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文檔簡介
一種新型毒素azaspiracid的檢測方法
近年來,海洋環(huán)境受到嚴重污染,水體富營養(yǎng)化程度日益嚴重,有害紅芽頻繁在全球范圍內(nèi)爆發(fā)。其中,從有毒紅色潮中釋放的海藻毒素成為污染海洋養(yǎng)殖環(huán)境的新因素,嚴重威脅著水體的食用安全。近10年來,在歐洲沿海地區(qū)頻繁出現(xiàn)一種新毒素Azaspiracid(AZA)引起的中毒事件。2004年,由聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織和政府間海洋委員會共同組建了服務(wù)于漁業(yè)和水產(chǎn)品法典委員會的雙殼軟體生物毒素工作組,將AZA毒素歸為八大類貝類生物毒素之一。據(jù)報道,AZA毒素由原多甲藻(Protoperidiniumcrassipes)產(chǎn)生,其中毒癥狀與腹瀉性貝毒(DiarrheticShellfishPoison,DSP)引起的中毒癥狀非常相似,表現(xiàn)為惡心、嘔吐、嚴重腹瀉和胃腸部痙攣等癥狀。盡管目前中國還未見AZA中毒事件的報道,但是在長江口、大連灣等海域均有多種原多甲藻分布,并且在大亞灣沉積物中曾采集到多種未定種的原多甲藻胞囊。由此推斷,中國海域也存在產(chǎn)生AZA毒素的風險。由于人們對該毒素的認識較晚,有關(guān)其毒性、致毒機理、檢測方法等內(nèi)容的報道較少。因此,本文對現(xiàn)有的文獻報道進行了綜述與歸納,旨在幫助人們對AZA毒素有一個初步的認識,為進一步開展相關(guān)研究提供參考依據(jù)。1原多甲酸毒素的起源和性質(zhì)1.1k系和聚醚類毒素為浮游生物所測1995年11月,荷蘭至少有8人在食用產(chǎn)自愛爾蘭Killary海灣的紫貽貝(Mytilusedulis)后中毒,臨床癥狀表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹瀉和胃腸部痙攣等典型的DSP中毒癥狀。應(yīng)用小鼠腹腔注射測試DSP的方法分析貝樣品,小鼠表現(xiàn)為肢體麻痹、呼吸困難、痙攣等癥狀,嚴重者在35min內(nèi)死亡,但未見有腹瀉癥狀,這與麻痹性貝毒(ParalyticShellfishPoison,PSP)引起的神經(jīng)性中毒癥狀極為相似。但在應(yīng)用色譜方法分析樣品的過程中未檢出PSP,只檢測到低劑量的DSP。鑒于當時在捕撈有毒貝類的海域未發(fā)現(xiàn)已知產(chǎn)毒的浮游生物,因此懷疑是一種新的毒素成分。后來的跟蹤監(jiān)測發(fā)現(xiàn),Killary海灣紫貽貝的毒性一直持續(xù)到次年5月份。1997年10月,在愛爾蘭西北部的Arranmore島發(fā)生了類似的中毒事件,貝類毒性一直持續(xù)到次年4月份。在該毒性物質(zhì)的純化過程中,發(fā)現(xiàn)標有KT3(KillaryToxin-3)的分離組份具有毒性,因此最初人們將該物質(zhì)稱為KT3毒素。經(jīng)分離純化得到的KT3活性成分是一種聚醚類毒素,含氮和獨特的螺環(huán)結(jié)構(gòu),因帶有羧基而呈酸性,因此被命名為Azasprioacid,后來人們一直簡寫為AZA。自AZA化學結(jié)構(gòu)確定之后,人們相繼發(fā)現(xiàn)了它的另外10種衍生物,并在紫貽貝之外的其他雙殼貝類體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了這類毒素,如長牡蠣(Crassostreagigas)、歐洲牡蠣(Ostreaedulis)、大扇貝(Pectenmaximus)、菲律賓蛤仔(Tapesphillipinarium)、鳥蛤(Cardiumedule)等。AZA在貝體內(nèi)的分布不同于DSP,不僅累積在肝胰腺中,在生殖腺和肌肉組織中也有分布。AZA在貝類體內(nèi)的累積沒有明顯的種屬趨向性,但具有明顯的季節(jié)性,在紫貽貝體內(nèi)可累積8個月之久。據(jù)報道,曾發(fā)生AZA中毒事件或貝類染毒的國家主要有愛爾蘭、英國、挪威、荷蘭、法國、西班牙和意大利。由于已知的幾種聚醚類毒素,如DSP、蛤毒素(Pectenotoxin,PTX)、蝦夷扇貝毒素(Yessotoxin,YTX)等都可以由鰭藻(Dinophysisspp.)產(chǎn)生,因此人們最初推斷AZA也是由鰭藻產(chǎn)生。但是,人們在鰭藻中一直未能找到其產(chǎn)生AZA的證據(jù)。后來的研究表明,AZA是由一種原多甲藻(P.crassipes)產(chǎn)生,因此,我們嘗試將Azaspiroacid稱為原多甲藻酸。鑒于原多甲藻在中國海域也有廣泛的分布,這種潛在的風險應(yīng)引起人們的關(guān)注,提前開展一些相關(guān)的研究工作。