FD工藝對(duì)醬香型白酒堆積過程的影響

“FD工藝”對(duì)醬香型白酒堆積過程的影響

梁濼，范宏筠，稅梁揚(yáng)，張煜亮，周帥，李麗，馮治平,（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓644000；2.瀘州國(guó)之榮耀酒業(yè)有限公司，四川瀘州646000）醬香型白酒的工藝總結(jié)為“端午制曲，重陽下沙，一年一個(gè)生產(chǎn)周期，兩次投糧，九次蒸煮，八次發(fā)酵，七次取酒”[1]，具有“高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、儲(chǔ)存周期長(zhǎng)”四高兩長(zhǎng)的工藝特點(diǎn)[2]。醬香型白酒具有“醬香典型，細(xì)膩醇厚，空杯留香持久”的風(fēng)味特征，深受消費(fèi)者喜愛[3]。堆積發(fā)酵是醬香型白酒獨(dú)有的生產(chǎn)工藝，堆積發(fā)酵過程是一個(gè)開放式過程，主要作用是富集周圍環(huán)境微生物進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)生多種酶類并在多種酶類相互作用下合成酒體前驅(qū)物質(zhì)及香味物質(zhì)，為后續(xù)窖內(nèi)發(fā)酵工藝提供重要微生物和酶類[4]。酒醅中醬香香氣成分和風(fēng)味物質(zhì)前體來源于堆積發(fā)酵，這一過程被描述為“二次制曲”[4-5]，在高溫條件下促成酯類等物質(zhì)合成，產(chǎn)生典型的醬香香氣[6]。因此，高溫堆積過程對(duì)醬香型白酒的品質(zhì)會(huì)帶來深遠(yuǎn)的影響[6]。有報(bào)道稱，沒有堆積就沒有醬酒，沒有堆積更談不上醬香風(fēng)格，說明高溫堆積是醬香型白酒的重要工序[7]。傳統(tǒng)醬香型白酒堆積時(shí)間4～5d，當(dāng)堆積酒醅溫度達(dá)到46～52℃，微生物繁殖旺盛，再移至窖內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵，保證發(fā)酵的正常進(jìn)行。隨著白酒釀造機(jī)械化進(jìn)程的逐步推進(jìn)，醬香型白酒機(jī)械化釀造過程中，機(jī)械設(shè)備對(duì)酒醅的物理特征的影響，加之氣溫較低的冬季環(huán)境下，其酒醅在堆積發(fā)酵環(huán)節(jié)易出現(xiàn)堆積酒醅升溫不均勻和升溫緩慢的問題。但是，溫度直接影響酒醅微生物生長(zhǎng)繁殖而影響各位點(diǎn)酒醅發(fā)酵狀態(tài)，升溫不均和升溫緩慢則會(huì)導(dǎo)致酒醅發(fā)酵不徹底，影響酒質(zhì)及產(chǎn)量。針對(duì)以上生產(chǎn)問題，對(duì)傳統(tǒng)堆積模式進(jìn)行改良，形成“FD工藝”，即當(dāng)?shù)谝淮尉契逊e發(fā)酵溫度達(dá)到43～45℃時(shí)，使用布氏抱斗對(duì)酒醅堆進(jìn)行破堆、混勻、換位后，再進(jìn)行收堆；使用布氏抱斗將堆子從頂部挖開，將頂部酒醅轉(zhuǎn)移至旁邊空地，并充分混勻頂部酒醅后形成底層酒醅，再將四周酒醅破堆，以同樣的方式進(jìn)行混勻后移至堆心層，將堆心層移至堆外層，遵循“面翻底，底翻面，中心翻四周”的原則，使各方位酒醅充分混勻后進(jìn)行收堆再次堆積發(fā)酵至入池標(biāo)準(zhǔn)溫度46～52℃時(shí)，即完成整個(gè)堆積發(fā)酵過程，可入池發(fā)酵。高通量測(cè)序技術(shù)又稱第二代測(cè)序技術(shù)，它可以同時(shí)對(duì)數(shù)百萬到10億個(gè)DNA分子進(jìn)行并列測(cè)序，同時(shí)滿足多樣本微生物的深度分析，其主要特點(diǎn)是高通量、快速、高精度、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、數(shù)據(jù)信息量大等，可在極短時(shí)間內(nèi)獲得大量數(shù)據(jù)[8-9]。