長鏈非編碼rna的功能與研究進展

長鏈非編碼rna的功能與研究進展

非編碼rna有很多類型，但功能明確的lnmnma數(shù)量非常少。LncRNA可在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達,廣泛參與機體幾乎所有生理和病理過程,與臨床上許多腫瘤及非腫瘤疾病關(guān)系密切。本文就lncRNA的功能研究進展及l(fā)ncRNA在臨床疾病發(fā)生發(fā)展中的作用作一綜述。1lnprna分子2002年Okazaki等在對小鼠全長互補DNA(cDNA)文庫的大規(guī)模測序過程中首次發(fā)現(xiàn)了一類新的轉(zhuǎn)錄物,即lncRNA。LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt(核苷酸單位)的功能性RNA分子,它們?nèi)狈幋a蛋白的能力,位于細胞核或胞質(zhì)內(nèi),以RNA形式在多種層面上(如表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等)調(diào)控基因的表達水平。LncRNA主要有以下5種來源:(1)蛋白編碼基因的結(jié)構(gòu)中斷從而形成一段lncRNA;(2)染色質(zhì)重組:即兩個未轉(zhuǎn)錄的基因與另一個獨立的基因串聯(lián),從而產(chǎn)生含多個外顯子的lncRNA;(3)非編碼基因在復(fù)制過程中的反移位產(chǎn)生lncRNA;(4)局部的復(fù)制子串聯(lián)產(chǎn)生lncRNA;(5)基因中插入一個轉(zhuǎn)座成分而產(chǎn)生有功能的非編碼RNA。雖然lncRNA來源不一,但研究顯示它們在基因表達的調(diào)控方面有相似的作用。2lnprna調(diào)控機制LncRNA起初被認為是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物,不具有生物學(xué)功能,是基因轉(zhuǎn)錄的“噪音”。然而,近年研究表明,眾多l(xiāng)ncRNA具有生物學(xué)功能,如:(1)參與X染色體沉默、基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運輸?shù)榷喾N重要調(diào)控過程。(2)以多種模式保護蛋白編碼基因:如受到嚴格的功能限制以保護編碼基因的開放式可讀框(ORF);或表現(xiàn)為基因序列的較短延伸,以保護功能域和結(jié)構(gòu)。(3)LncRNA含有高效的關(guān)鍵序列,類似于啟動子等調(diào)控因素,具有比蛋白質(zhì)更敏感的結(jié)構(gòu)功能限制。(4)一些進化后的人類基因保守區(qū)域可被轉(zhuǎn)錄成lncRNA,如HAR1,在大腦皮質(zhì)發(fā)育階段早期神經(jīng)元內(nèi)表達。(5)研究顯示,哺乳動物基因組序列中1%產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本是可編碼蛋白,而有4%～9%產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本是lncRNA,其中許多l(xiāng)ncRNA僅在特定的發(fā)育階段出現(xiàn),或具有組織或細胞特異性,還有很多l(xiāng)ncRNA具有保守的二級結(jié)構(gòu)、剪切形式以及精確的亞細胞定位。(6)lncRNA既有順式調(diào)控作用,又有反式調(diào)控作用。現(xiàn)有研究表明lncRNA的作用方式如下(圖1):(1)在編碼蛋白基因的上游啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄,從而干擾鄰近蛋白編碼基因的表達(如酵母中的SER3基因);(2)抑制RNA聚合酶Ⅱ,或介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)和組蛋白修飾,而影響基因表達;(3)與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補雙鏈,進而干擾mRNA的剪切,產(chǎn)生不同的剪切形式;(4)與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補雙鏈,在Dicer酶作用下產(chǎn)生內(nèi)源性的siRNA(小干擾RNA),調(diào)控基因的表達水平;(5)結(jié)合在特定蛋白質(zhì)上調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性;(6)作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體;(7)結(jié)合在特定蛋白上從而改變該蛋白的胞質(zhì)定位;(8)可作為小分子RNA(如miRNA、piRNA、mascRNA)的前體分子。