念珠菌等酵母菌的分類鑒定

念珠菌(Candida)等酵母菌

的分類和鑒定1精選課件什么是酵母菌?Yeastsarefungiwithvegetativestatesthatpredominantlyreproducebybuddingorfission,resultingingrowththatiscomprisedmainlyofsinglecells,andwithsexualstatesthatarenotenclosedinfruitingbodies.酵母菌是主要以單細(xì)胞形式存在的真菌，以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無(wú)性繁殖，有性生殖階段不產(chǎn)生子實(shí)體。2精選課件致病酵母菌引起的癥狀及其生境3精選課件酵母菌分類95屬，723種(TheYeats,aTaxonomicStudy,4thedn.,1998)AccomycetousYeasts(子囊菌酵母)Ascomycota “Archiascomycetes” Schizosacchromycetales Taphrinales Protomycetales Pneumocystidales Euascomycetes Saccharomycetales (11families)4精選課件BasidiomycetousYeasts(擔(dān)子菌酵母)Teleomorphictaxa

I.With“simple”septalpores

A.Basidiacylindric,transverselyseptate

Ustilaginales Sporidiales Platygloeales Septobasidiales Atractiellales Agaricostilbales

B.Basidiaglobose,nonseptate

Graphiolales

C.Basidiacylindric,nonseptate

Cryptobasidiales Exobasidiales5精選課件BasidiomycetousYeasts(擔(dān)子菌酵母)Teleomorphictaxa II.Withdoliporesepta,parenthesomecupulate A.Bsidia“cruciate-septate”

Tremellales B.Basidiaaseptate

FilobasidialesAnamorphictaxa

Sporobolomycetaceae Cryptococcaeae6精選課件傳統(tǒng)分類方法

I.形態(tài)特征

酵母菌的細(xì)胞形態(tài)及無(wú)性繁殖方式SaccharomycescerevisiaeSaccharomycesparadoxusSaccharomycespastorianus7精選課件單極芽殖(monopolarbudding)：細(xì)胞只在一端出芽二極芽殖(bipolarbudding)：出芽只局限于母細(xì)胞相對(duì)的兩端多邊芽殖(multilateralbudding)：出芽發(fā)生于細(xì)胞上的多個(gè)位點(diǎn)裂殖(fission)：細(xì)胞以橫裂的方式進(jìn)行增殖A.無(wú)性繁殖方式abcd8精選課件酵母菌細(xì)胞掃描電鏡照片，示芽殖細(xì)胞(B)和芽痕(箭頭)9精選課件無(wú)性繁殖方式節(jié)孢子Arthrospores擲孢子Ballistospores10精選課件B.酵母菌的有性繁殖子囊菌酵母

a.非結(jié)合子囊：雙倍體的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為子囊，如Saccharomyces中的種b.結(jié)合子囊：兩個(gè)單倍體營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞結(jié)合發(fā)生質(zhì)配和核配，產(chǎn)生雙倍體子囊細(xì)胞bbbaB.子囊孢子11精選課件擔(dān)子菌酵母的有性繁殖雙核菌絲的形成擔(dān)子菌酵母的有性階段萌發(fā)的冬孢子(teliospore)產(chǎn)生擔(dān)孢子的擔(dān)子12精選課件C. 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征酵母菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞可呈球形、亞球形、橢圓形、卵形、圓柱形、臘腸形、瓶狀、桿狀、檸檬形、S曲線形、半月形或三角形等各種形狀。營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的形狀可反映無(wú)性繁殖方式，有時(shí)也是屬或種的特征，如瓶狀細(xì)胞是采取單端芽殖的Malassezia屬的特征，檸檬形細(xì)胞的繁殖方式往往是兩端芽殖，三角形細(xì)胞是三角酵母屬(Trigonopsis)的特征，而Metschnikowialunata和Candidapeltata兩個(gè)種的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞多呈半月形。13精選課件D. 菌落形態(tài)特征液體培養(yǎng)基中的形態(tài)底部有無(wú)沉淀及其質(zhì)地，表面有無(wú)膜醭或島狀醭及其質(zhì)地，有無(wú)菌環(huán)固體培養(yǎng)基上的形態(tài)a.菌落質(zhì)地：是否為奶酪狀，粘液狀，松脆狀或堅(jiān)韌狀。b.菌落顏色：常為乳白色或奶油色，但注意是否有黃色，橙色，綜色或紅色等色調(diào)。c.菌落表面特征：是否返光或暗淡，是否平滑或粗糙，有無(wú)紋狀，皺拆或疣狀突起。d.菌落邊緣：是否平滑(全緣)，波浪狀、蝕刻狀，根狀或流蘇狀。14精選課件E. 菌絲形成有些酵母菌在進(jìn)行芽殖時(shí)，芽細(xì)孢在與母細(xì)胞脫離之前連續(xù)芽殖，形成絲狀體，這種由細(xì)胞連續(xù)芽殖而形成的菌絲稱為假菌絲(pseudohyphae)。有些酵母菌還可形成具分隔的真菌絲，真菌絲是由頂端細(xì)胞不斷生長(zhǎng)并產(chǎn)生分隔形成的。在形態(tài)上假菌絲與真菌絲的區(qū)別主要為：真菌絲的分隔較直，在分隔處沒(méi)有縊縮或縊縮不明顯，頂細(xì)胞往往長(zhǎng)于后面的細(xì)胞，而假菌絲的分隔只是兩個(gè)細(xì)胞的交接點(diǎn)，彎曲且有明顯的縊縮，頂端細(xì)胞一般不會(huì)長(zhǎng)于后面的細(xì)胞。15精選課件II.生理生化特征1.糖類化合物的發(fā)酵