目前，高通量測(cè)序技術(shù)已被用于研究不同發(fā)酵食品中的微生物生態(tài)，如醋[10]和牛奶[11]，以及濃香、清香型、醬香型白酒中[12]。郭敏等[12]證實(shí)了高通量測(cè)序技術(shù)可用于醬香型白酒釀造發(fā)酵過程酒醅微生物多樣性的研究?；诖?，本文運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)醬香型白酒堆積發(fā)酵過程中酒醅進(jìn)行測(cè)序，分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，以明確“FD工藝”對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。較之傳統(tǒng)堆積發(fā)酵工藝而言，“FD工藝”對(duì)堆積酒醅進(jìn)行破堆、混勻、換位，重新引入微生物生長(zhǎng)繁殖所需氧氣，改善酒醅體系的溶氧水平，促使酒醅體系的微生物再次進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，優(yōu)化和豐富酒醅體系的微生物群落結(jié)構(gòu)，提升微生物的種類和數(shù)量，可使整個(gè)酒醅堆積溫度均勻升高，降低酒醅堆不同空間區(qū)位的品溫差異，從而改善酒醅的各項(xiàng)理化指標(biāo)，促使整個(gè)堆積酒醅的均勻發(fā)酵，為醬香型白酒的發(fā)酵生香奠定基礎(chǔ)。本研究以冬季的醬香型白酒第二輪次堆積發(fā)酵酒醅為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)分析堆積酒醅細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)合酒醅理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，初步探究“FD工藝”對(duì)醬香型白酒堆積細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，以及對(duì)酒醅在整個(gè)堆積階段的發(fā)酵狀態(tài)的影響，為“FD工藝”在醬香型白酒堆積過程的應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1材料與儀器醬香型白酒酒醅來源于瀘州國(guó)之榮耀酒業(yè)有限公司；E.Z.N.A.?SoilDNAKitDNA抽提試劑盒美國(guó)Omega公司；酚酞、硫酸銅、鹽酸、酒石酸鉀鈉成都市科隆化學(xué)品有限公司；氫氧化鈉重慶川東化工有限公司；次甲基蘭來自于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；葡萄糖天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；FastPfu聚合酶北京全式金生物技術(shù)有限公司；所用試劑均為分析純。DHG-9023A電熱干燥箱上?，槡瀸?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FA224X電子分析天平天津市德安特傳感技術(shù)有限公司；450mm干燥器；WST數(shù)顯溫度計(jì)上海儀電科學(xué)儀器有限公司；ABIGeneAmp?9700型PCR儀美國(guó)ABI公司；DYY-6C電泳儀北京六一生物科技有限公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1酒醅取樣方法本研究以冬季的醬香型白酒第二輪次堆積發(fā)酵酒醅為研究對(duì)象，同一車間相鄰兩個(gè)酒醅堆采用不同堆積發(fā)酵工藝。采用“FD工藝”酒醅為實(shí)驗(yàn)組，取樣時(shí)間以收堆完成時(shí)開始計(jì)時(shí)（起始計(jì)為0h），取樣時(shí)間間隔為24h，其中在71h時(shí)堆積酒醅溫度達(dá)到43.4℃，達(dá)到“FD工藝”要求。71～72h進(jìn)行“FD工藝”操作，進(jìn)行再次堆積發(fā)酵至入池溫度48.6℃，整個(gè)堆積發(fā)酵時(shí)間共持續(xù)至96h。