4(-/-)及T-bet(-/-)和STAT4(-/-)小鼠發(fā)現(xiàn),單獨敲除T-bet或STAT4基因,Th1型反應(yīng)均顯著降低,若同時敲除兩基因,則幾乎檢測不到Th1型反應(yīng).Thieuetal發(fā)現(xiàn)T-bet促進Th1型分化,需要STAT4的參與.有學(xué)者報道CD患者表達特征性受體IL-12Rβ2的Th1細胞數(shù)量顯著增加,炎癥組織中的T細胞的核提取物中的STAT4和T-bet含量也顯著增加.從目前資料來看,UC類似于一種緩和的Th2型免疫反應(yīng),Th2介導(dǎo)的B細胞激活的證據(jù)是自身抗體的出現(xiàn),包括核旁型抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體(perinuclearantineutrophicytoplasmaticantibodies,pANCA)和抗IgG1、IgG4亞類抗體.最近有研究發(fā)現(xiàn),IL-13在UC的發(fā)病中起重要作用,可影響腸道上皮細胞的緊密連接、凋亡和再生.3.1.2t細胞在各組小鼠腸道炎中的表達不同于CD4+T細胞促炎作用,γδT細胞在IBD的發(fā)生和發(fā)展過程中起保護調(diào)節(jié)作用,其一般均為CD8αα+.Inagaki-Oharaetal報道γδT基因敲除小鼠能自發(fā)結(jié)腸炎,其幼鼠表顯出對TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的高度敏感性.Hoffmannetal把提取自野生型或IL-10轉(zhuǎn)基因小鼠的γδT細胞,預(yù)防性轉(zhuǎn)移至同類系TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠,發(fā)現(xiàn)TNBS小鼠腸道和脾臟淋巴細胞分泌TNF-α減少,IL-10和TGF-β增加,從而使小鼠生存時間延長,組織損傷減輕.Kühletal研究了在多種IBD動物模型中刪除或敲除γδT,發(fā)現(xiàn)早期干預(yù)使黏膜固有層中淋巴細胞及脾細胞IFN-γ分泌增加,提示γδT細胞在腸道炎癥的早期發(fā)揮重要作用,可能的機制是影響IFN-γ分泌和上皮細胞再生.另有研究表明γδT細胞是細胞因子Th17的重要來源,有細菌感染時,可快速誘導(dǎo)Th17型反應(yīng),保護腸黏膜.3.2相關(guān)分子與lh相關(guān)3.2.1發(fā)揮整合素和madcam-1表達Souzaetal以激惹性腸炎為對照組,通過內(nèi)窺鏡及經(jīng)口空腸活檢取得CD和UC患者的結(jié)腸和空腸標本后,做免疫組織染色并用計算機軟件分析圖像,發(fā)現(xiàn)IBD患者α4β7整合素和MAdCAM-1表達水平顯著增加;日本學(xué)者Arihiroetal等收集CD(40例)和UC(24例)手術(shù)切除標本作冰凍切片,用免疫組化技術(shù)分析也發(fā)現(xiàn)CD和UC炎癥部位的黏膜中MAdCAM-1陽性血管含量增加.3.2.2icam-13.2.3尋求性因素3.3樹突狀細胞3.4IBD中的白細胞募集4影響因素：lh在intd中多種因素可通過作用于歸巢受體、地址素等黏附分子的表達,從而影響腸道淋巴細胞的歸巢進而影響IBD的病理和轉(zhuǎn)歸.4.1一些酶活性物質(zhì)4.2細胞因子4.3維生素d的衍生物4.4微生態(tài)制劑4.5超氧化物誘導(dǎo)酶5抗il-12和抗il-6治療從CD的炎癥環(huán)境可知針對Th1的細胞因子的抑制治療是有益的.抗TNF的單抗英夫利昔(infliximab)在兩個關(guān)鍵的臨床實驗中,已證明對CD患者有效并被美國FDA批準應(yīng)用于臨床然而抗TNF-α的治療在UC中療效較差,這進一步突出了理解UC和CD之間不同的免疫病理機制的重要性.