某科研項(xiàng)目立項(xiàng)依據(jù)

某科研項(xiàng)目立項(xiàng)依據(jù)大腸癌是一種發(fā)生在結(jié)腸或者直腸中的癌癥，是最常見的惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)病人約八百萬，占所有惡性腫瘤的10%-15%，其發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤的第三位［1］。隨著手術(shù)、化療、放療水平的提高，大腸癌患者的生存率有了較大的提高，但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響其預(yù)后的最主要因素。在美國大腸癌中有90%的死亡由腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移所致⑵。所以，通過對大腸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，正確認(rèn)識大腸癌術(shù)后轉(zhuǎn)移模式，對于制定合理的術(shù)后隨訪方案，采取有針對性的干預(yù)措施，提高生存率至關(guān)重要。大腸癌最常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位是肝臟和肺。對于肝轉(zhuǎn)移，人們更多的把原因歸結(jié)為解剖因素，結(jié)腸是通過門靜脈系統(tǒng)回流進(jìn)入肝臟，所以認(rèn)為大腸癌的首發(fā)轉(zhuǎn)移部位往往在肝臟。但是很多臨床研究發(fā)現(xiàn)大腸癌患者術(shù)后轉(zhuǎn)移可以繞開肝臟而首先出現(xiàn)在肺部甚至是甲狀腺轉(zhuǎn)移［3-6］，有報(bào)道出現(xiàn)首發(fā)肺轉(zhuǎn)移的大腸癌患者最高可達(dá)患者總數(shù)的6%，已經(jīng)相當(dāng)可觀［7］，這就對我們的隨訪策略提出挑戰(zhàn)，對于大腸癌患者即使術(shù)后沒有肝轉(zhuǎn)移，也不能放松對肺部的檢查。而申請者在前期臨床研究中，通過對本院486例行根治手術(shù)的大腸癌患者資料研究后發(fā)現(xiàn)：主要通過門靜脈系統(tǒng)回流的高位直腸癌和通過體循環(huán)回流的直腸中、低位直腸癌的術(shù)后肺轉(zhuǎn)移率和肝轉(zhuǎn)移率都沒有顯著性差異。由此可見，決定大腸癌的術(shù)后轉(zhuǎn)移模式的因素并非僅僅解剖可以闡釋。近年來研究發(fā)現(xiàn)包括原發(fā)腫瘤的分期，術(shù)前放化療，轉(zhuǎn)移靶器官的微環(huán)境等因素都會(huì)影響大腸癌的轉(zhuǎn)移模式［8-10］，但其確切機(jī)制仍然沒有探明。為搜尋大腸癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移相關(guān)分子靶標(biāo)并評估其作為預(yù)測遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移發(fā)生的潛在分子標(biāo)志物的可能性，我們前期在臨床上收集了6例珍貴的同時(shí)性肝、肺轉(zhuǎn)移分別切除的患者，將其原發(fā)灶、肝、肺轉(zhuǎn)移的組織樣本通過高通量的基因芯片技術(shù)，從全基因表達(dá)譜的角度對這兩種轉(zhuǎn)移組織的基因表達(dá)情況進(jìn)行了全方位的檢測分析（來源于同一患者的組織樣本可以排除個(gè)體遺傳背景的干擾）。我們發(fā)現(xiàn)：有41個(gè)基因在兩種大腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組織中存在顯著性差異（肝轉(zhuǎn)移分子群有27個(gè)，肺轉(zhuǎn)移分子群有14個(gè)），這些分子可能構(gòu)成了驅(qū)動(dòng)大腸癌不同轉(zhuǎn)移模式的分子因素。為進(jìn)一步確認(rèn)芯片的結(jié)果，我們在47例大腸癌肝轉(zhuǎn)移和22例肺轉(zhuǎn)移組織病理樣本中，通過qPCR的方式進(jìn)行了回顧性驗(yàn)證，確認(rèn)了13個(gè)在大腸癌肝轉(zhuǎn)移過程中明顯高表達(dá)的基因（5倍以上），區(qū)別于肺轉(zhuǎn)移，這是一種特異性的表達(dá)改變（見前期工作）。這些肝轉(zhuǎn)移特異的分子標(biāo)志中，有兩個(gè)屬于真核起始因子Z家族的成員：X和Y，引起了我們的研究關(guān)注。Z真核起始因子在真核生物翻譯起始過程中起著重要作用，參與了真核生物翻譯起始過程中的多個(gè)反應(yīng)［11］，但其在腫瘤中的角色功能還尚不十分清楚。