目前發(fā)現(xiàn)的參與哺乳動物基因活動的lncRNA已有上千個,其調(diào)控基因表達的機制存在共性。一般來說,lncRNA主要從表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等3個層面實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控(圖2)。2.1x染色體失活與prining、x-q-ms群哺乳動物lncRNA介導(dǎo)的表觀遺傳改變的研究最早源于基因組印記(genomicprinting)和X染色體失活(Xchromosomeinactive)兩個方面,分別與H19和XistRNA密切相關(guān)(圖2A)。近十年研究證實lncRNA與表觀遺傳調(diào)控密切相關(guān),并且發(fā)現(xiàn)了許多新的與基因調(diào)控有關(guān)的lncRNA。2.1.1lnprna在標記區(qū)的作用基因組印記,通常為共價標記的DNA甲基化(也可以是非共價標記,如DNA-蛋白質(zhì)和DNA-RNA交互作用,核基因組定位等),還包括組蛋白乙酰化、甲基化等修飾。雖然印記基因只占人類基因組的不到5%,但在胚胎、胎兒的生長和出生后的發(fā)育中卻起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用,對行為和大腦的功能也有很大的影響。DNA甲基化參與基因印記的建立和維持,它發(fā)生在生殖細胞的印記控制區(qū)(ICR)。目前對這一領(lǐng)域的研究基本上是針對兩個基因印記區(qū):17號染色體近端的IGF2受體(Igf2r)區(qū)和7號染色體遠端的Kcnq1區(qū),lncRNA在這些印記位點發(fā)揮重要作用。LncRNA在印記區(qū)介導(dǎo)等位基因沉默。目前已知的是,高達半數(shù)的哺乳動物基因都能轉(zhuǎn)錄,而其中大部分轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是非編碼RNA(包括lncRNA),已有個別lncRNA被證明參與調(diào)控印記基因表達。小鼠17號染色體的Igf2r區(qū)是第一個被證實的可轉(zhuǎn)錄為lncRNA的位點。母源性Igf2r的第二個內(nèi)含子包含一個ICR,參與母系的DNA甲基化。而父系染色體的Igf2r基因印記是中斷的,這是由于存在一未拼接的lncRNA——Airn(即Air),它能夠以順式作用堆積在染色質(zhì)上,來介導(dǎo)胎盤組織的兩個關(guān)閉的父源性基因Slc22a2和Slc22a3的印記。7號染色體遠端的Kcnq1區(qū)在結(jié)構(gòu)上與Igf2r位點類似。Kcnq1區(qū)的一個內(nèi)含子存在ICR,介導(dǎo)母源性等位基因的DNA甲基化,并產(chǎn)生由父源性非甲基化等位基因轉(zhuǎn)錄而成的一條lncRNA——Kcnq1ot1或稱Lit1。該ICR約900kb大小,被稱為KcDMR1,它對于父系等位基因的印記很重要。胎盤組織的ICR介導(dǎo)的印記涉及十個以上的基因,其染色質(zhì)抑制需要Kcnq1ot1。而在胚胎組織,只有位于ICR中央的基因才被印記,包括Kcnq1基因本身,其遠端和近端的基因并沒有被印記。這些組織特異性的印記差異使我們產(chǎn)生這樣的疑問:KcDMR1調(diào)控中央部位的印記表達是否與調(diào)控遠端近端基因的機制不同?這一疑問還有待進一步研究。2.1.2ssis-pcg的結(jié)構(gòu)表征:rna的缺失與基因沉淀X染色體失活的選擇和起始發(fā)生在胚胎發(fā)育的早期,這一過程被X失活中心(X-inactivationcenter,XIC)所控制,是一種反義鏈轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。XIC是一個順式作用位點,包含辨別X染色體的數(shù)目的信息和Xist基因,前者可保證僅有一條染色體有活性,但機制尚不明確,后者缺失將導(dǎo)致X染色體失活失敗。X染色體失活是由標志性的約17kb大小的lncRNA——Xist順式作用介導(dǎo),它在哺乳動物的X染色體失活中非常重要。