取樣時(shí)間編號(hào)F1、F2、F3、F4、F5。傳統(tǒng)堆積發(fā)酵工藝即收堆完成后，經(jīng)過96h自然堆積，酒醅溫度升高至48.1℃，酒醅表層長(zhǎng)滿白色狀菌絲，醅料中富集了大量微生物，并形成一定的醬香香氣成分或風(fēng)味前驅(qū)物，即完成整個(gè)堆積發(fā)酵。傳統(tǒng)堆積發(fā)酵酒醅為對(duì)照組，同理取樣時(shí)間依次編號(hào)為C1、C2、C3、C4、C5。取樣點(diǎn)如圖1所示，分別取堆子上層A點(diǎn)，中層B、C兩點(diǎn)，下層D、E兩點(diǎn)，取樣后各層樣品混勻再將上、中、下3個(gè)樣品混合為1個(gè)樣品，取樣后迅速置于-80℃冰箱中保藏用于開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖1堆積酒醅取樣點(diǎn)示意圖Fig.1Schematicdiagramofsamplingpointsforstackingfermentation1.2.2酒醅理化指標(biāo)測(cè)定水分的測(cè)定參考GB5009.3-2016《食品中水分含量測(cè)定》中的直接干燥法進(jìn)行測(cè)定。酒醅淀粉、酸度、還原糖含量的測(cè)定參考《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書》[13]。1.2.3溫度的測(cè)定使用數(shù)顯溫度計(jì)對(duì)堆子各采樣點(diǎn)進(jìn)行溫度實(shí)時(shí)測(cè)定，測(cè)溫記錄點(diǎn)與采樣時(shí)間保持一致，同一位點(diǎn)進(jìn)行三次溫度測(cè)定，取其平均值。1.2.4細(xì)菌群落分析使用E.Z.N.A.?SoilDNAKitDNA抽提試劑盒提取酒醅細(xì)菌總DNA，引物采用338F（5”-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3”）和806R（5”-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3”）[14]對(duì)細(xì)菌的16SrDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序和后續(xù)分析?；谀J(rèn)參數(shù)，使用Qiime2流程中的DADA2插件對(duì)質(zhì)控拼接之后的優(yōu)化序列進(jìn)行降噪處理。物種注釋數(shù)據(jù)庫：silva138/16s_bacteria，物種注釋方法：bayes分類，置信度0.7，測(cè)序數(shù)據(jù)使用上海美吉生物有限公司的云平臺(tái)（）進(jìn)行在線數(shù)據(jù)分析。1.3數(shù)據(jù)處理采用SPSS26.0軟件進(jìn)行理化指標(biāo)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。使用Origin2019進(jìn)行圖片繪制，數(shù)據(jù)以表格及柱狀圖表示。2結(jié)果與分析2.1兩組堆積酒醅理化指標(biāo)的變化2.1.1堆積階段酒醅水分含量變化水分是醬香型白酒生產(chǎn)過程中控制的關(guān)鍵工藝參數(shù)之一[15]，水分高低是判斷發(fā)酵能否正常進(jìn)行的依據(jù)之一。水分過高會(huì)使酒醅粘度升高，好氧型微生物生長(zhǎng)受到抑制，厭氧型微生物加速繁殖，最終導(dǎo)致發(fā)酵酒醅出現(xiàn)酸敗現(xiàn)象；水分過低則不利于糊化，且影響微生物正常生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致酒質(zhì)受損[16-17]。堆積階段酒醅水分含量變化如圖2所示。圖2堆積過程酒醅水分含量變化Fig.2Changesofwatercontentinfermentedgrainsduringstackingfermentation由圖2中可知，實(shí)驗(yàn)組酒醅水分含量在52.0%～52.8%之間，對(duì)照組酒醅水分含量在51.7%～53.2%。