葡萄糖(glucose) 半乳糖(galactose) 蔗糖(sucrose) 麥芽糖(maltose) 乳糖(lactose) 棉子糖(raffinose)2.碳源化合物的同化

六碳糖：半乳糖，L-山梨糖(sorbose)；

五碳糖：D-木糖(xylose)，L-阿拉伯糖(arabinose)，D-阿拉伯糖，D-核糖(ribose)，L-鼠李糖(rhamnose) 雙糖：蔗糖，麥芽糖，纖維二糖(cellobiose)，海藻糖(trehalose)，乳糖，密二糖(melibiose)；

三糖：棉子糖，松三糖(melezitose)；

多糖：可溶性淀粉；

醇類：赤蘚糖醇(erythritol)，核糖醇(ribitol)，D-甘露醇(mannitol)，肌醇(inositol)，甘油(glycerol)， 半乳糖醇(galactitol)，D-山梨醇(sorbitolorglucitol)；

有機(jī)酸：琥珀酸(succinicacid)，檸檬酸(citricacid)，DL-乳酸(lacticacid)；

糖苷：楊梅苷(salicin)。

16精選課件3.氮源化合物的同化

硝酸鹽(nitrate) 亞硝酸鹽(nitrite) 鹽酸乙胺(ethylamine.HCl)， 二鹽酸尸胺(cadaverine.2HCl) L-賴氨酸(L-Lysine) 肌酸(creatine) 肌酸酐(creatinine)

4.在無(wú)維生素培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況測(cè)試5.溫度試驗(yàn)

能否在37oC下生長(zhǎng)是酵母菌分類中一個(gè)很重要的特征 35oC、40oC下的生長(zhǎng)能力也經(jīng)常用到 最高生長(zhǎng)溫度17精選課件III.化學(xué)分類特征輔酶Q(CoQ，泛醌)分子類型 Q-6~Q-10，屬內(nèi)一致性18精選課件化學(xué)分類特征細(xì)胞壁(或全細(xì)胞)水解液?jiǎn)翁墙M成木糖Xylose19精選課件IV.超微結(jié)構(gòu)—細(xì)胞壁和芽殖方式Ascomycete-typeBasidiomycete-type20精選課件超微結(jié)構(gòu)—隔膜(A)Ascomycetetype(B)Basidiomycetetype(C)Basidiomycetetype21精選課件V.分子分類和分子系統(tǒng)學(xué)DNA堿基組成(DNABaseComposition)

屬內(nèi)差異多在10%以內(nèi)種內(nèi)差異1.0-1.5%(浮力密度法)或2.0-2.5%(熱變性法)

DNA-DNA同源性

(DNA-DNAHomology)一對(duì)菌株的變性總DNA之間雜交復(fù)性的程度和穩(wěn)定性，通常以相對(duì)結(jié)合百分率表示

種內(nèi)：>70%

變種間：40-60%

種間：<40%脈沖電泳核型分析22精選課件核型(Karyotype)：真核細(xì)胞的染色體組成，包括 染色體數(shù)目、大小、形態(tài)結(jié)構(gòu)等人類細(xì)胞染色體真菌細(xì)胞染色體23精選課件脈沖電泳(Pulsed-FieldGelElectrophoresis,PFGE)的原理及優(yōu)勢(shì)原理：電場(chǎng)不斷改變,迫使DNA分子的泳動(dòng)方向做相應(yīng)的改變。小的DNA分子比大的變形快，故前者比后者泳動(dòng)速度快，從而將不同大小的DNA分子分開(kāi)。優(yōu)勢(shì)：分辨率可達(dá)10,000Kb(10Mb)以上E1E224精選課件YeastcellsProtoplastsAgaroseplug+++

