結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷

結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷1精選課件1.結(jié)核病背景資料2.結(jié)核病常規(guī)檢驗(yàn)3.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷4.體外r-干擾素釋放試驗(yàn)5.小結(jié)2精選課件背景—結(jié)核病流行現(xiàn)狀全球有三分之一人口（20億）感染了結(jié)核桿菌我國(guó)現(xiàn)患肺結(jié)核病人達(dá)500萬(wàn)，占全球病人總數(shù)的1/43精選課件背景—結(jié)核病感染、傳播、發(fā)病過(guò)程潛伏感染

染肺病或其他疾病潛伏感染復(fù)發(fā)

細(xì)菌在人體復(fù)制播散

Disseminates發(fā)作

Onset康復(fù)

Recovery時(shí)間表Time診斷

Diagnosis治療

Treatment痊愈≥2個(gè)月（months）4精選課件背景—當(dāng)前結(jié)核病的研究新型抗結(jié)核藥物(50%)新型快速診斷技術(shù)(40%)新型結(jié)核疫苗(10%)JID2012:205(Suppl2),S147.5精選課件背景—結(jié)核分枝桿菌基礎(chǔ)結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis）簡(jiǎn)稱為結(jié)核桿菌（tuberclebacilli）。早在1882年，德國(guó)細(xì)菌學(xué)家柯赫（RobertKoch）就已證明結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的病原菌。本菌可侵犯全身各組織器官，但以肺部感染最多見(jiàn)。在微生物分類中，結(jié)核分枝桿菌屬于放線菌門(mén)、放線菌綱、放線菌目、分枝桿菌科、分枝桿菌屬分枝桿菌復(fù)合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型結(jié)核分枝桿菌是人類主要的致病菌6精選課件背景—結(jié)核分枝桿菌基礎(chǔ)（1）結(jié)核桿菌可經(jīng)多途徑感染，由呼吸道、消化道和破損皮膚侵入機(jī)體，最常見(jiàn)為經(jīng)呼吸道感染引起肺結(jié)核。（2）結(jié)核桿菌無(wú)內(nèi)毒素和外毒素，也不產(chǎn)生侵襲性酶，其致病性主要與其細(xì)胞壁內(nèi)含大量脂質(zhì)有關(guān)。主要包括：①磷脂：可刺激單核細(xì)胞增生，與結(jié)核結(jié)節(jié)和干酪樣壞死形成有關(guān)②分枝菌酸：與抗酸染色性有關(guān)③索狀因子：可破壞細(xì)胞線粒體膜，與慢性肉芽腫形成有關(guān)④硫酸腦苷酯：抑制吞噬溶酶體形成，具有抗吞噬作用⑤蠟質(zhì)D，可刺激機(jī)體的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。（3）結(jié)核桿菌主要引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，屬于傳染性免疫7精選課件結(jié)核病患者的常規(guī)檢驗(yàn)三大常規(guī)（血常規(guī)、尿常規(guī)、大便常規(guī)）血沉血流變檢測(cè)肺結(jié)核患者血液粘滯性、凝固性、聚集性均增高，血流緩慢，易于促成肺內(nèi)微血栓形成

——《微循環(huán)學(xué)雜志》

常規(guī)檢測(cè)，無(wú)特異性。8精選課件結(jié)核病患者的常規(guī)檢驗(yàn)腺苷脫氨酶（ADA）:其血清/漿膜腔積液比值更有意義。C反應(yīng)蛋白（CRP）:X線提示有空洞的結(jié)核病人比沒(méi)有空洞的結(jié)核病人以及健康人顯著升高。但是CRP正常不能排除結(jié)核病。

——Infection.17(1):13-4,1989Jan-Feb輔助治療檢測(cè)：肝功能、腎功能、血脂、血糖。。。。NSE、AFU等指標(biāo)用于鑒別診斷。CA125標(biāo)志的使用，可以作為結(jié)核病療效判斷指標(biāo)。結(jié)核病與肺部腫瘤患者均升高?！吨袊?guó)實(shí)用內(nèi)科雜志》2003年第2期9精選課件結(jié)核病患者的常規(guī)檢驗(yàn)超敏C反應(yīng)蛋白：肺結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能下降的慢性呼吸道傳染病，患者血清中HS—CRP、免疫球蛋白、補(bǔ)體可發(fā)生改變。