其他一些作用于TNF的藥物如CDP571、依那西普(etanercept)也在臨床評估中其中CDP571對CD的效果與英夫利昔相似,而依那西普在CD中的療效有限.相似的,人們正滿懷希望的探討抗IL-12和抗IL-6治療.IL-11是一種能增強腸上皮屏障功能且能抑制炎癥細胞因子分泌的白介素,但其作用仍在臨床評估中.抑制擁有CD和UC特征的破壞性免疫細胞的流入,為IBD的治療提供了另外的一個途徑因為淋巴細胞募集是一個高度調(diào)節(jié)的過程,所以潛在的可設(shè)計出有高度選擇性的抗炎治療方案.α4β7/MAdCAM-1和CCR9/CC25可作為小腸中CD的選擇性靶點,而對于UC可能需要更多的途徑.Alicaforsen(ISIS2302)是一種能抑制ICAM-1反義核苷酸,已證明在公開標簽的研究中對UC有效,α4β7的抑制物(MLN02Millennium)和CCR9的抑制物(Traficet-ENChemocentryx)對CD的作用也在評估中.這些藥物的應(yīng)用不僅有益于IBD患者,也有益于正罹患原發(fā)性硬化性膽管炎等腸外疾病的患者.6干預(yù)淋巴細胞歸巢腸道LH是多種黏附分子參與、多步驟的反應(yīng)過程,其對腸免疫屏障的平衡有重要意義,并且是IBD重要發(fā)病機制之一.因此通過干預(yù)淋巴細胞歸巢為該類疾病提供了新的治療途徑.相信隨著分子生物學(xué)和臨床藥理學(xué)研究的進展,必將推進這一重要領(lǐng)域的深入研究.2.1cdeb基因t、cd3和cd87細胞因子檢測主要包括選擇素家族的L-選擇素、整合素家族的α4β7和淋巴細胞功能相關(guān)抗原LFA-1(αLβ2)等.其與相對應(yīng)的地址素相互識別、相互作用可介導(dǎo)淋巴細胞與內(nèi)皮細胞間的黏附和游出過程.L-選擇素、α4β7和LFA-1的配體(地址素)分別為黏膜地址素細胞黏附分子-1(mucosaladdressincelladhesionmolecule-1,MAdCAM-1)和細胞間黏附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1)/血管細胞黏附分子-1(vascularadhesionmolecule-l,VCAM-l),均屬于免疫球蛋白超家族(immunoglobulinsuperfamily,IgSF),具有與Ig相似的結(jié)構(gòu)特征.外周淋巴結(jié)地址素(peripherallymphnodeaddressin,PNAd)是一種特殊形式的MAdCAM-1,即為碳水化合物抗原決定簇修飾的MAdCAM-1.趨化性細胞因子是一個蛋白質(zhì)家族,分子質(zhì)量多為8-10kDa.與淋巴細胞歸巢相關(guān)的趨化性細胞因子很多[14,15,16,17,18,19],按半胱氨酸的位置、排列方式和位置可分為四個亞家族,其中最具代表性的是CCR9.CCR9和整合素α4β7聯(lián)合表達于歸巢至腸道的淋巴細胞,選擇性運輸至小腸.通過活體顯微鏡檢查能直觀的觀察到在正常和TNF-α刺激條件下淋巴細胞依賴CCR9/CCL25黏附于鼠小腸內(nèi)皮.有研究表明IBD中炎癥浸潤部位的腸黏膜中T、B細胞總數(shù)量增加,各具體亞群有增有減.SAMP1/Yit小鼠能自發(fā)性發(fā)生回腸炎癥,是研究IBD的重要動物模型.Matsuzakietal用熒光標記T細胞,再從尾靜脈注入受體小鼠,并用活體顯微鏡監(jiān)測派伊爾淋巴結(jié)(peyerpatches,PP)毛細血管后微靜脈、黏膜下層微血管和末端回腸絨毛毛細血管內(nèi)的T細胞歸巢,發(fā)現(xiàn)與AKR/J小鼠和15wk齡的SAMP1/Yit小鼠相比,35wk的SAMP1/Yit的小鼠HEV內(nèi)T淋巴細胞歸巢明顯增強,免疫組化技術(shù)證實CD4、CD8和β7整合素陽性的細胞浸潤增加.