兩組樣品在堆積發(fā)酵0～48h，酒醅水分含量表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，由于堆積溫度處于上升過程，水分蒸發(fā)速度增加，酒醅中的水分處于一個(gè)自然流失狀態(tài)；在堆積發(fā)酵48～71h，隨著堆積時(shí)間的增加，溫度升高，細(xì)菌進(jìn)行大量生長(zhǎng)繁殖代謝和淀粉的降解，產(chǎn)生部分水分，使得酒醅水分含量呈上升趨勢(shì)。在72h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)“FD工藝”后水分含量明顯下降。在72～96h時(shí)，受此時(shí)高溫影響，傳統(tǒng)堆積發(fā)酵酒醅水分含量呈下降趨勢(shì)，而實(shí)驗(yàn)組酒醅經(jīng)“FD工藝”后，大量引入氧氣，微生物又一次富集，微生物再次進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖代謝和淀粉降解，促使酒醅水分含量增加，且使整個(gè)堆積酒醅水分處于相對(duì)平衡狀態(tài)?！癋D工藝”能平衡酒醅堆各位點(diǎn)水分之間的差異，使得水分含量在整個(gè)堆積階段變化幅度較小。整個(gè)發(fā)酵過程與李銀強(qiáng)[17]和印璇等[18]研究結(jié)果基本一致，即醬香型白酒釀造過程中，發(fā)酵酒醅水分含量應(yīng)保持在47%～56%，并且酒醅水分含量對(duì)醬香型白酒的生產(chǎn)有較大影響，應(yīng)該嚴(yán)格控制酒醅水分含量。2.1.2堆積階段酒醅酸度變化酸度是衡量堆積發(fā)酵后酒醅是否進(jìn)入酒窖的主要依據(jù)之一；酸度過高或過低都會(huì)影響酒醅發(fā)酵狀態(tài)，從而影響酒的產(chǎn)量和質(zhì)量。為了保證白酒酒醅的固態(tài)發(fā)酵質(zhì)量，酒醅酸度也是一個(gè)重要的影響因素，適宜的酸度能抑制雜菌的生長(zhǎng)，為其他微生物正常生長(zhǎng)提供良好的環(huán)境，同時(shí)能為各種酯類物質(zhì)的合成提供前體[19]。印璇等[18]跟蹤分析醬香型白酒釀造過程中的各項(xiàng)理化指標(biāo)，認(rèn)為酒醅酸度在1.5～2.2mmol/10g之間為適宜酒醅酸度。堆積階段酒醅酸度變化如圖3所示。由圖3可知，對(duì)照組酒醅在堆積過程中，酸度呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。在堆積發(fā)酵前期細(xì)菌大量繁殖產(chǎn)酸，酒醅酸度緩慢上升；在堆積發(fā)酵后期，由于堆積溫度升高，產(chǎn)酸微生物代謝受到抑制，且有機(jī)酸合成酯類等化合物中被消耗，酒醅中酸度呈下降。實(shí)驗(yàn)組在0～71h酸度呈上升趨勢(shì)且上升幅度較大，在71h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組達(dá)到3.05mmol/10g，顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組1.67mmol/10g。在經(jīng)過“FD工藝”操作后，實(shí)驗(yàn)組酒醅酸度迅速下降至1.33mmol/10g；堆積到96h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組酒醅酸度由1.33mmol/10g上升為1.54mmol/10g，對(duì)照組為1.59mmol/10g；兩組酒醅達(dá)到適宜入窖酸度便可進(jìn)行入池發(fā)酵。在堆積24～71h實(shí)驗(yàn)組酒醅酸度持續(xù)增加，由于該位點(diǎn)所采集的樣品所處空間的某一方位酸類物質(zhì)堆積過多所致，導(dǎo)致酒醅酸度持續(xù)增大；經(jīng)“FD工藝”處理后，有效降低實(shí)驗(yàn)組酒醅酸度，達(dá)到適宜酸度1.59mmol/10g，符合酒醅入窖條件。