我們首先鑒定了Y基因在大腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，并確認(rèn)Y表達(dá)被干擾后，細(xì)胞增殖能力被顯著抑制，處于G1期的細(xì)胞數(shù)量顯減少，處于S期和G2期的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，細(xì)胞凋亡比例顯著提高，細(xì)胞的存活能力顯著下降，克隆形成能力受到顯著抑制。這一結(jié)果已發(fā)表于《XXX》［12］?？紤]到有報(bào)道X與Y之間存在相互結(jié)合［13-14］，我們又進(jìn)一步觀察了兩者之間的交互作用。有意思的是，X對于Y的促惡性增殖功能是必需的，表現(xiàn)在沉默X表達(dá)之后，過表達(dá)Y對大腸癌細(xì)胞的增殖調(diào)控失活。而X本身具有調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的能力，抑制X可顯著降低細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性（見前期工作）。由此，我們提出科學(xué)假設(shè)：真核起始因子X-Y軸能夠調(diào)控大腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生，X可介導(dǎo)細(xì)胞獲得運(yùn)動(dòng)能力，并且在轉(zhuǎn)移灶中調(diào)節(jié)Y發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞繼發(fā)性增殖的作用，具體作用機(jī)制有待闡明。在哺乳動(dòng)物中，Z因子的亞基有8種，按分子量從大到小排列而命名［15］。Z因子參與真核細(xì)胞翻譯過程，而調(diào)節(jié)蛋白合成在維持細(xì)胞生長控制中起重要作用［16］。據(jù)報(bào)道，Z因子不僅能通過促進(jìn)mRNA與40s亞基結(jié)合，而且還可以獨(dú)自與游離的40s亞基結(jié)合，影響40s亞基與60s亞基及其他亞基蛋白的結(jié)合或解離等［17］。Z家族成員一般含有PCI和MPN結(jié)構(gòu)域，這兩類結(jié)構(gòu)域都參與蛋白-蛋白相互作用，部分還具有RNA識別（RNArecognitionmotif，RRM）結(jié)構(gòu)域，可能參與RNA的結(jié)合［15］。除此之外，Z因子還被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控細(xì)胞周期的作用［16,18］。通過調(diào)節(jié)不同類型的mRNA的翻譯起始，Z因子就可以選擇性地調(diào)控蛋白的合成，從而對腫瘤細(xì)胞的生長的轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)控［16,19］。Z家族中部分成員已證實(shí)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，已報(bào)道的包括：A、B、C、D等［18-22］。Y的致癌作用由申請人首先報(bào)道，隨后其在膠質(zhì)瘤和呼吸系統(tǒng)腫瘤中的作用也被其他研究者發(fā)現(xiàn)［12,23-25］。而關(guān)于X與惡性腫瘤的關(guān)系目前還未見文獻(xiàn)報(bào)道，可見在針對X、Y兩個(gè)分子尤其是交互作用方面，申請人尚居于領(lǐng)先的研究地位。更早前，權(quán)威雜志JBiolChem上的報(bào)道提示了X在包含Y蛋白的復(fù)合物與40S核糖體亞基結(jié)合的過程中扮演著關(guān)鍵的鏈接作用，缺失X時(shí)兩者的結(jié)合很不穩(wěn)定，對翻譯起始系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力也會(huì)降低［26］。2013年9月，JBiolChem上又報(bào)道了W可與X競爭性結(jié)合Y［27］，從而形成不同的Z復(fù)合物。Z復(fù)合物負(fù)責(zé)招募tRNA或mRNA，可調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)，繼而影響腫瘤細(xì)胞的生長、遷移等生物學(xué)過程。不同的Z因子蛋白結(jié)合可能存在不同的翻譯調(diào)節(jié)機(jī)制從而執(zhí)行不同功能作用。在近期的研究工作中，申請人對X的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步深入。敲減X后，基因芯片檢測顯示腸癌細(xì)胞中多個(gè)關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)發(fā)生了改變。