與此相似,Teramotoetal把從脾臟提取的T和B淋巴細胞用熒光標記后注入受體小鼠,再用右旋葡聚糖硫酸鈉(dextransulfatesodium,DSS)誘導(dǎo)結(jié)腸炎活體顯微鏡觀察提示受體結(jié)腸黏膜及黏膜下層內(nèi)T和B淋巴細胞的黏附均顯著增強.諸多文獻認為,LH增多是腸道淋巴細胞數(shù)目增加的重要機制之一.CD和UC中CD4+T細胞歸巢顯著增加,其中CD以分泌IFN-γ和IL-2的Th1型細胞為主,而UC以非典型的Th2型細胞占優(yōu)勢,其分泌TGF-β和IL-5而不分泌IL-4.IBD的發(fā)生發(fā)展與上皮內(nèi)淋巴細胞含量也密切相關(guān).外周血及腸黏膜固有層以CD4+T細胞占優(yōu)勢,而上皮內(nèi)淋巴細胞(intraepitheliallymphocytes,IELs)90%以上是CD3+的T細胞,其中主要是CD8+T細胞,而CD4+T細胞極少.腸黏膜固有層中一部分CD8+T淋巴細胞可遷移至絨毛頂部附近形成IELs.CD8+TIEL群包括CD8αα和CD8αβT細胞,可表達γδ或αβ受體.Nataschaetal報道CD患者腸上皮內(nèi)淋巴細胞對上皮來源的靶細胞的細胞溶解活動明顯加強,CD8+IEL較正常人明顯升高;CD患者T細胞表型和功能上的改變只限于腸黏膜的淋巴細胞,而血液中T細胞的功能沒有變化,IEL對腸組織的細胞溶解活動明顯加強.IBD中LH顯著增強,淋巴細胞及上皮細胞表面歸巢相關(guān)分子表達也伴隨增加,其中最重要的是α4β7/MAdCAM-1分子.多種IBD動物模型中均能檢測到顯著增加的MAdCAM-1蛋白.近年來開發(fā)出一種可增強超聲成像的膠囊,其內(nèi)含有可與MAdCAM-1特異結(jié)合的微氣泡(microbubbles,MB).Bachmannetal給SAMP1/Yit結(jié)腸炎小鼠服用此種膠囊后作腹部超聲,發(fā)現(xiàn)MB可聚集于腸道炎癥部位,產(chǎn)生顯著增強的回聲.CD和UC患者炎癥部位的腸黏膜中都含大量的MAdCAM-1陽性的的血管,并且在炎癥部位的潰瘍底部E-選擇素表達相似,但前者潰瘍底部MAdCAM-1陽性的的血管明顯比后者豐富.MAdCAM-1陽性的的血管在腸道深層表達,主要在集合淋巴結(jié),是CD的特征之一.MAdCAM-1在CD中的廣泛表達可導(dǎo)致腸道透壁性炎癥.在UC急性期,內(nèi)皮細胞表達ICAM-1也明顯增加,同時伴有其配體LFA-1表達增加,提示其在炎性細胞進入病變組織過程中起重要作用.有研究表明嗜酸性粒細胞在結(jié)腸的聚集依賴于β2整合素/ICAM-1而不是α4β7,在ICAM-1-/-的小鼠,嗜酸性粒細胞性的結(jié)腸炎表現(xiàn)明顯緩解.另外,ICAM-1基因的多態(tài)性與IBD的發(fā)病密切相關(guān).CCL25/CCR9是生理條件下調(diào)節(jié)小腸LH的重要趨化因子,隨著CD炎癥進展,CCL25和CCR9在調(diào)節(jié)小腸淋巴細胞歸巢中的顯著作用減弱.針對CCL25和CCR9的靶向治療只有在SAMP1/Yit小鼠模型疾病的早期有效,提示在疾病后期非特異的炎癥信號起主要作用.在CD的炎癥部位趨化因子Fractalkine(CX3CL1)表達增加,其兩種同質(zhì)異型配體之一的T280M能影響克羅恩病的臨床表現(xiàn)和發(fā)病部位.(dendriticcells,DC)與LH生理和炎癥狀態(tài)下的LH都與DC細胞密切相關(guān),DC和T細胞的相互作用參與IBD的發(fā)病過程.Drakesetal通過輸入CD45RBhiCD4+T細胞至重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠建立結(jié)腸炎模型,分離結(jié)腸的DC細胞與同系基因型、同種異體基因型脾臟CD4+T細胞和自體結(jié)腸分離T細胞的免疫反應(yīng),發(fā)現(xiàn)結(jié)腸DC與自體固有層的T細胞共同培養(yǎng)時所產(chǎn)生的IFN-γ和IL-6數(shù)量顯著高于與同系基因或同種異體基因型脾臟T細胞共同培養(yǎng)的含量.Hartetal用多色流式細胞計量術(shù)分析IBD患者黏膜固有層中DC細胞表面分子,并用胞內(nèi)染色分析DC在無外源性刺激下產(chǎn)生的細胞因子,發(fā)現(xiàn)IBD時,DC細胞激活,表面微生物識別受體上調(diào)并產(chǎn)生更多的促炎細胞因子.