檸檬疫霉的分離鑒定及藥劑篩選

檸檬疫霉的分離鑒定及藥劑篩選

杏仁（lin.）burm。f.它是玉科柑橘屬的一種多年生果樹(shù)。檸檬栽培主要分布在熱帶和亞熱帶國(guó)家和地區(qū)。中國(guó)是檸檬栽培的起源地之一,栽培歷史已有1000余年,分布在中國(guó)臺(tái)灣、四川、云南、重慶、廣東、廣西、福建、浙江等地。檸檬營(yíng)養(yǎng)豐富,富含維生素C、維生素H、維生素E和K、P、Ca、Mg等多種礦物質(zhì)及微量元素,鮮果可直接沏水飲用,又可用于加工檸檬汁、檸檬油以及橙皮苷、果膠等。近年來(lái),隨著人民生活水平的提高以及對(duì)檸檬的逐步認(rèn)識(shí),檸檬已成為深受消費(fèi)者歡迎的果品,鮮果和加工品供不應(yīng)求。2010年,云南瑞麗檸檬產(chǎn)區(qū)檸檬苗出現(xiàn)了一種新的病害,嚴(yán)重影響了檸檬種苗的健康生產(chǎn)。該病害主要危害檸檬苗的嫩葉、嫩莖和嫩梢,有時(shí)也危害已老熟的葉片和枝梢。主要表現(xiàn)為莖腐、葉斑及枝梢枯等,生產(chǎn)上易誤認(rèn)為急性炭疽病和苗木莖枯病。據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn),高溫高濕的氣候條件非常有利于該病的發(fā)生和擴(kuò)散,并且該病的發(fā)生和危害給云南瑞麗檸檬苗的繁育工作造成了較大的損失。筆者采集檸檬苗病株,進(jìn)行病原菌的分離和鑒定工作,并進(jìn)行室內(nèi)殺菌劑的篩選,以期明確引起該病害的病原菌,為該病害的防治提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1病原菌分離鑒定2010年6月從瑞麗市檸檬育苗基地采集帶病的葉片和莖稈作為病原菌分離鑒定材料。病原菌的分離鑒定,以及室內(nèi)殺菌劑篩選均在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。1.1.2分散粒劑及劑量共7種殺菌劑:64%噁霜·錳鋅可濕性粉劑(先正達(dá)投資有限公司上海分公司)、72%錳鋅·霜脲可濕性粉劑(美國(guó)杜邦公司)、68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑(先正達(dá)投資有限公司上海分公司)、50%烯酰嗎啉可濕性粉劑(德國(guó)巴斯夫)、68.75%氟吡菌胺·霜霉威懸浮劑(德國(guó)拜耳作物科學(xué)公司)、80%代森錳鋅可濕性粉劑(南通德斯益農(nóng)化有限公司)、77%硫酸銅可濕性粉劑(西班牙艾克威化學(xué)有限公司)。1.2方法1.2.1李河水系基地山水平均氣溫發(fā)病的檸檬育種基地處于德宏州瑞麗市幫孔,瑞麗市屬典型的南亞熱帶氣候類型,海拔980m,年平均氣溫20.5℃,日照時(shí)數(shù)2326h,有效積溫7291℃,全年降雨量1400mm左右。該基地地勢(shì)低洼,在多雨季節(jié)易出現(xiàn)積水。2010年6月,分3次對(duì)檸檬苗地的發(fā)病情況觀察,記錄發(fā)病癥狀,發(fā)病率。1.2.2病葉、莖、干的制備用自來(lái)水沖洗罹病組織后,將病組織表面的水分晾干,從病健交界處切取約5mm×5mm的小塊(分別取病葉和莖),經(jīng)75%乙醇、升汞依次消毒,再用滅菌水漂洗多次后,移入加抗生素的燕麥培養(yǎng)基上,分別放入18℃和28℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從新長(zhǎng)出菌落邊緣挑取菌絲移入新制備的培養(yǎng)基中進(jìn)行純培養(yǎng)。1.2.3葉-瓊物培養(yǎng)基的制備黑麥-番茄汁培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基和水瓊脂培養(yǎng)基的制備,參見(jiàn)楊艷麗等培養(yǎng)基的制備方法。檸檬葉-瓊脂培養(yǎng)基制備:采集健康無(wú)污染、無(wú)農(nóng)藥殘留的檸檬葉片,將葉片剪成長(zhǎng)5mm左右的方形小塊,放在70℃的干燥箱中1~2h,直至葉片烘脆,再用紫外線滅菌法滅菌30min。把滅菌的葉片放在滅菌的培養(yǎng)皿中,然后倒入滅菌并冷卻至50℃的瓊脂培養(yǎng)基,制成檸檬葉-瓊脂培養(yǎng)基。1.2.4供試菌株的培養(yǎng)取健康的檸檬苗葉片,用清水洗凈,并用75%乙醇消毒表面后,分別進(jìn)行刺傷與無(wú)刺傷2種接種處理,將供試菌株配成孢子囊濃度為4×103個(gè)/mL的孢子囊懸浮液,取25μL分別接種于葉背和葉片正面,以接種滅菌水的葉片為對(duì)照。