由此可解決堆位點(diǎn)酸類物質(zhì)在該點(diǎn)持續(xù)累積過多導(dǎo)致的酒醅酸敗現(xiàn)象，說明“FD工藝”能夠有效降低堆積酒醅酸度在某一方位持續(xù)增加，從而使得酒醅在各位點(diǎn)發(fā)酵狀態(tài)基本一致。圖3堆積過程酒醅酸度變化Fig.3Changesofacidityoffermentedgrainsduringstackingfermentation2.1.3堆積階段酒醅淀粉含量變化淀粉是釀造過程中細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的能量來源，也是生成酒精的主要物質(zhì)，淀粉含量高低與出酒率呈正比[20]。堆積階段酒醅淀粉含量變化如圖4所示。圖4堆積過程酒醅淀粉含量變化Fig.4Changesofstarchcontentinfermentedgrainsduringstackingfermentation由圖4可知，在堆積發(fā)酵過程中，對(duì)照組酒醅和實(shí)驗(yàn)組酒醅隨著堆積發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酒醅中淀粉被微生物分解，淀粉含量下降。對(duì)照組酒醅淀粉含量從24.03%降至22.69%，淀粉含量下降了1.34%；實(shí)驗(yàn)組酒醅淀粉含量從24.93%下降至22.62%，淀粉含量下降了2.31%。在堆積71h后，實(shí)驗(yàn)組酒醅堆進(jìn)行“FD工藝”處理，引入大量氧氣，使堆積酒醅微生物再次富集，微生物的種類數(shù)量增多，微生物代謝活動(dòng)增強(qiáng)，淀粉含量轉(zhuǎn)化（或消耗）速率加快，說明“FD工藝”有利于淀粉轉(zhuǎn)化。張春林等[20]對(duì)第二輪次堆積發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酒醅中淀粉含量逐漸下降，從27.88%降至24.73%；尚柯等[21]在第三輪次堆積發(fā)酵中淀粉測(cè)定結(jié)果在26.81%～31.96%之間，變化幅度較小，說明堆積過程重點(diǎn)是富集微生物，酒精發(fā)酵微弱。本研究淀粉消耗結(jié)果與張春林等[20]和尚柯等[21]結(jié)果基本一致，并且說明“FD工藝”有助于淀粉的轉(zhuǎn)化。2.1.4堆積階段酒醅還原糖含量變化發(fā)酵過程中還原糖含量的變化反映了糖化與發(fā)酵的協(xié)調(diào)程度[18]，酒醅中的淀粉及其他多糖物質(zhì)會(huì)水解成可發(fā)酵性還原糖，供微生物代謝利用，后期發(fā)酵產(chǎn)香。堆積階段酒醅還原糖含量變化如圖5所示。圖5堆積過程酒醅還原糖含量變化Fig.5Changesofreducingsugarcontentinfermentedgrainsduringstackingfermentation由圖5可知，兩組酒醅還原糖含量均呈上升趨勢(shì)，與張春林等[20]研究發(fā)現(xiàn)的在醬香型白酒二輪次堆積過程中還原糖含量呈明顯的上升趨勢(shì)，含量從0.65%上升至1.00%，具有相同的上升趨勢(shì)。酒醅還原糖含量主要在積累過程中增加。對(duì)照組酒醅還原糖含量從1.45%上升至2.19%，整體上升0.74%；實(shí)驗(yàn)組酒醅還原糖含量從1.71%上升至2.83%，整體上升1.12%。在72～96h，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)“FD工藝”處理后，還原糖含量從2.33%上升至2.83%，增加0.5%；對(duì)照組還原糖含量從2.13%上升至2.19%，增加0.06%。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05），即經(jīng)“FD工藝”處理的酒醅其還原糖量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），“FD工藝”有助于淀粉分解而形成酒醅中可發(fā)酵還原糖。