——《中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)》2009年01期降鈣素原（PCT）肺結(jié)核患者血清PCT水平明顯低于社區(qū)獲得性肺炎（CAP）患者，HIV陰性的肺結(jié)核患者血清PCT水平并不會(huì)明顯增高，故可用于PTB和CAP的鑒別診斷，但當(dāng)PCT水平大于正常值時(shí)，其預(yù)后價(jià)值較差?？勺鳛榉谓Y(jié)核和肺結(jié)核伴感染診斷的輔助指標(biāo)。

——[Eur

Respir

J

2011;

37(2):371]10精選課件結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)簡(jiǎn)介1.結(jié)核抗體2.結(jié)核蛋白芯片3.體外r-干擾素試驗(yàn)4.結(jié)核桿菌分泌抗原1.涂片2.培養(yǎng)3.藥敏4.菌型鑒定細(xì)菌學(xué)免疫學(xué)分子生物學(xué)其他1.HPLC2.質(zhì)譜技術(shù)3.流式技術(shù)1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR2.DNA3.RNA4.耐藥基因突變5.菌型鑒定6.測(cè)序11精選課件結(jié)核分枝桿菌形態(tài)學(xué)檢測(cè)1.直接抹片法2.離心制片法1.抗酸染色2.熒光染色1.普通顯微鏡2.熒光顯微鏡3.自動(dòng)閱片技術(shù)涂片染色鏡檢12精選課件結(jié)核桿菌離心制片技術(shù)直接涂片法離心制片法合計(jì)陽(yáng)性陰性陽(yáng)性41041(15.9%)陰性17199216(84.1%)合計(jì)58（22.6%）199(77.4%)2572015年7月至2015年11月，對(duì)本院257例痰液和纖維支氣管鏡灌洗液進(jìn)行直接涂片法和離心制片法比對(duì)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如下：結(jié)論：離心制片法的確能提高結(jié)核桿菌涂片檢測(cè)的陽(yáng)性率。13精選課件結(jié)核桿菌自動(dòng)閱片技術(shù)2016年2月至2016年3月，本院對(duì)308例涂片進(jìn)行人工閱片和計(jì)算機(jī)自動(dòng)閱片比對(duì)試驗(yàn)；結(jié)果符合的為286例，總符合率為92.58%。14精選課件結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)結(jié)核桿菌體外藥敏試驗(yàn)MIC測(cè)定法固體培養(yǎng)法液體儀器法液體微量法15精選課件結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)

DrugfreeIsoniazidEthambutolInoculummedia0.2mcg/ml2.0mcg/ml

10-3++++++310-52690%resistant34.60.1InterpretationResistantSusceptible16精選課件結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)1234

挑取菌落磨菌、稀釋接種菌液孵育7-10天顯色，讀取結(jié)果結(jié)核分枝桿菌液體微量藥敏17精選課件結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)結(jié)核分枝桿菌液體微量顯色法藥敏試驗(yàn)

收集我院2015年8月至11月的臨床分離菌株511例，使用液體微量顯色法進(jìn)行了利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫異煙胺對(duì)氨基水楊酸、左氧氟沙星、莫西沙星、利福布丁、阿米卡星、卡那霉素、氯苯吩嗪等十四種抗結(jié)核藥物的體外藥敏試驗(yàn)。其中MDR-TB菌株75例（14.7%）。藥物RFPINHSMEMBCPMOFXETHPASLVFMOFRFBAMIKANCLO耐藥例數(shù)80146945850614149536260111387耐藥率%15.728.618.411.49.811.98.09.610.412.111.72.22.517.018精選課件結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)結(jié)核分枝桿菌液體微量顯色法藥敏試驗(yàn)比對(duì)實(shí)驗(yàn)

收集臨床分離菌株和國(guó)家參比室的質(zhì)控菌株117例，使用液體微量顯色法和羅氏比例法進(jìn)行了利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫異煙胺、對(duì)氨基水楊酸、左氧氟沙星、莫西沙星、

