超聲波法破碎酵母蔗糖酶的研究

超聲波法破碎酵母蔗糖酶的研究

糖酶（ec3.2.1.26）也被稱為轉(zhuǎn)換酶，它可以加速葡萄糖的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生葡萄糖和葡萄糖。這是一種廣泛存在于自然界的糖苷酶。目前蔗糖酶已在農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)、食品工業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)中發(fā)揮重要作用。工業(yè)上一般從酵母中提取蔗糖酶。蔗糖酶屬于胞內(nèi)水解酶,提取時(shí)須對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行破壁處理,酵母細(xì)胞的破壁方法主要有機(jī)械研磨法、酶解法、反復(fù)凍融法等,這些方法都有一些不足之處,例如酶解法耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高,機(jī)械研磨法操作復(fù)雜、損耗大等。超聲波具有空化效應(yīng),會(huì)產(chǎn)生機(jī)械剪切壓力而使細(xì)胞破碎。本研究采用超聲波法破碎酵母細(xì)胞,以期找出有效保存酵母蔗糖酶活性的超聲破碎條件。1材料和方法1.1蘑菇釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)GY7,由遼寧石油化工大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部實(shí)驗(yàn)室保存。1.2氯化鈉/ml種子培養(yǎng)基:葡萄糖10g/L,蛋白胨5g/L,酵母膏15g/L,氯化鈉4g/L,pH值7.0。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L,酵母粉10g/L,KH2PO41.5g/L,MgSO41g/L,pH值5.5。1.3儀器、儀器和檢測(cè)方法立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);全溫振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司);可見分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司);高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技生物有限公司)。1.4方法1.4.1酒果酸的培養(yǎng)和收集式中:x為葡萄糖含量;n為稀釋倍數(shù);V為酶液體積,0.5mL;t為反應(yīng)時(shí)間,10min。2結(jié)果與分析2.1超聲中斷祖母細(xì)胞的單因素試驗(yàn)2.1.1不同工作時(shí)間對(duì)蔗糖酶活力的影響由圖2可以看出,當(dāng)破碎功率為350W時(shí),提取到的酵母蔗糖酶活力最高,為8515.7U/mL。當(dāng)破碎功率小于350W時(shí),酵母蔗糖酶活力隨功率增加而增加,說明功率越高,細(xì)胞破碎率越高,蔗糖酶活力也越高;而當(dāng)破碎功率大于350W時(shí),蔗糖酶的活力開始降低,說明功率過大雖然會(huì)增加細(xì)胞破碎率,但由于功率增大的同時(shí)對(duì)活性物質(zhì)的破壞力也有所增大,因此破碎功率選擇350W較為適宜。由圖3可見,在一定范圍內(nèi),隨著總工作時(shí)間的增加,蔗糖酶活力逐漸升高,20min之前增加幅度較為顯著,之后趨于緩慢;當(dāng)總工作時(shí)間達(dá)到25min時(shí),破碎效果最為明顯,蔗糖酶活力最高,達(dá)到8715.7U/mL;30min后蔗糖酶活力開始有降低趨勢(shì)。因此,超聲破碎總工作時(shí)間選擇25min左右較為適宜。2.1.3生長(zhǎng)勢(shì)力增長(zhǎng)由圖4可以看出,在一定范圍內(nèi),隨著工作時(shí)間/間歇時(shí)間的增大,蔗糖酶活性逐步增高;當(dāng)工作時(shí)間/間歇時(shí)間為15s/25s時(shí),蔗糖酶活性達(dá)到峰值;之后蔗糖酶活性有小幅度降低;當(dāng)工作時(shí)間超過間歇時(shí)間時(shí),蔗糖酶活性驟然下降。因此,選擇工作時(shí)間/間歇時(shí)間為15s/25s左右進(jìn)行超聲破碎。2.2超聲破碎細(xì)胞的正交試驗(yàn)結(jié)果在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選用L9(33)正交試驗(yàn)表,綜合考察超聲破碎功率、總工作時(shí)間、工作時(shí)間/間歇時(shí)間對(duì)酵母蔗糖酶活性的影響,各因素水平見表1。由表2可以看出,超聲破碎酵母細(xì)胞正交試驗(yàn)結(jié)果中,極差的高低順序?yàn)?工作時(shí)間/間歇時(shí)間>超聲破碎功率>總工作時(shí)間,即工作時(shí)間/間歇時(shí)間對(duì)酵母蔗糖酶活性的影響最大,其次是超聲破碎功率,影響最小的因素是總工作時(shí)間。由表2還可見,從釀酒酵母中提取蔗糖酶的最佳超聲破碎工藝條件為A2B2C2,即超聲功率350W,總工作時(shí)間25min,工作時(shí)間/間歇時(shí)間15s/25s。