本次研究所得結(jié)果實(shí)驗(yàn)組還原糖含量整體上升1.12%，對(duì)照組上升0.74%，遠(yuǎn)高于張春林等[20]的整體上升幅度（僅0.35%），淀粉在經(jīng)“FD工藝”后氧氣大量進(jìn)入微生物生長(zhǎng)繁殖加速消耗轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原糖，使得酒醅實(shí)驗(yàn)組還原糖含量明顯高于對(duì)照組，滿足酒醅中微生物的正常生長(zhǎng)代謝，有助于各種微生物對(duì)還原糖的利用，進(jìn)一步提升使醬香型原酒酒質(zhì)[22]。2.1.5堆積發(fā)酵過程中溫度變化溫度是評(píng)價(jià)高溫堆積成效的重要指標(biāo)之一，當(dāng)堆積酒醅溫度達(dá)到48～50℃時(shí)進(jìn)入窖池發(fā)酵，適宜的溫度有助于酒體風(fēng)味的形成和質(zhì)量的提高[23]。堆積發(fā)酵過程中溫度變化如圖6所示。圖6堆積發(fā)酵過程溫度變化Fig.6Temperaturechangesduringstackingfermentation由圖6可知，兩組樣品酒醅溫度變化總體均呈上升趨勢(shì)，均從收堆溫度30℃左右逐步上升至50℃左右。其中，實(shí)驗(yàn)組在堆積71h時(shí)溫度為43.4℃達(dá)到“FD工藝”溫度指標(biāo)要求，此時(shí)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行“FD，工藝”處理，處理后實(shí)驗(yàn)組各層溫度均勻混合，溫度下降。在72h時(shí)兩組樣本數(shù)據(jù)達(dá)到顯著（P＜0.05）水平，此時(shí)由于溫度較低的堆心及堆底與溫度較高的堆面和堆頂酒醅混合，加之外界冷空氣的引入，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組酒醅溫度顯著（P＜0.05）下降。隨后在24h內(nèi)迅速上升至48.6℃達(dá)到入窖溫度，由于在處理過程中經(jīng)過機(jī)械化破堆、混勻、換位，大量氧氣進(jìn)入酒醅，微生物的生長(zhǎng)和新陳代謝所釋放的熱量使反應(yīng)堆溫度升高。在堆積96h兩組樣品酒醅堆積溫度達(dá)到入池發(fā)酵溫度，即可進(jìn)行入池發(fā)酵。2.2細(xì)菌群落多樣性分析2.2.1Alpha多樣性指數(shù)Alpha多樣性分析是分析微生物多樣性的一個(gè)重要指標(biāo)，用于研究某一生境內(nèi)（或樣本中）的群落多樣性，可通過對(duì)一系列Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估，獲得環(huán)境群落中物種的豐富度、多樣性等信息。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是反映群落多樣性（communitydiversity）的指標(biāo)，Shannon指數(shù)越大說明微生物多樣性越高；Simpson指數(shù)越大，微生物多樣性越低；Coverage指數(shù)反映群落覆蓋度（communitycoverage），Coverage指數(shù)越大，則樣本中序列被測(cè)出的概率越高，該指數(shù)實(shí)際反映了本次測(cè)序結(jié)果是否代表樣本的真實(shí)情況；Coverage指數(shù)接近1，說明測(cè)序數(shù)據(jù)足夠大，可以反映絕大多數(shù)的細(xì)菌信息。Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)是衡量細(xì)菌豐富度指標(biāo)，指數(shù)大小與微生物豐富度呈正相關(guān)。酒醅細(xì)菌群落測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析如表1。由表1可以看出酒醅樣品的Ace、Sobs、Chao指數(shù)在逐步減少；在堆積過程中，由于溫度不斷上升，酒醅內(nèi)部氧含量逐漸減少，微生物生長(zhǎng)繁殖活動(dòng)受抑制，一些不耐高溫的菌經(jīng)高溫篩選后衰落凋亡。