利福布丁、阿米卡星、卡那霉素、氯苯吩嗪等十四種抗結(jié)核藥物的比對(duì)實(shí)驗(yàn)?？偡下食^(guò)90%。19精選課件結(jié)核病分子生物學(xué)診斷一、結(jié)核分枝桿菌探針溶解曲線技術(shù)20精選課件結(jié)核病分子生物學(xué)診斷結(jié)果判斷21精選課件結(jié)核病分子生物學(xué)診斷溶解曲線法比例法藥敏敏感度特異度陽(yáng)性預(yù)測(cè)值%陰性預(yù)測(cè)值%總符合率%敏感耐藥%%INH敏感110490.598.295.596.696.1耐藥238RFP敏感103295.897.294.198.196.8耐藥346收集我院樣本庫(kù)的臨床分離菌株154例，進(jìn)行了溶解曲線法耐藥基因突變分析以及羅氏比例法藥敏試驗(yàn)，總符合率在96%以上。并對(duì)耐藥結(jié)果不相符的11株菌進(jìn)行了基因測(cè)序分析，均證實(shí)有耐藥基因突變。22精選課件結(jié)核病分子生物學(xué)診斷二、結(jié)核分枝桿菌RNA檢測(cè)(TB-RNA)RNA作為臨床分子診斷靶標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)：RNA拷貝數(shù)≥DNA拷貝數(shù)更具臨床意義:生命力旺盛的病原體RNA轉(zhuǎn)錄活躍RNA遠(yuǎn)不如DNA穩(wěn)定，病原體死亡，RNA很快降解

1.交叉污染少

2.較好的愈后指標(biāo)23精選課件結(jié)核病分子生物學(xué)診斷

統(tǒng)計(jì)今年我院住院患者179例，分析涂片、培養(yǎng)和TB-RNA檢測(cè)報(bào)告，結(jié)果如下：患者類型例數(shù)TB-RNA陽(yáng)性例數(shù)陽(yáng)性率涂片陽(yáng)性272385.2%涂片陰性1424128.9%培養(yǎng)陽(yáng)性686291.1%培養(yǎng)陰性11121.8%我院涂片、培養(yǎng)陽(yáng)性率分別為：15.1%和37.9%；TB-RNA的總陽(yáng)性率為35.8%。24精選課件結(jié)核病分子生物學(xué)診斷三、EasyNATTB-DNA檢測(cè)（恒溫?cái)U(kuò)增法）原理：將病原體DNA擴(kuò)增、核酸雜交和核酸試紙條檢測(cè)三種技術(shù)有機(jī)地融為一體，在恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中加入兩對(duì)TB特異性引物、一對(duì)特異性探針，同時(shí)一次性完成TBDNA的擴(kuò)增及雜交過(guò)程，然后用一次性核酸檢測(cè)裝置進(jìn)行定性診斷。檢測(cè)目標(biāo)片段:目標(biāo)為結(jié)核分枝桿菌

特異性IS6110片段。25精選課件結(jié)核病分子生物學(xué)診斷操作步驟26精選課件結(jié)核病分子生物學(xué)診斷

2015年6月，我科參加CTCTC“EasyNAT?結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用評(píng)估”項(xiàng)目,結(jié)果如下：

患者類型例數(shù)EasyNATTB-DNA檢測(cè)陽(yáng)性率%陽(yáng)性陰性涂片陽(yáng)性770100.0涂片陰性432414.7培養(yǎng)陽(yáng)性1091*90.0培養(yǎng)陰性400400.0注*：1例培養(yǎng)陽(yáng)性最終鑒定為非結(jié)核分枝桿菌27精選課件結(jié)核病分子生物學(xué)診斷四、Gen-XpertMTB/RIF進(jìn)行標(biāo)本處理、實(shí)時(shí)PCR和利福平耐藥性檢測(cè)的完整平臺(tái)痰標(biāo)本可以直接放入模塊中，而無(wú)需與任何試劑進(jìn)行混合處理GeneXpert設(shè)備可進(jìn)行標(biāo)本液化、去污染、富集、DNA提取、rpoB實(shí)時(shí)擴(kuò)增、應(yīng)用分子燈塔檢測(cè)耐藥相關(guān)的突變?nèi)菀资褂茫恍枰M(jìn)行分子生物學(xué)培訓(xùn)操作完全自動(dòng)化，使用起來(lái)既容易又安全。28精選課件結(jié)核病分子生物學(xué)診斷XpertMTB/RIF與PCRTB-DNA檢測(cè)的比較：陽(yáng)性符合率＝99.03％，陰性符合率＝92.61％，總符合率＝95.31％Gen-XpertPCRTB-DNA合計(jì)陽(yáng)性陰性陽(yáng)性20421225陰性2263265合計(jì)20628449029精選課件結(jié)核病分子生物學(xué)診斷涂片陽(yáng)性肺結(jié)核:Xpert檢出率=99.35％涂片陰性肺結(jié)核:Xpert檢出率=35.32％Gen-Xpert涂片結(jié)果合計(jì)陽(yáng)性陰性陽(yáng)性15271223陰性1130131合選課件結(jié)核病分子生物學(xué)診斷XpertMTB/RIF與BD960液體培養(yǎng)比較實(shí)驗(yàn)：陽(yáng)性符合率＝95.52％，陰性符合率＝95.51％，總符合率=95.51％Gen-Xpert培養(yǎng)+鑒定結(jié)果合計(jì)陽(yáng)性陰性陽(yáng)性21312225陰性10255265合計(jì)22326749031精選課件結(jié)核病分子生物學(xué)診斷XpertMTB/RIF與比例法藥敏比較實(shí)驗(yàn)：陽(yáng)性符合率