在室溫(28~32℃)下保濕培養(yǎng)4d,記錄發(fā)病情況。1.2.5芽孢桿菌的分離純化觀察菌落生長(zhǎng)情況,顯微鏡檢查孢囊梗、孢子囊的形態(tài),測(cè)定孢子囊大小,乳突大小,觀察孢子囊脫落特征等特性,依據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)描述的形態(tài)特征及寄主范圍,對(duì)分離純化得到的菌株進(jìn)行鑒定。1.2.6生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定。在無(wú)菌操作條件下,將供試的7種藥劑分別設(shè)置4個(gè)稀釋濃度。稀釋倍數(shù)分別設(shè)為600、800、1000倍液和1500倍液。用滅菌水將供試藥劑稀釋成試驗(yàn)所需濃度的母液,分別取200μL加到燕麥培養(yǎng)基中攤平。用無(wú)菌接種針將菌絲挑到含藥培養(yǎng)基中央。設(shè)加滅菌水的燕麥培養(yǎng)基為空白對(duì)照。7種藥劑和空白對(duì)照共29個(gè)處理,每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。放于28℃下培養(yǎng)3d,用“十字交叉法”測(cè)量供試菌株在含不同藥劑的培養(yǎng)基上的菌落直徑,與對(duì)照進(jìn)行比較,計(jì)算藥劑處理的菌絲擴(kuò)展的生長(zhǎng)抑制率:生長(zhǎng)抑制率(%)=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑]×100;用抑制生長(zhǎng)百分率換算成幾率值,濃度轉(zhuǎn)換成濃度對(duì)數(shù)。以濃度對(duì)數(shù)為自變量x,以幾率值為變量y,并通過(guò)求出濃度與抑菌率間回歸系數(shù)b,相關(guān)系數(shù)R和常數(shù)項(xiàng)a,建立毒力回歸方程y=a+bx,從毒力回歸方程分別求出每個(gè)藥劑的抑制中濃度EC50。2結(jié)果與分析2.1擴(kuò)展葉片的病斑檸檬苗期疫病主要發(fā)生在檸檬苗的嫩葉、嫩莖和嫩梢,有時(shí)危害老熟的葉片和枝梢。主要表現(xiàn)為葉斑和枝梢枯。檸檬苗疫病大部分是從頂梢或莖中部先感染發(fā)病,后由上往下擴(kuò)展或從葉尖、葉緣向內(nèi)發(fā)展,也有部分葉片在中間產(chǎn)生病斑,向周圍擴(kuò)展。葉片受害初期時(shí)出現(xiàn)水漬狀病斑,隨后迅速擴(kuò)展成近圓形或不規(guī)則形病斑,如開(kāi)水燙傷狀,顏色也迅速轉(zhuǎn)變?yōu)闇\褐色至褐色。陰雨潮濕時(shí),病斑擴(kuò)展極快,病斑面積占葉片面積的20%~80%,2~4d植株的感病葉片全部落光。病斑可擴(kuò)展至嫩梢基部,使整個(gè)新梢或整株幼苗變深褐色枯死,氣候濕潤(rùn)時(shí)莖腐爛。檸檬苗圃的發(fā)病率一般為5%~20%,有的達(dá)40%~60%,氣候適宜時(shí)甚至高達(dá)90%以上,見(jiàn)圖1。2.2培養(yǎng)基上植物的生長(zhǎng)黑麥-番茄汁培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基、水瓊脂培養(yǎng)基和檸檬葉片-瓊脂培養(yǎng)基等4種培養(yǎng)方式中,燕麥培養(yǎng)基上的氣生菌絲長(zhǎng)度中等,無(wú)孢子囊和厚垣孢子產(chǎn)生;黑麥-番茄汁培養(yǎng)基上的菌絲較長(zhǎng),有少量孢子囊和厚垣孢子產(chǎn)生;檸檬葉片-瓊脂培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)稍慢,有孢子囊和厚垣孢子生成;水瓊脂培養(yǎng)基上則菌絲生長(zhǎng)較慢或幾乎不生長(zhǎng)。在4種培養(yǎng)基上菌絲的生長(zhǎng)速度依次為:燕麥培養(yǎng)基>黑麥-番茄汁培養(yǎng)基>檸檬葉片-瓊脂培養(yǎng)基>水瓊脂培養(yǎng)基。2.3芽孢桿菌生長(zhǎng)情況從采集的檸檬苗上分離得到23個(gè)菌株,其中,葉片上分離得到13個(gè),莖上分離得到10個(gè),這23個(gè)菌株的菌落形態(tài)和菌絲較一致。在燕麥培養(yǎng)基上,病菌的菌落呈放射狀,氣生菌絲較少或中等,邊緣明顯。