方差分析表明,工作時(shí)間/間歇時(shí)間是影響酵母蔗糖酶活性的顯著性因素(表3)。3超聲破碎細(xì)胞的培養(yǎng)釀酒酵母細(xì)胞壁較厚,在超聲破碎過程中超聲功率的選擇非常重要,功率較小影響酵母細(xì)胞破碎率,導(dǎo)致酵母蔗糖酶活力較低;而功率過大則會(huì)引起細(xì)胞懸液飛濺或產(chǎn)生泡沫。超聲破碎的工作時(shí)間/間歇時(shí)間對(duì)蔗糖酶活力有顯著影響,當(dāng)超聲破碎時(shí)間大于間歇時(shí)間時(shí),超聲破碎過程中產(chǎn)生了較多熱量,而較短的間歇時(shí)間使熱量無法散發(fā),從一定程度上破壞了蔗糖酶活性。因此設(shè)定工作時(shí)間/間歇時(shí)間時(shí),應(yīng)使超聲時(shí)間短于間歇時(shí)間。本研究以酵母蔗糖酶活力為指標(biāo),將超聲破碎功率、總工作時(shí)間、工作時(shí)間/間歇時(shí)間列為考察因素,通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)探尋超聲破碎酵母細(xì)胞的最佳條件。試驗(yàn)優(yōu)化后的超聲破碎條件為超聲功率350W,總工作時(shí)間25min,工作時(shí)間/間歇時(shí)間15s/25s。優(yōu)化后的超聲破碎酵母細(xì)胞法與酸堿裂解法、反復(fù)凍融法、酶解法相比,更為簡(jiǎn)便、快捷、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用,適于實(shí)驗(yàn)室及小規(guī)模的破碎酵母提取蔗糖酶等胞內(nèi)活性物質(zhì)試驗(yàn)。向裝有30mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中接種兩環(huán)斜面種子,30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)24h,得到二級(jí)種子液。將二級(jí)種子液以10%的接種量接入100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,29℃、搖床轉(zhuǎn)速160r/min條件下培養(yǎng)27h左右。取菌液于4000r/min離心10min,得到酵母菌體細(xì)胞。1.4.2超聲細(xì)胞破碎法將離心得到的菌體用pH值4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖液沖洗2次,取菌體1g,加入到50mL緩沖液中充分振蕩混勻制成菌懸液,在超聲細(xì)胞破碎儀中破碎,破碎條件按單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)表進(jìn)行。1.4.3乙醇對(duì)粗酶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響將超聲破碎后細(xì)胞懸濁液于12000r/min離心20min,得到上清即為粗酶液。向粗酶液中加入乙醇使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)30%,4℃放置過夜,12000r/min離心15min,取上清液,再追加投入乙醇使其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)50%。4℃放置1h,12000r/min離心15min,棄上清液,沉淀用雙蒸水溶解,4℃保存。1.4.4細(xì)胞破碎率的檢測(cè)取4支試管,各加入0.5mL酶液。將其中1支試管置于100℃沸水浴2min(作參比),另3支試管作平行測(cè)定管。向4只試管中各加入2%蔗糖液0.5mL,置于35℃水浴反應(yīng)10min,然后取出各加入1mLDNS溶液終止反應(yīng)。用DNS法在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定還原糖含量。將1個(gè)酶活力單位定義為在本試驗(yàn)條件下,1min催化2%蔗糖生成1μg葡萄糖的蔗糖酶量。在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)上找到所測(cè)定光密度值對(duì)應(yīng)的葡萄糖含量,按下式計(jì)算酶活力。超聲破碎功率是影響細(xì)胞破碎率的重要因素,超聲破碎功率過小會(huì)造成細(xì)胞破碎率低,破碎不完全;若超聲破碎功率過大,則會(huì)引起樣品飛濺或產(chǎn)生泡沫。本試驗(yàn)中細(xì)胞懸濁液體積為50mL,因此在200~400W范圍內(nèi)選擇功率。在工作時(shí)間/間歇時(shí)間為20s/25s、總工作時(shí)間(指超聲破碎的總時(shí)間,不包括間隔時(shí)間)25min、冰浴等條件不變的情況下,分別以5個(gè)功率進(jìn)行超聲細(xì)胞破碎。2.1.2超聲破碎過程選定破碎功率350W、工作時(shí)間/間歇時(shí)間為20s/25s,分別以5、10、15、20、25、30min為總工作時(shí)間進(jìn)行超聲細(xì)胞破碎。破碎后離心取上清,提取蔗糖酶,最后測(cè)定蔗糖酶活力。工作時(shí)間/間歇時(shí)間是超聲破碎過程中的重要因素之一,