＝96.88％，陰性符合率

＝95.53％，總符合率

＝95.73％，Gen-Xpert利福平藥敏試驗(yàn)合計(jì)耐藥（陽(yáng)性）敏感（陰性）耐藥（陽(yáng)性）31839不確定022敏感（陰性）1171172合計(jì)3217921132精選課件結(jié)核病分子生物學(xué)診斷WHO關(guān)于XpertMTB/RIF的建議XpertMTB/RIF應(yīng)該用于MDR-TB的高危人群、以便盡早發(fā)現(xiàn)MDR-TB患者，有效控制疫情。XpertMTB/RIF在MDR或HIV問(wèn)題不十分嚴(yán)重的地區(qū)，可以考慮作為顯微鏡檢查基礎(chǔ)之上的后續(xù)檢測(cè)，特別是用于涂陰標(biāo)本的進(jìn)一步檢測(cè)。33精選課件體外r-干擾素釋放試驗(yàn)蛋白質(zhì)水平結(jié)核菌素試驗(yàn)（TST）T-SPOT.TBQuantiFERON-TBGoldin-tube(QFT-GI)潛伏性結(jié)核（LTBI）34精選課件體外r-干擾素釋放試驗(yàn)γ

干擾素檢測(cè)陰性γ干擾素檢測(cè)陽(yáng)性TB抗原多肽T細(xì)胞活化T細(xì)胞γ干擾素35精選課件體外r-干擾素釋放試驗(yàn)

特異性只針對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群敏感，與絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無(wú)交叉反應(yīng)美國(guó)FDA數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306)國(guó)內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：特異性94.1%(478/508)

靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結(jié)核患者中有很高的檢出率美國(guó)FDA數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183)國(guó)內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(624/655)36精選課件體外r-干擾素釋放試驗(yàn)陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果空白對(duì)照抗原AESAT-6抗原BCFP10陽(yáng)性對(duì)照（PHA）實(shí)驗(yàn)效果圖37精選課件體外r-干擾素釋放試驗(yàn)檢測(cè)特異性的提高幫助臨床區(qū)分卡介苗接種和環(huán)境分枝桿菌感染引起的“假陽(yáng)性”，避免了臨床的無(wú)效用藥檢測(cè)靈敏度的提高有利于臨床對(duì)結(jié)核病的早發(fā)現(xiàn)、早治療，避免了疾病的傳播與擴(kuò)散快速48小時(shí)出結(jié)果38精選課件體外r-干擾素釋放試驗(yàn)

陰性結(jié)果提示患者體內(nèi)不存在針對(duì)結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞。假陰性結(jié)果：①感染階段不同；②少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全/疾病；③實(shí)驗(yàn)非正常操作。

陽(yáng)性結(jié)果提示患者體內(nèi)存在針對(duì)結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞，患者存在結(jié)核感染。但是否是活動(dòng)性結(jié)核病，需結(jié)合臨床癥狀和其它檢測(cè)指標(biāo)綜合判斷。假陽(yáng)性結(jié)果：4種環(huán)境分枝桿菌感染時(shí)：M.kansasii（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）39精選課件體外r-干擾素釋放試驗(yàn)WHO2014《潛伏結(jié)核感染管理指南》建議：1、在HIV感染人群、與肺結(jié)核患者密切接觸的成人和兒童、開(kāi)始接受抗腫瘤壞死因子（TNF）治療的患者、接受透析治療的患者、準(zhǔn)備接受器官或血液移植的患者、以及硅肺患者中開(kāi)展LTBI系統(tǒng)檢測(cè)和治療。檢測(cè)LTBI建議使用γ-干擾素釋放試驗(yàn)（IGRA）或結(jié)核菌素皮試（TST）。2、對(duì)于羈押人員、醫(yī)務(wù)人員、來(lái)自結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家的移民、無(wú)家可歸者、以及吸毒人員，可以有條件地開(kāi)展LTBI系統(tǒng)檢測(cè)和治療。3、對(duì)于糖尿病人、酒精依賴者、吸煙成癮者、低體重者，如果他們不屬于以上1和2的情況，并不建議常規(guī)開(kāi)展LTBI的系統(tǒng)檢測(cè)。40精選課件體外r-干擾素釋放試驗(yàn)LTBI篩查和診斷的建議流程