和大多數(shù)轉(zhuǎn)錄本不同的是,Xist并不輸送至胞質(zhì),其位點上一段1.6kb的內(nèi)部非編碼轉(zhuǎn)錄本——RepA可募集Polycomb抑制性復(fù)合物2(PRC2),即染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合體,并包裹在合成它的X染色體的某個RNA結(jié)構(gòu)域上,在即將失活的染色體表面形成“外套(coating)”。隨著Xist在X染色體上的擴展,大量組蛋白甲基化(如H3K27三甲基化)即刻發(fā)生(這對X染色體失活的建立和維持有重要的作用),從而使X染色體失活,但由于反義轉(zhuǎn)錄本Tsix可以限制Xist的活性,使剩余的活化X染色體還存在有PRC2。Xist介導(dǎo)的X染色體失活的特征總結(jié)來說就是喪失激活性的組蛋白修飾(如乙?；?而獲得抑制性的組蛋白修飾(如H3K27的三甲基化),最后,導(dǎo)致失活染色體上的許多CpG島啟動子甲基化,失活的染色體依舊持續(xù)合成Xist,以維持本身的失活狀態(tài),但有活性的X染色體如何阻止XistRNA的結(jié)合機制還不明確。有意思的是,即使在細胞分裂中期,該“外套”始終以順式方式與失活的染色體相連,經(jīng)多次細胞分裂后,X染色體失活始終存在,表明該RNA“外套”與組蛋白修飾及DNA甲基化共同構(gòu)成表觀遺傳學(xué)的記憶,從而使失活的染色體進行有絲分裂。但在體細胞,Xist基因的缺失并不影響基因沉默,說明一旦建立了記憶,lncRNA誘導(dǎo)的沉默結(jié)構(gòu)域就不再是必需的了。再如,一轉(zhuǎn)錄自HOXC基因座的lncRNA——HOTAIR具有類似的機制,它能夠募集染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合體2(PRC2)并將其定位到HOXD位點,進而誘導(dǎo)HOXD基因座上長達40kb的轉(zhuǎn)錄本發(fā)生表觀遺傳沉默(圖2A)。同樣,Air、Kcnq1ot1這些lncRNA都能夠通過募集相應(yīng)的重構(gòu)復(fù)合體,利用甲基轉(zhuǎn)移酶Ezh2、G9a、Mll或PcG等實現(xiàn)表觀遺傳沉默。這一機制將染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物與發(fā)育相關(guān)的修飾聯(lián)系起來。另有研究報道:X染色體失活尚存在另一機制,即與一種調(diào)控性小非編碼RNA有關(guān)。Xist和反義鏈轉(zhuǎn)錄本Tsix退火復(fù)性后可形成一RNA二聚體,在Dicer酶作用下,被加工剪切成約24～42nt大小的調(diào)控性siRNA,這一機制對于失活的X染色體上的抑制性異染色質(zhì)的修飾是必需的,因為X染色體失活過程中組蛋白、賴氨酸和三甲基色氨酸等都需要這些siRNA,并且X染色體激活時Xist啟動子區(qū)的CpG島甲基化也需要它們。這一機制或許可以推測lncRNA和小RNA在染色質(zhì)重塑方面的作用與聯(lián)系,同時提示RNA調(diào)控存在著一個更為復(fù)雜的、交互的網(wǎng)絡(luò)。2.2lnprna在小鼠染色體間相互作用的表達LncRNA能夠通過多種機制在轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)控,表現(xiàn)在如下幾個方面。LncRNA的轉(zhuǎn)錄可以干擾鄰近基因的表達。例如,酵母的SER3基因受到上游一段lncRNA——SRG1的干擾。近端啟動子轉(zhuǎn)錄的lncRNA可將RNA結(jié)合蛋白定位至基因啟動子區(qū)域從而調(diào)控基因表達。如,人類細胞中的細胞周期蛋白D1(CCND1)的表達,DNA損傷信號誘導(dǎo)該基因啟動子上游一段lncRNA的表達,它可調(diào)節(jié)RNA結(jié)合蛋白——TLS的活性,接著TLS抑制CREB結(jié)合蛋白——組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶和p300的活動,進而使CCND1基因的表達沉默(圖2B)。LncRNA可作為共因子調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性,例如,小鼠的一段lncRNA——Evf2轉(zhuǎn)錄自一段超保守的遠端增強子,它可與轉(zhuǎn)錄因子DLX2形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體,并結(jié)合至一個增強子上,從而誘導(dǎo)鄰近蛋白編碼基因DLX6的表達(圖2C)。