其中，有3個(gè)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(81,3-GalT;B1,4-GalT-1;81,4-GalT-7)的表達(dá)降低了，這引起了我們的興趣。糖基化作為常見的蛋白翻譯后修飾，參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移、侵襲、免疫應(yīng)答等多種生命活動(dòng)，糖基化紊亂能夠?qū)е露喾N腫瘤的發(fā)生與惡性轉(zhuǎn)化，糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)和活性與包括大腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的惡性化程度相關(guān)［28-29］。Tang等發(fā)現(xiàn)B1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1通過調(diào)節(jié)EGFR影響肝癌細(xì)胞的生長和凋亡［30］。81,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶3通過調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白信號通路影響神經(jīng)細(xì)胞瘤的侵襲能力［31］。此外，半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的激活，可以使細(xì)胞膜上蛋白糖基化程度增加［32］。經(jīng)過進(jìn)一步腸癌細(xì)胞株的體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，X與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶B1,4-GT-1和B1,4-GT1-7的表達(dá)正相關(guān)(見前期工作)，我們推測X對半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的調(diào)節(jié)作用很可能是它在腸癌中介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。原因在于，肝細(xì)胞表面存在一種特異性表達(dá)的抗原：去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoproteinreceptor,ASGPR),又稱半乳糖受體。ASGPR是一種跨膜蛋白，主要表達(dá)于哺乳動(dòng)物肝竇狀隙的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表面，密度很高，每個(gè)細(xì)胞表面可多達(dá)500,000個(gè)受體，其胞外結(jié)構(gòu)域含有糖識別結(jié)構(gòu)域，能識別和結(jié)合半乳糖殘基和N-乙酰半乳糖胺殘基［33］°Misawa等［34］曾經(jīng)用神經(jīng)氨酸酶處理骨髓細(xì)胞(Bonemarrowcell,BMCs),使細(xì)胞膜表面的糖蛋白脫去唾液酸而暴露出半乳糖殘基，利用半乳糖殘基與ASGPR的相互作用使BMCs直接聚集到肝臟。我們相信，真核起始因子X在腸癌肝轉(zhuǎn)移的過程中，可能調(diào)節(jié)下游糖基轉(zhuǎn)移酶，存在一種通過激活腸癌細(xì)胞膜表面半乳糖殘基，從而與肝細(xì)胞膜上特異性受體ASGPR相互作用而使腸癌細(xì)胞“定居”于肝臟的機(jī)制，此后，它又可介導(dǎo)Y的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞克隆化增殖的能力，最終形成肝組織腫瘤轉(zhuǎn)移灶。X-Y調(diào)節(jié)軸對于大腸癌肝轉(zhuǎn)移的內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)理是令人期待的。在前期工作基礎(chǔ)上，本項(xiàng)目擬從大樣本回顧性分析中總結(jié)X-Y對于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的臨床相關(guān)性和預(yù)后判斷價(jià)值。同時(shí)，在細(xì)胞和動(dòng)物模型中進(jìn)一步深入探討其在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移調(diào)控中的作用方式和調(diào)控分子機(jī)制：解析X調(diào)節(jié)半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的方式和作用靶點(diǎn)，明確其介導(dǎo)的信號通路，并確認(rèn)X