實(shí)驗(yàn)組樣在堆積前4d和對(duì)照組酒醅樣品的指標(biāo)變化趨勢(shì)大致相同，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在堆積最后1d，樣品F5的酒醅細(xì)菌豐富度達(dá)到最大值。細(xì)菌群落多樣性從Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)的變化可以反映出來，Shannon指數(shù)在兩組樣品中呈下降趨勢(shì)，樣品F5中Shannon指數(shù)最高，表明此時(shí)細(xì)菌多樣性指數(shù)最大，種類越豐富。由表1可知，10個(gè)樣本的Coverage指數(shù)均為1，說明本次測(cè)序深度基本能夠覆蓋酒醅中所有細(xì)菌群落。以上結(jié)果說明，酒醅經(jīng)過“FD工藝”操作后，堆積酒醅重新引入大量氧氣，打破堆積發(fā)酵的內(nèi)部酒醅厭氧環(huán)境，并再次富集環(huán)境中的細(xì)菌類等微生物，促進(jìn)細(xì)菌類等微生物大量生長(zhǎng)和繁殖，并經(jīng)過“FD工藝”處理后的酒醅再次堆積發(fā)酵，而溫度急劇上升，再次進(jìn)行高溫，從而達(dá)到二次富集和篩選作用，最終使得有益于釀酒生產(chǎn)的細(xì)菌類微生物的豐富度、多樣性顯著提升。表1Alpha多樣性指數(shù)Table1Alphadiversityindex2.2.2細(xì)菌群落組成成分分析優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門水平變化規(guī)律兩組10個(gè)樣品中檢測(cè)出了23個(gè)細(xì)菌門（圖7），將相對(duì)豐度高于1%細(xì)菌門定義為優(yōu)勢(shì)菌門。兩組樣本在堆積發(fā)酵過程中，共檢測(cè)到相對(duì)豐度高于1%細(xì)菌門，包括變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）三大門類（圖7）。圖7優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門水平上變化規(guī)律Fig.7Variationofdominantbacteriaonthelevelofphylum變形菌門（Proteobacteria）被發(fā)現(xiàn)是醬香型白酒釀造過程中的主要細(xì)菌門[24]。變形菌門在對(duì)照組中呈現(xiàn)上升的變化趨勢(shì)，占比分別為11.61%、42.34%、67.89%、52.42%和91.95%；在實(shí)驗(yàn)組樣品中，堆積0～72h與對(duì)照組變化趨勢(shì)相近，堆積72～96h有明顯的下降，占比分別為55.62%、71.51%、88.21%、89.21%和41.17%（圖7）。實(shí)驗(yàn)組在堆積第72h進(jìn)行“FD工藝”處理后，F(xiàn)5中變形菌門（41.17%）占比明顯低于對(duì)照組C5（91.95%），以上說明“FD工藝”不利于變形菌門的生長(zhǎng)繁殖。厚壁菌門（Firmicutes）是中國(guó)白酒發(fā)酵過程中的關(guān)鍵微生物結(jié)構(gòu)[25]。厚壁菌門在堆積過程中是呈下降的變化趨勢(shì)（圖7），對(duì)照組樣品中堆積前期厚壁菌門占比達(dá)到81.53%，隨著堆積時(shí)間逐漸下降，占比分別為55.06%、30.08%和45.15%，堆積最后1d下降至7.97%；實(shí)驗(yàn)組樣品中的厚壁菌門在堆積前期與對(duì)照組同樣呈下降趨勢(shì)變化，占比為41.96%、27.55%、11.43%和10.64%，在實(shí)驗(yàn)組樣品堆積第96h時(shí)，厚壁菌門占比為57.71%。通過樣品C5（7.97%）和F5（57.71%）的對(duì)比可以看出，“FD工藝”能促進(jìn)堆積酒醅中的厚壁菌門生長(zhǎng)繁殖。放線菌在醬香型白酒中具有調(diào)控風(fēng)味、抑制有害雜菌生長(zhǎng)的作用[26]。