1.2貝類體的理化性質(zhì)目前已確定化學結(jié)構(gòu)的AZA毒素有11種,它們是一類聚醚氨基酸,含有一個獨特的6,5,6-三螺環(huán)和一個環(huán)胺結(jié)構(gòu),其分子結(jié)構(gòu)如圖1和表1所示。其中AZA1是最常見的類型,在貝體內(nèi)毒素組成中所占比例最高。AZA2和AZA3分別是AZA1的8-甲基和22-脫甲基衍生物,在有毒貝類中也比較常見,同時也存在于浮游植物樣品中。AZA4和AZA5是AZA3的3-羥基和23-羥基衍生物,在貝類體內(nèi)含量很少。AZA6是AZA1的空間異構(gòu)體,AZA7-10是AZA1的羥基化衍生物,AZA11是AZA2的羥基化衍生物,這幾種衍生物在貝類體內(nèi)也有發(fā)現(xiàn),但含量非常少。因此,人們認為AZA1-3是原多甲藻產(chǎn)生的天然產(chǎn)物,AZA4-11是貝類經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物。AZA毒素的理化性質(zhì)明顯區(qū)別于其他含氮生物毒素,在1.0mol/L的乙酸/甲醇溶液或1.0mol/L的氨水溶液中加熱150min后其毒性沒有明顯變化,在冷藏條件下可長期儲存。由此看來,AZA毒素是一類化學性質(zhì)相對穩(wěn)定的化合物。1.3小鼠口服az1的急性毒性反應(yīng)AZA毒素引起的臨床中毒癥狀包括惡心、嘔吐、嚴重腹瀉和胃腸部痙攣等,這與DSP引起的中毒癥狀非常相似,但其毒性高于大田軟海綿酸(Okadaicacid,OA)。據(jù)估算,當攝入AZA1劑量為23μg/人和86μg/人時,致毒概率分別為5%和95%,對人的平均致毒劑量為51.7μg/人。由聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織和政府間海洋委員會聯(lián)合成立的雙殼貝類毒素專家組,初步確定了貝類毒素急性致毒的參考劑量(referencedose,RfD),其中AZA1的RfD值為0.04μg/kg貝組織,遠低于其他貝類毒素(OA的RfD值為0.33μg/kg貝組織)。AZA1、AZA2和AZA3對小鼠腹腔注射致死劑量分別為200μg/kg、110μg/kg和140μg/kg。AZA4和AZA5對小鼠腹腔注射致死劑量分別為470μg/kg和<1000μg/kg。由此看來,AZA1~3毒素的毒性較高,而AZA4~5的毒性相對較低,這可能是由于貝類通過代謝轉(zhuǎn)化作用降低所累積AZA1~3毒素的毒性,從而減輕對自身的毒害作用。有關(guān)AZA的致毒機理,目前還沒有一個明確的說法。小鼠口服AZA1毒素的毒性實驗發(fā)現(xiàn),AZA1可引起肺、胃腸、肝、淋巴組織(胸腺和脾)等多個器官組織受到不同程度的損傷,這些病變在亞致死條件下可在數(shù)月內(nèi)恢復(fù)。在慢性毒性實驗中出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎和小腸絨毛萎縮癥狀,嚴重者出現(xiàn)肺腫瘤細胞發(fā)育。另外發(fā)現(xiàn),AZA1在低濃度(IC50=2.1nmol/L)條件下可降低小鼠脊髓神經(jīng)元的生物電活性,其影響神經(jīng)元突觸傳遞的機制與門控通道無關(guān)。由此看來,向小鼠腹腔注射AZA1后表現(xiàn)出的急性神經(jīng)毒性癥狀雖與PSP中毒相似,但其作用機制完全不同。AZA1對多種細胞具有毒性,毒性大小與時間、濃度有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),AZA1依靠自身特有的ABCDE和FGHI環(huán)結(jié)構(gòu)(如圖1所示)與人神經(jīng)母細胞瘤作用靶點結(jié)合,導致肌動蛋白重排,這一過程不受調(diào)控細胞凋亡的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspases)家族酶活性的影響;AZA1在改變細胞骨架的過程中不改變膜電壓,與OA相比可明顯提高人淋巴細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和胞液Ca2+濃度;另外人T型淋巴細胞對AZA1也非常敏感,壞疽的細胞毒害癥狀隨著與AZA1的接觸而逐漸消退。由此看來,AZA的細胞毒害作用機制與OA是不同的,其通過特殊的結(jié)構(gòu)基團與細胞結(jié)合,具有特定的細胞作用靶點,使得纖維肌動蛋白發(fā)生重排,從而改變細胞骨架,而OA毒素主要是通過抑制蛋白磷酸酶的活性使蛋白發(fā)生超磷酸化所致。人們在研究AZA1~5毒素影響人淋巴細胞內(nèi)Ca2+水平的實驗中已經(jīng)證實AZA的毒性效應(yīng)與其化學結(jié)構(gòu)有關(guān),不同衍生物引起的效應(yīng)差別較大。