通過與影響啟動子選擇的抑制性復(fù)合物相互作用,封鎖啟動子區(qū)域來調(diào)控RNA聚合酶(RNAP)Ⅱ的活動從而干擾基因表達,這可能是存在于真核細胞染色體上的上千種三倍體復(fù)合物結(jié)構(gòu)控制啟動子作用的普遍機制。再如,小鼠17號染色體的Igf2r區(qū)是第一個被證實的可轉(zhuǎn)錄為lncRNA的位點,父系染色體上一未拼接的lncRNA——Airn從母源性Igf2r上的ICR區(qū)域開始轉(zhuǎn)錄,方向與Igf2r相反。這一反義鏈轉(zhuǎn)錄的RNA規(guī)模較大,跨越整個Igf2r啟動子,并越過基因間區(qū)抵達鄰近基因,屬于一種轉(zhuǎn)錄干擾機制(圖2D)。2.3lnpna對mrna亞型的選擇性剪接LncRNA在轉(zhuǎn)錄后水平可與mNRA形成雙鏈RNA復(fù)合物,以掩蓋mRNA的主要順式作用元件,從而調(diào)控基因表達。例如,lncRNA-Zeb2(即Sip1)能夠和HOX位點轉(zhuǎn)錄的mRNA的一個內(nèi)含子的5′端剪切位點形成雙鏈,從而防止該內(nèi)含子被剪切(圖2E)。該區(qū)域含有對于Zeb2蛋白表達所必須的核糖體結(jié)合位點,Zeb2通過這種方式能夠提高Zeb2蛋白的表達量。這一例子說明lncRNA可以指導(dǎo)mRNA亞型的選擇性剪接。另外,lncRNA的復(fù)性(退火)具有靶向作用,使蛋白受體復(fù)合物能夠識別正義鏈mRNA轉(zhuǎn)錄本,這一租用類似于RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)通過siRNA靶向作用于mRNA。來自于互補轉(zhuǎn)錄本甚至是lncRNA的雙鏈RNA,結(jié)合延長的內(nèi)部發(fā)夾結(jié)構(gòu),能夠被加工成內(nèi)源性siRNA以使基因表達沉默(圖2E)。3bace1asLncRNA能夠調(diào)節(jié)與之相關(guān)的蛋白編碼基因,lncRNA的不當表達可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生,這一發(fā)現(xiàn)開拓了對病因?qū)W上lncRNA作用機制研究的新領(lǐng)域。例如,從p15抑癌基因轉(zhuǎn)錄而來的一條反義lncRNA可以誘導(dǎo)局部異染色質(zhì)和DNA甲基化,從而使該lncRNA及相關(guān)蛋白發(fā)生逆表達,最終導(dǎo)致白血球增多癥的發(fā)生。2008年Yu等的研究表明,包括p15在內(nèi)的許多因表觀遺傳機制而發(fā)生基因沉默的抑癌基因都可轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的lncRNA,從而誘導(dǎo)相關(guān)疾病的發(fā)生。LncRNA參與誘導(dǎo)疾病的發(fā)生,這一機制也可能還與疾病相關(guān)基因的多態(tài)性和非編碼區(qū)的染色體改變有關(guān)。例如,一段反義鏈轉(zhuǎn)錄的lncRNA若發(fā)生易位和誘導(dǎo)表達,便可導(dǎo)致鄰近的α-globin基因的表觀沉默,從而導(dǎo)致α-地中海貧血。再如大量的研究所示,腫瘤細胞中某些特定lncRNA的表達水平發(fā)生異常改變。這種表達水平的變化能夠作為癌癥診斷的標志物(如前列腺癌中的DD3)和潛在的藥物靶點。近來在對阿爾茨海默病的研究中發(fā)現(xiàn)一個lncRNA——BACE1AS,它轉(zhuǎn)錄自β分泌酶編碼基因BACE1的反義鏈。β分泌酶能夠產(chǎn)生β淀粉樣蛋白,后者的累積是阿爾茨海默病的主要誘因。BACE1AS能夠防止BACE1mRNA受核酸酶降解,以增加BACE1mRNA的穩(wěn)定性,從而誘導(dǎo)更多的β淀粉樣蛋白累積,并促進BACE1AS的表達,這個正反饋循環(huán)將會加速阿爾茨海默病的發(fā)展。當實驗中加入特異性針對BACE1AS的siRNA后,發(fā)現(xiàn)BACE1AS的表達水平降低,β淀粉樣蛋白的表達水平也同時下降,這表明BACE1AS是一個非常理想的治療阿爾茨海默病的藥物靶點。2003年就已有研究表明,另一個lncRNA——MALAT1(metastasis-associatedlungadenocarcinomatranscript1)廣泛存在于人類和小鼠的正常組織中。雖然早期的非小細胞癌中MALAT1的表達無特異性,但在癌癥轉(zhuǎn)移之后,MALAT1的表達水平較未轉(zhuǎn)移者高,說明MALAT1在腫瘤轉(zhuǎn)移中具有提示的價值,MALAT