uplc串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定11種磺胺類(lèi)化合物

uplc串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定11種磺胺類(lèi)化合物

磺胺類(lèi)藥物可以抑制大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌以及某些革蘭氏陰性菌。它可以預(yù)防和治療食物中的動(dòng)物疾病，如防止和治療食物中的細(xì)菌、以便避免、傷寒、白便、球蟲(chóng)病、傳染性胃炎和其他疾病。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，它可以用于控制腸排便和傷口的形成。此外,磺胺類(lèi)藥物還用作飼料添加劑,促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng),提高動(dòng)物抗病能力,提高畜禽產(chǎn)量,通過(guò)食物鏈人食用后對(duì)人體產(chǎn)生耐藥性,機(jī)體免疫力下降等副作用。歐盟、美國(guó)及我國(guó)鮮、凍禽產(chǎn)品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB16869-2000)規(guī)定磺胺類(lèi)化合物≦0.1mg/kg,隨著家禽養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)業(yè)化不斷擴(kuò)大,添加藥物的不規(guī)范的增加,必須有相應(yīng)的簡(jiǎn)便易行的技術(shù)方法進(jìn)行日常監(jiān)控。現(xiàn)行的磺胺類(lèi)抗生素的檢測(cè)方法主要有:分光光度法、電化學(xué)法、薄層掃描、酶聯(lián)免疫、放射免疫和HPLC法,液質(zhì)聯(lián)用已成為當(dāng)下復(fù)雜基質(zhì)下同時(shí)定量和定性測(cè)定多種藥殘的強(qiáng)有力的工具。超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用不僅能大大縮短分析時(shí)間,提高分析效率,大大提高靈敏度和減少了溶劑消耗且能同時(shí)定性和定量。本文建立了利用反相與陽(yáng)離子交換的混和機(jī)制,采用WatersOasisMCX固相萃取小柱同超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用,同時(shí)檢測(cè)中11種磺胺類(lèi)化合物殘留(即磺胺、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺多辛、磺胺甲二唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯達(dá)嗪、磺胺二甲異惡唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉)的方法,效果令人滿(mǎn)意。1.1電噴霧質(zhì)譜條件WatersAcquityUltraPerformanceLC超高效液相色譜儀,WatersXevo三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源(ESI)和Masslynx4.1質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司);AE260電子天平(瑞士MettlerToledo公司產(chǎn)品);ASPECXli全自動(dòng)固相萃取儀(美國(guó)吉爾森公司)和ALLTECH手動(dòng)固相萃取儀(美國(guó)Agilent公司);高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司);渦旋儀(美國(guó)VORTEX);組織勻漿機(jī)(國(guó)產(chǎn));真空泵(國(guó)產(chǎn));吹氮儀(國(guó)產(chǎn))1.2磺胺類(lèi)化合物11種磺胺類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品:磺胺(sulfanilamide)、磺胺噻唑(sulfathiazole)、磺胺吡啶(sulfapyridine)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine)、磺胺多辛(sulfadoxine)、磺胺甲二唑(sulfamethizol)、磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine)、磺胺氯達(dá)嗪(sulfachloropyridazine)、磺胺二甲異惡唑(sulfisoxazole)、磺胺二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine)、磺胺喹惡啉(sulfachinoxaline)(Dr.Ehrenstorfer公司,純度均大于95%),超純水(Millipore純水機(jī)制),乙腈(色譜純,美國(guó)Merck公司),乙酸(色譜純,美國(guó)Sigma公司),乙酸銨(AR,國(guó)產(chǎn)),氨水(AR,國(guó)產(chǎn)),WatersOasisMCX(3cc,60mg)固相萃取小柱,0.20μm的過(guò)濾膜?；前奉?lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100mg/L):準(zhǔn)確稱(chēng)取0.0100g磺胺類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈溶解并定容至100ml的棕色容量瓶中,-18℃冷凍保存?；前奉?lèi)化合物混標(biāo)調(diào)諧液濃度(1mg/L):分別吸取1ml各種標(biāo)準(zhǔn)貯備液置于100ml棕色容量瓶中,加乙腈定容至刻度,搖勻,保存在4℃冰箱中。標(biāo)準(zhǔn)工作液(2μg/L,10μg/L,50μg/L,100μg/L,200μg/L):分別在1.0ml,1.0ml,1.0ml,0.9ml,0.8ml空白樣品基質(zhì)加入2μl,10μl,50μl,100μl,200μl標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1mg/L)配成不同濃度系列的混和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,用0.2%乙酸水溶液-乙腈(20∶80v/v)定容(臨用時(shí)配制)。