2甲基丙烯酸的檢測方法2.1小鼠的行為結(jié)果az會發(fā)生假陰性的情況對于原多甲藻酸這類新型毒素,目前還缺少標準化的生物測試方法。最初人們借鑒小鼠腹腔注射測試貝類DSP的方法分析AZA毒素,取貝類消化腺,應(yīng)用丙酮提取毒素,統(tǒng)計小鼠死亡時間進行定量。但由于AZA在貝類體內(nèi)廣泛分布,消化腺內(nèi)的毒素只占0~40%,因此分析結(jié)果會產(chǎn)生假陰性。另外,小鼠腹腔注射AZA后產(chǎn)生明顯的神經(jīng)性中毒癥狀,按照DSP中毒致死的統(tǒng)計結(jié)果進行定量分析是不可靠的。目前在荷蘭和歐盟的官方控制立法程序中比較認可小鼠口服測試AZA的結(jié)果。將貝類樣品與食物混合后投喂預(yù)先饑餓的小鼠,觀察其16h內(nèi)的排泄情況,結(jié)合小鼠糞便和食物殘留量進行半定量分析。在AZA毒素的生物測試方法中,迄今該方法是最好的半定量分析手段,被人們廣泛應(yīng)用。另外,人們基于AZA特有的細胞毒性選擇肝胚細胞瘤細胞系HepG2(CRL-10741)和膀胱癌細胞(ECV-304)作為測試對象,用毒素提取液培養(yǎng)細胞,初步建立了AZA的細胞毒性測試方法。依據(jù)細胞形態(tài)學變化的差異,該方法可以區(qū)別DSP和AZA毒素。不過,細胞毒性測試AZA的方法還很不成熟,有待于進一步完善。2.2流動相質(zhì)譜或離子床質(zhì)譜由于AZA毒素在波長大于210nm的范圍缺少特征吸收峰,目前還未見有液相色譜分析AZA的報道。但隨著液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)的不斷完善和LC-MS在毒素分析領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,人們逐步建立了LC-MS分析AZA的方法[13,25,26,27,28,29]??偟膩碇v,液相色譜分離部分可選擇C18反相色譜柱,如Luna-2(150mm×2.0mm,3μm);選擇含三氟乙酸和乙酸銨緩沖溶液的乙腈水溶液作為流動相,如65%(v/v)乙腈水溶液(含0.05%三氟乙酸和0.004%乙酸銨);應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜或離子阱質(zhì)譜的選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式,檢測AZA的質(zhì)子化離子[M+H]+經(jīng)碰撞裂解后的脫水化合物離子[M+H-nH2O]+(脫水分子數(shù)n為1~3),可獲得較高的靈敏度和精密度,檢出限為5~40pg(S/N=3)。近年來,Lehane等應(yīng)用三級質(zhì)譜對[M+H]+和[M+H-H2O]+誘捕和裂解,監(jiān)測[M+H-2H2O]+以及AZA毒素A環(huán)裂解后的[M+H-H2O-C9H10O2R1R3]+離子,建立了快速檢測AZA毒素的方法,同時檢測AZA1~1010種毒素可在7min內(nèi)完成,檢出限為5~20pg(S/N=3)。對于毒素的提取,研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用固相萃取方法可以得到較好的回收率和重現(xiàn)性。由此看來,應(yīng)用LC-MS技術(shù)可以快速、準確地定量分析貝類中的AZA毒素,但由于儀器比較昂貴,難以普及,大大限制了有關(guān)AZA毒素研究工作的開展。3.加強az毒素的監(jiān)測,提高檢測能力目前,原多甲藻酸導致的人中毒和貝類染毒事件在歐洲沿海國家頻繁發(fā)生。盡管目前中國還未見水產(chǎn)品中含有AZA毒素的報道,但這并不能說明中國的水產(chǎn)品在這方面的生物毒性是絕對安全的。一方面,中國的貝類養(yǎng)殖數(shù)量位居海水養(yǎng)殖五大漁業(yè)類群的首位,貝類產(chǎn)量占漁業(yè)總產(chǎn)量的40.7%。如此大的養(yǎng)殖強度和規(guī)模也造成了海水養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化,養(yǎng)殖水域水體富營養(yǎng)化問題日趨嚴重,赤潮頻繁發(fā)生。另一方面,中國海域分布有許多未定種的原多甲藻,對其產(chǎn)毒與否人們還未做過檢測,并且隨著世界貿(mào)易的頻繁往來,物種入侵現(xiàn)象已比較普遍,產(chǎn)毒藻的入侵風險較高。第三,目前中國對水產(chǎn)貝類中生物毒素的監(jiān)測力度還遠遠不夠,缺少對AZA
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