41精選課件體外r-干擾素釋放試驗(yàn)關(guān)于IGRA用于診斷LTBI的研究文獻(xiàn)比較多，在這方面的結(jié)論也比較成熟。Richeldi的綜述認(rèn)為T(mén)-SPOT.TB診斷LTBI的敏感度高于TST，而QFT-GIT診斷LTBI的敏感度與TST相似；無(wú)論人群是否接種后卡介苗，T-SPOT.TB和QFT-GIT在診斷LTBI的特異度方面均優(yōu)于TST。

----Richeldi.L.Anupdataonthediagnosisoftuberculsosisinfection.AmJRespirCritCareMed,2006,174:736-742.

Menzies等在2007年發(fā)表的一篇納入8項(xiàng)研究的meta分析論文中指出，IGRA對(duì)于普通人群，尤其是曾經(jīng)接種過(guò)卡介苗的人群診斷LTBI具有較高的特異度；但和TST一樣，IGRA的敏感度差強(qiáng)人意，兩者均不能區(qū)別LTBI和活動(dòng)性結(jié)核病

----MenziesD,PaiM,ComstockG.Meta-analysis:newtestsforthediagnosisoflatenttuberculosisinfection:areasofuncertaintyandrecommendationsforresearch.AnnInternMed,2007,146:340-354.

IGRA診斷LTBI的價(jià)值42精選課件體外r-干擾素釋放試驗(yàn)IGRA診斷活動(dòng)性結(jié)核病的價(jià)值

在南非進(jìn)行的1項(xiàng)募集到491例痰涂陰疑為肺結(jié)核患兒的研究中，結(jié)合臨床資料、胸片以及TST結(jié)果診斷肺結(jié)核的曲線下面積為85%（95%CI80%–90%）。該研究最重要的價(jià)值在于發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB相對(duì)于臨床資料、胸片以及TST的綜合判斷價(jià)值而言，并沒(méi)有增加額外的診斷價(jià)值。

LingDI,NicolMP,PaiM,etal.IncrementalvalueofT-SPOT.TBfordiagnosisofactivepulmonarytuberculosisinchildreninahigh-burdensetting:amultivariableanalysis.Thorax,2013,68:860-866.43精選課件體外r-干擾素釋放試驗(yàn)無(wú)論是HIV感染者還是非HIV感染者，IGRA的診斷效率與TST相比較均無(wú)優(yōu)勢(shì)。這些資料清楚地表明，在中低收入國(guó)家，IGRA和TST一樣對(duì)于診斷成人活動(dòng)性結(jié)核病沒(méi)有任何價(jià)值[1]。另有研究指出，IGRA較低的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值限制其在中低收入國(guó)家成為臨床常規(guī)檢測(cè)活動(dòng)性結(jié)核的手段[2]。實(shí)際上，世界衛(wèi)生組織專家組基于現(xiàn)有的證據(jù)明確指出，在中低收入國(guó)家不能以IGAR代替常規(guī)的微生物診斷方法用于肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷[3]。1.

MetcalfeJZ,EverettCK,SteingartKR,etal.Interferon-gammareleaseassaysforactivepulmonarytuberculosisdiagnosisinadultsinlow-andmiddle-incomecountries:systematicreviewandmeta-analysis.JInfectDis,2011,204:S1120-1129.

2.

KangYA,LeeHW,HwangSSetal.Usefulnessofwhole-bloodinterferon-gammaassayandinterferon-gammaenzyme-linkedimmunospotassayinthediagnosisofactivepulmonarytuberculosis.Chest,2007,132:959-965.

3.

WHO.StrategicandTechnicalAdvisoryGroupforTuberculosis(STAG-TB):reportofthe