1.3進(jìn)樣量、柱溫色譜柱:WatersAcquityUPLCTMBEHC18柱(1.7μm,2.1mm×50mm);流動(dòng)相:0.2%乙酸水溶液∶乙腈=80∶20,流速:0.3ml/min,進(jìn)樣量:10μl。柱溫:40℃。(1)UPLC-MS/MS的質(zhì)譜條件電離方式:電噴霧電離(ESI);毛細(xì)管電壓:3.0KV;脫溶劑溫度:350℃;脫溶劑氣流量(氮?dú)?:700L/h;碰撞氣流量(氬氣):0.18L/h;錐孔氣流(氮?dú)?:50L/h。掃描方式:正離子掃描;監(jiān)測(cè)模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式,各種磺胺的采集參數(shù)見(jiàn)表1。1.4樣品的制備1.4.1樣品提取2.1提取劑為有機(jī)溶劑由于磺胺類(lèi)藥物難溶于水,較易溶于稀酸、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷和三氯甲烷等等有機(jī)溶劑。由于直接用乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷等提取液脂肪含量較高,不利于凈化處理,提取效率較低,所以選擇乙腈為提取劑?；前奉?lèi)藥物屬弱堿性物質(zhì),因此選擇混和型陽(yáng)離子交換的MCX固相萃取小柱,且洗脫液選擇堿性乙腈溶液較乙腈更易洗脫。2.2色譜檢測(cè)條件磺胺類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)中帶有氨基,呈弱堿性,在流動(dòng)相中加入一定比例的酸性溶液,磺胺類(lèi)化合物在流動(dòng)相中呈離子形式存在,離子化效率提升。蠕動(dòng)泵進(jìn)樣時(shí)在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描,確定各種磺胺藥物的準(zhǔn)分子離子,然后以準(zhǔn)分子離子為母離子,對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描,獲得二級(jí)質(zhì)譜響應(yīng)較強(qiáng)的子離子,最后以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行采集?；前奉?lèi)藥物在ESI(+)電離模式下,[M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰,經(jīng)離子源離子化后,斷裂成多個(gè)特征離子,由表1可見(jiàn)有m/z92、m/z108、m/z113、m/z156、m/z185等。[M+H]+的準(zhǔn)分子離子斷裂形成[M-R2NH2]+、[M-R2NH2-SO]+、[M-R2NH2-SO2]+、[R2NH3]+、[M+H-H2SO2]+、[R2NHSO2]+等碎片離子。由于同時(shí)監(jiān)測(cè)的離子數(shù)較多有24個(gè),本研究選擇的色譜峰采集點(diǎn)為15個(gè),駐留時(shí)間為0.04s,否則會(huì)造成峰型不尖,峰型較差。定性與定量該方法定性滿(mǎn)足4個(gè)條件:1.空白試驗(yàn)無(wú)干擾離子峰;2.特征離子色譜峰信噪比(S/N)都在3;1以上;3.試樣色譜峰保留時(shí)問(wèn)應(yīng)與校正溶液一致,容許偏差為±2.5%;4.檢測(cè)到的離子豐度比應(yīng)與校正溶液一致,容許偏差達(dá)到歐盟2002/657/EC中的規(guī)定。定量時(shí)以響應(yīng)強(qiáng)度最強(qiáng)離子對(duì)進(jìn)行計(jì)算。2.3方法的線(xiàn)性范圍在空白牛肉樣品基質(zhì)分別加入2μl,10μl,50μl,100μl,200μl標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1mg/L)配成(2μg/L,10μg/L,50μg/L,100μg/L,200μg/L)不同濃度系列的混和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,用0.2%乙酸水溶液-乙腈(20∶80v/v)定容(現(xiàn)用現(xiàn)配),進(jìn)樣10μl進(jìn)行UPLC-MS/MS分析,以測(cè)得峰面積對(duì)濃度作校正曲線(xiàn),相關(guān)線(xiàn)性系數(shù)均大于0.998,表明在2μg/L~200μg/L濃度范圍呈線(xiàn)性關(guān)系,符合定量要求。2.4準(zhǔn)確度與精密度以S/N>10為定量檢測(cè)下限,乘以方法的濃縮倍數(shù)為方法定量檢測(cè)下限,各化合物數(shù)值見(jiàn)表2;在空白牛肉樣品中添加濃度為5μg/kg,20μg/kg,100μg/kg的11種磺胺類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液,方法回收率在68.3%~108%范圍?？瞻准訕?biāo)樣品經(jīng)前處理后上樣,連續(xù)7次進(jìn)樣進(jìn)行精密度試驗(yàn),相對(duì)偏差均小于10%,滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。內(nèi)臟、蛋、奶等的回收率也符合要求。2.5磺胺類(lèi)藥殘此UPLC-MS/MS檢測(cè)器在2.5min之內(nèi)完成了測(cè)定11種磺胺類(lèi)藥殘,較PDA檢測(cè)器有更低的檢出限和抗干擾能力,前處理操作快速簡(jiǎn)單,可重復(fù)性好,可滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)外對(duì)動(dòng)物源性食品中磺胺類(lèi)化合物的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)要求,適合大量樣品的篩查、準(zhǔn)確定量和定性分析。1材料和方法2提取液的制備將組織充分絞碎混均后,取5.00g樣品于50ml離心管中,用移液器加入20ml乙腈,均質(zhì)器均質(zhì)3min,5000r/min離心5min,將上層轉(zhuǎn)移至離心管中,殘?jiān)儆?0ml乙腈重復(fù)提取1次