放線菌門（Actinibacteria）在堆積過程中變化趨勢(shì)總體下降，對(duì)照組C樣品中的占比分別為6.64%、2.37%、1.98%、2.41%和0.08%；實(shí)驗(yàn)組F樣品中的占比分別為2.38%、0.90%、0.35%、0.08%和0.37%（圖7）。實(shí)驗(yàn)組樣品在堆積96h放線菌門（0.37%）占比出現(xiàn)增長(zhǎng)且大于對(duì)照組（0.08%），說明“FD工藝”能促進(jìn)堆積酒醅中的放線菌門生長(zhǎng)繁殖。優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬水平變化規(guī)律兩組10個(gè)樣品中檢測(cè)出了205個(gè)細(xì)菌屬（圖8），將相對(duì)豐度高于1%細(xì)菌門定義為優(yōu)勢(shì)菌屬。兩組樣本在堆積發(fā)酵過程中，共檢測(cè)到相對(duì)豐度高于1%細(xì)菌屬包括醋酸桿菌屬（Acetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、枝芽孢菌屬（Virgibacillus）、克羅本斯泰亞菌屬（Kroppenstedtia）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、火山渣芽孢桿菌屬（Scopulibacillus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、駒型桿菌屬（Komagataeibacter）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、NorankfPseudonocardiaceae、片球菌屬（Pediococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、Unclassified_c_Bacilli。圖8優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬水平上變化規(guī)律Fig.8Changesofdominantbacteriaatthelevelofgenus芽孢桿菌（Bacillus）是醬香白酒中醬香風(fēng)味物質(zhì)的主要代謝菌屬[27]，能分泌蛋白酶、淀粉酶等水解酶類，分解原料形成豐富的發(fā)酵前體物質(zhì)，有利于風(fēng)味物質(zhì)的形成[28]。對(duì)照組樣品中的相對(duì)豐度呈逐步下降趨勢(shì)，由21.76%下降至1.49%，實(shí)驗(yàn)組樣品在堆積0～72h和對(duì)照組樣品變化趨勢(shì)相同，從10.29%下降至2.43%；經(jīng)過“FD工藝”處理后，堆積第96h芽孢桿菌相對(duì)豐度由2.43%上升至14.50%，上升幅度明顯（圖8）。樣品F5（14.50%）較樣品C5（1.49%）相對(duì)豐度高了13.01%，芽孢桿菌（Bacillus）相對(duì)豐度為14.50%，顯著（P＜0.05）高于張春林等[20]得出的芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度（5.90%），以上說明“FD工藝”有利于芽孢桿菌生長(zhǎng)，為芽孢桿菌的生長(zhǎng)創(chuàng)造有利的有氧條件。枝芽孢菌屬（Virgibacillus）對(duì)醬香型白酒風(fēng)味品質(zhì)的形成有重要貢獻(xiàn)[29]。枝芽孢菌屬（Virgibacillus）在對(duì)照組樣品0～48h細(xì)菌群落占比總體呈下降趨勢(shì)，相對(duì)豐度由21.03%下降至4.85%，第72h稍有上升，增至12.73%，96h下降至1.69%；實(shí)驗(yàn)組樣品0～72h從8.77%下降至2.50%，經(jīng)過“FD工藝”處理后，第96h枝芽孢桿菌屬相對(duì)豐度由2.50%上升至11.85%，上升幅度明顯（圖8）。樣品F5（11.85%）較樣品C5（1.69%）相對(duì)豐度高了10.16%，說明“FD工藝”有利于好氧枝芽孢菌屬的生長(zhǎng)。鮮文東等[30]推測(cè)克羅本斯泰亞菌屬（Kroppensted