+-

-

-

-+

+

+

++

+

+

++

+

+++

+

++ChromosomesKb #2,200 XII1,600 IV1,125 XV,VII1,020 XVI945 XIII825 II785 XIV750 X680 XI610 V565 VIII450 IX365 III285 VI225 ISaccharomycescerevisiaeCHEFelectrophoresis Ethidiumbromidestainedgel25精選課件YNN295CBS2030TCBS7099TJCM9569TCBS5256TJCM9396TAS2.1678TCBS2022TAS2.1681CBS5265TKb220016001125680450

225ElectrokaryotypesoftheSixGroupsintheC.guilliermondiiComplexGroup:IIIIIIIVVVIBaietal.2000.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.50:417-422.26精選課件DNA(或RNA)特定區(qū)段的堿基序列測(cè)定和比較18S5.8SITS226SITS1D1/D2分子系統(tǒng)學(xué)：DNASequencing27精選課件用于分子系統(tǒng)學(xué)研究的基因或DNA區(qū)段選擇應(yīng)符合下列要求：適當(dāng)?shù)难莼俾?；單拷貝或至少以單拷貝的方式演化；在所有分類群中具有相同的功能；了解或可檢測(cè)其堿基組成和密碼子偏好。28精選課件真菌分子系統(tǒng)學(xué)研究常用基因和DNA區(qū)段細(xì)胞核rRNA基因(rDNA)及其間非編碼區(qū)SmallSubunit(SSU)rDNA(18S)LargeSubunit(LSU)rDNA(26S,28S)InternalTranscribedSpacer(ITS)IntergenicSpacer(IGS)蛋白編碼基因

-tublingene

elongation

factor-1α(EF-1α)RNApolymeraseII等等線粒體mitochondrial(mt)DNAmtSSUandLSUrRNAgenesmitochondrialcytochrome

b(cytb)cytochrome

oxidaseIand

II(COXI,COXII)等等SSU5.8SITS2LSUITS1D1/D2

IGS2IGS15S29精選課件GenBank/EMBL/DDBJ核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的真菌分子系統(tǒng)學(xué)研究常用基因序列條數(shù)(截至2005年底)NucleicrRNAGenesMitochondrialGenesProteinGenes30精選課件DNA序列數(shù)據(jù)處理及系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建序列片段聯(lián)接和正反鏈校正常用軟件 Lasergene(DNAStar)(/)DNASIS

(/uk/dnasis.html)Sequencher(/)BioEdit(免費(fèi)軟件,http:///BioEdit/bioedit.html)

從國(guó)際核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank/DDBJ/EMBL)中搜索(BLAST)和下裁同源序列多序列對(duì)位排列(align)常用軟件ClustalW或ClustalX(免費(fèi)軟件)

(http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/Top.html)系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建31精選課件自動(dòng)DNA序列測(cè)序儀測(cè)出的DNA序列圖譜32精選課件匹配排列(align)之前的一組18SrDNA序列33精選課件匹配排列(align)之后的同一組18SrDNA序列34精選課件系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建、檢驗(yàn)和顯示分析方法Distancemethods(距離法)UPGMA(unweightedpairgroupmethodwitharithmeticmeans)Fitch-MargoliashNeighbor-joiningDiscretecharactermethods(獨(dú)立元素法)ParsimonyMaximumlikelihood常用軟件Phylip

(免費(fèi)軟件包http:///phylip.html)PAUP*(/PAUP)ClustalX(內(nèi)含Neighbor-joining分析程序)檢驗(yàn)方法Bootstrapping系統(tǒng)樹(shù)顯示(常用軟件)N-JPlot(免費(fèi)軟件

http://pbil.univ-lyon1.fr/software/njplot.html)TreeView

(免費(fèi)軟件

http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html)35精選課件系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析與分類群界定Monophyleticgroups(單源類群)：來(lái)源于同一個(gè)祖先。Paraphyleticgroups(近源類群)：只包含部分來(lái)源于同 一個(gè)祖先的后代。Polyphyleticgroups(異源類群)：來(lái)源于一個(gè)以上的祖先。36精選課件子囊菌酵母的系統(tǒng)學(xué)地位及與其他子囊菌的親緣關(guān)系*FromBerbee&Taylor,199937精選課件基于rRNA基因序列分析的酵母菌物種鑒別rDNAsequencing500-600bp500-600bpD1/D2或ITS序列種內(nèi)堿基差異:

<1%(5-6bases)SSU5.8SITS2LSUITS1(D1/D2)38精選課件幾乎所有已知酵母菌種模式菌株的26SrDNAD1/D2區(qū)和大多數(shù)種模式菌株的ITS序列已經(jīng)被測(cè)定和公布，使酵母菌的分類鑒定更加快捷和準(zhǔn)確。39精選課件StrainCY-0126SrDNAD1/D2DomainSequence(partial)40精選課件BLAST：Identities=100%41精選課件BLAST:Identities=93%42精選課件念珠菌的分類CandidaBerkhout細(xì)胞球形,橢園型,卵形,柱形或長(zhǎng)形,罕見(jiàn)尖頂形,三角形,梭形或瓶形；假菌絲和分隔菌絲可產(chǎn)生，節(jié)孢子和擲孢子不產(chǎn)生。無(wú)性繁殖方式為全壁芽殖型的多邊芽殖。細(xì)胞壁在透射電鏡(TEM)下為雙層結(jié)構(gòu)。類淀粉化合物不存在。DBB反應(yīng)陰性。細(xì)胞壁水解液中不存在木糖,鼠李糖和巖藻糖。163種inTheYeasts,aTaxonomicStudy,4thedn.,199843精選課件常見(jiàn)臨床念珠菌的鑒定常見(jiàn)致病念珠菌種類C.albicansC.dubliniensisC.glabrataC.guilliermondiiC.kruseiC.lusitaniaeC.parapsilosisC.pseudotropicalisC.rugosaC.stellatoideaC.tropicalis感染類型鵝口瘡(thrush)關(guān)節(jié)炎(arthritis)骨髓炎(osteomyelitis)心內(nèi)膜炎(endocarditis)內(nèi)眼炎(endophthalmitis)腦膜炎(meningitis)真菌血癥(candidemia)44精選課件念珠菌感染的變化趨勢(shì)念珠菌血液感染(Candidemia)致病菌1960s–1970s, C.albicans, 85-90%1988–1992, C.albicans, 42% C.tropicalis, 18% C.parapsilosis, 17% C.glabrata, 11%

C.krusei, 4%DatafromAbi-Said,D.etal.,199745精選課件API20CAUXC.albicans的鑒定厚垣孢子芽管46精選課件Candidaalbicans；Candidatropicalis；Candidakrusei靈敏度和特異性 >90-95%其他種靈敏度和特異性低Odds,F.C.&Bernaerts,R,1994CHROMagarCandida顯色培養(yǎng)47精選課件Grownfor48honCHROMagarCandidaat37oC.(A)C.glabrata.(B)C.parapsilosis.(C)C.albicans.(D)Geotrichumsp.Odds,F.C.&Bernaerts,R,199448精選課件Grownfor48honCHROMagarCandidaat37oC.(E)C.tropicalis.(F)Trichosporonsp.(G)C.krusei.(H)C.norvegensis.Odds,F.C.&Bernaerts,R,199449精選課件臨床念珠菌種在CHROMagarCandida培養(yǎng)基上的菌落特征種名菌落特征顏色形態(tài)C.albicans綠色中等大小,光滑,凸起,奶油狀C.dubliniensis綠色中等大小,光滑,凸起,奶油狀C.famata粉紅至淡紫色中等大小,光滑,凸起,奶油狀C.glabrata深藍(lán)紫色中小菌落,光滑,凸起,奶油狀C.guilliermondii粉紅至淡紫色中等大小,光滑,凸起,奶油狀C.inconspicua粉紅至淡紫色,邊沿淡菌落扁平,粗糙C.kefyr粉紅至淡紫色,常中心深菌落大,粗糙C.krusei粉紅,邊沿淡中大菌落,扁平,粗糙C.lusitaniae粉紅至淡紫色似蠟狀C.norvegensis象牙色至粉紅色菌落大,粗糙C.parapsilosis象牙色、粉紅色至淡紫色中小菌落,光滑至皺褶C.rugosa淡藍(lán)綠色,邊沿淡中至大菌落,扁平C.tropicalis鐵青色(中度灰藍(lán)色),具紫色暈環(huán)中等大小,光滑,凸起,奶油狀50精選課件都柏林念珠菌Candidadubliniensis的建立Sullivan等1995年建立和描述原始研究菌株：非典型白念珠菌，主要分離自HIV攜帶者和AIDS病人口腔，厚垣孢子和芽管形成陽(yáng)性。屬于C.albicansserotypeA，碳水化合物同化類型不典型。DNAFingerprinting表明具有獨(dú)特基因型，并得到RAPD和核型分析的支持。rDNA序列分析最終確定這些非典型白念代表一個(gè)與白念近緣的獨(dú)立種。Sullivan,D.Jetal.1995.Candidadubliniensis