與此相對應(yīng),Baumgartetal研究了活動性和非活動性IBD患者及其正常人類漿DC(PDC)和髓系DC(MDC),觀察到IBD急性期外周血中未成熟的DC細胞顯著減少,緩解期IBD患者PDC和MDC數(shù)量與正常對照組基本接近.雖然CD和UC的發(fā)病機制和臨床表現(xiàn)不全相同,但他們都有大量免疫細胞浸潤腸道.在IBD中促炎癥細胞因子的上調(diào)可導(dǎo)致血管黏附分子的表達增加,使炎癥細胞持續(xù)浸潤.與黏膜血管上的MAdCAM-1表達增加相對應(yīng),IBD患者中的炎癥細胞可通過腸道特異的方式歸巢至黏膜固有層.一旦炎癥已經(jīng)建立,引導(dǎo)器官特異歸巢到組織的信號的作用往往不及一般性的炎癥相關(guān)過程所起的作用.對腸道共棲菌的免疫失調(diào),過多的TLR配體和促炎細胞因子的持續(xù)過分泌能激活上皮和內(nèi)皮細胞,因此能促進白細胞募集至腸黏膜間隙.激活的中性粒細胞能產(chǎn)生大量的超氧陰離子和活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS),這些分子具有很高的反應(yīng)性,可以與細菌的細胞膜、核酸分子及蛋白質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng),造成微生物的損傷和死亡.此外,ROS還可上調(diào)一些細胞因子及黏附分子如TNF-α、IL-1、ICAM-1的表達水平,放大炎癥效應(yīng).Yousefietal最近發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細胞一種全新的呼吸爆發(fā)機制.嗜酸性粒細胞生理條件下在嗜酸細胞活化趨化因子的作用下在腸道黏膜固有層中維持較高基線水平.在IBD的炎癥部位內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)、C5a等可與IL-5發(fā)揮協(xié)同作用,觸發(fā)嗜酸性粒細胞瞬時彈射出線粒體DNA和陽離子蛋白,在胞外形成黏性網(wǎng)絡(luò)捕獲并在胞外殺滅細菌,同時造成自身組織損傷.N-乙酰葡糖胺-6-磺化酶對L-選擇素的配體活力是必須的,前者又被表達于高內(nèi)皮靜脈的N-乙酰葡萄糖胺-6-O-硫基轉(zhuǎn)移酶(N-acetylglucosamine-6-O-sulfotransferase-1,GIcNAc6ST-1)催化,一旦缺乏,L-選擇素的配體嚴重受損.在UC的急性期能誘導(dǎo)HEV樣血管表達PNAd,這與編碼GIcNAc6ST-1的基因轉(zhuǎn)錄增加相關(guān),他能指導(dǎo)MECA-79表位的表達,提示通過為循環(huán)中的T細胞提供額外的黏附位置,GIcNAc6ST-1在UC的發(fā)病中起一定的作用.亦有研究指出表達于HEV的唾液酸蛋白,當(dāng)其被一系列轉(zhuǎn)糖酶和轉(zhuǎn)磺酶作用后,才能夠作為L-選擇素的配體.報道的最多的是TNF-α細胞因子,Andoetal研究用TNF-α刺激一種新的結(jié)腸上皮細胞株MJC-1,發(fā)現(xiàn)24h內(nèi)MAdCAM-1的表達量明顯增加,并與TNF-α呈劑量依賴性同時淋巴細胞的黏附增加了2-6倍,其可運用MAdCAM-1抗體來抑制.誘導(dǎo)MAdCAM-1表達增加的信號通路包括:蛋白激酶C、酪氨酸