sp.nov.:phenotypicandmolecularcharacterisationofanovelspeciesassociatedwithoralcandidosisinHIVinfectedindividuals.Microbiology141:1507–1521.51精選課件C.dubliniensis和C.albicans

的致病性差異流行病學(xué)研究表明C.dubliniensisHIV攜帶者和AIDS病人中為世界性分布。與C.albicans不同，C.dubliniensis

很少發(fā)現(xiàn)于健康人群的口腔中。很少引起念珠菌念珠菌血癥

(candidemia):C.dubliniensis,2%C.albicans,65%52精選課件Candidadubliniensis的鑒別CHROMagarCandidaC.albicans:

lightblue-green(淡藍(lán)綠色).C.dubliniensis:

darkgreen(深綠色)(只可用于鑒別從臨床標(biāo)本新分離的

C.dubliniensis菌株)Growth45oCC.albicans:positiveC.dubliniensis:negativeStaibagar:C.dubliniensis:形成粗糙菌落和大量厚垣孢子C.albicans:形成光滑菌落，不產(chǎn)生厚垣孢子StaibP&MorschhauserJ.Mycoses42:521-524,1999.53精選課件近平滑念珠菌Candidaparapsilosis分類最新進(jìn)展應(yīng)用下列方法，C.parapsilosis

菌株可被分為三個(gè)明顯不同的組：GroupsI,IIandIII.

RAPDMultilocusenzymeelectrophoresisITSsequencesDNArelatednessMorphotypingMitochondrialDNAsequencedifferencesDNAtopoisomeraseIIgenesequencesOligonucleotideprobefingerprintingMultilocussequencetyping(MLST)rRNAD1/D2domain重新分類：將三個(gè)組分為三個(gè)不同的種GroupI,Candidaparapsilosis

(近平滑念珠菌)GroupII,Candidaorthopsilosis

(擬平滑念珠菌)GroupIII,Candidametapsilosis

(似平滑念珠菌)TavantiAetal.JClinMicrobiol43:284-292,2005.54精選課件Unrootedradialtreeshowingnearest-neighborclusteringofsequencepolymorphismdataforCOX3,SADH,andSYA1genes.55精選課件Phylogeneticneighbor-joiningtreegeneratedfromageneticsimilaritymatrixbasedoncomparisonofITS1sequences.56精選課件白念珠菌的基因型(分子分型或分子指紋)分析MultilocusEnzymeElectrophoresis(MLEE)RestrictionFragmentLengthPolymorphism(RFLP)withoutHybridizationProbesRFLPwithHybridizationProbesRandomAmplifiedPolymorphicDNA(RAPD)andRelatedPCR-BasedFingerprintingElectrophoretic

KaryotypingSequencingasaBasisforDNAFingerprinting57精選課件Examplesofstarchgelelectrophoresispatternsoftwoenzymes,mannose-6-phosphateisomerase(MPI)(A)andhexokinase(HK)(B),usedinanMLEEanalysisofC.albicansisolates.PujolCetal.1997.JClinMicrobiol35:2348-2358.58精選課件ExamplesofRAPDpatternswiththeprimersOPE-3(A)andOPE-18(B)fordifferentC.albicansisolates.PujolCetal.1997.JClinMicrobiol35:2348-2358.59精選課件ExamplesofSouthernblothybridizationpatternsgeneratedwiththecomplexprobesCa3ofC.albicans(A),Ct14ofC.tropicalis(B),Cg6ofC.glabrata(C),andCd25-1ofC.dubliniensis(D).60精選課件Image-processingandanalysiscapabilitiesofacomputer-assistedDNAfingerprintanalysisProgram(Soll,2000)61精選課件Image-processingandanalysiscapabilitiesofacomputer-assistedDNAfingerprintanalysisProgram(Soll,2000)62精選課件ModelsoftheclustersidentifiedindendrogramsofcollectionsofisolatesfromNorthAmerica