顯微鏡下觀察,病菌的菌絲無(wú)色,無(wú)隔膜,菌絲形態(tài)簡(jiǎn)單,單軸分枝或不分枝,菌絲較細(xì),少數(shù)菌絲成不規(guī)則膨大。菌絲生長(zhǎng)最低溫度為16℃,18℃培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)較緩慢,24℃~28℃為最適溫度,28℃下培養(yǎng)菌絲第5天就可以長(zhǎng)滿直徑為90mm的培養(yǎng)皿,菌絲生長(zhǎng)最高溫度可達(dá)30℃。挑取在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌絲,用滅菌水漂洗4次,再用淺水培養(yǎng),第3天在顯微鏡下觀察(見(jiàn)圖2)。孢囊梗簡(jiǎn)單合軸分枝或不分枝,孢子囊無(wú)色,單孢。孢子囊變異很大,球形、卵形、橢圓形、倒梨形或不規(guī)則形,倒梨形孢子囊形態(tài)較多。乳突明顯,常為單乳突,有時(shí)為雙乳突,乳突高2.9~6.6μm;孢子囊基部圓形,長(zhǎng)×寬為24.6~49.7μm×17.6~33.8μm,平均33.6×23.9μm,長(zhǎng)寬比為1.1~1.7;孢子囊脫落,具短柄,孢子囊萌發(fā)產(chǎn)生芽管,或產(chǎn)生游動(dòng)孢子,游動(dòng)孢子較活躍。厚垣孢子大量產(chǎn)生,球形,頂生或間生。使用上述4種培養(yǎng)基以及菌絲體淺水培養(yǎng),均未見(jiàn)藏卵器產(chǎn)生。2.4厚垣病病原菌鑒定根據(jù)病原菌的菌落生長(zhǎng)特征和形態(tài)特征、孢囊梗、孢子囊形狀和大小、厚垣孢子以及寄主范圍,參照有關(guān)病原菌分類文獻(xiàn),鑒定該病原菌為鞭毛菌亞門,卵菌綱,霜霉目,疫霉科,疫霉屬,棕櫚疫霉[Phytophthorapalmivora(Butler)Butler]。2.5成熟葉片沖突結(jié)果顯示,檸檬嫩葉刺傷和無(wú)刺傷2種處理發(fā)病率均達(dá)100%;成熟葉片刺傷發(fā)病,無(wú)刺傷不發(fā)病,癥狀表現(xiàn)和田間發(fā)病植株相一致,而對(duì)照不發(fā)病。從接種發(fā)病的組織中重新分離的病原菌,與接種的病原菌完全一致,表明分離獲得的病菌為該病的病原菌。2.6其他有機(jī)溶劑用生長(zhǎng)速率法測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)表1)表明,50%烯酰嗎啉可濕性粉劑、68.75%氟吡菌胺·霜霉威懸浮劑和68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑這3種藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制效果最好。3種藥劑間差異不顯著,而與其他幾種藥劑則存在顯著性差異。50%烯酰嗎啉可濕性粉劑和68.75%氟吡菌胺·霜霉威懸浮劑600、800倍液,68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑600倍液抑菌效果較好,抑菌率均達(dá)到90%以上;50%烯酰嗎啉可濕性粉劑和68.75%氟吡菌胺·霜霉威懸浮劑1000、1500倍液,68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑800、1000倍液抑菌率達(dá)到80%以上。64%噁霜·錳鋅可濕性粉劑和80%代森錳鋅可濕性粉劑抑菌效果次之,72%錳鋅·霜脲可濕性粉劑抑菌效果較差,77%硫酸銅可濕性粉劑則幾乎沒(méi)有抑菌作用。2.74%霜錳鋅可濕性粉劑有效中濃度的分析室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果(表2)表明,68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑、68.75%氟吡菌胺·霜霉威懸浮劑、50%烯酰嗎啉可濕性粉劑和64%噁霜·錳鋅可濕性粉劑的有效中濃度(EC50)分別為121.372、133.392、133.833mg/L和814.071mg/L,其中68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑有效中濃度最低,相對(duì)抑制效果最好;68.75%氟吡菌胺·霜霉威懸浮劑和50%烯酰嗎啉可濕性粉劑次之;64%噁霜·錳鋅可濕性粉劑最差。4種藥劑的相關(guān)系數(shù)均在0.92以上,表明藥劑濃度與抑制作用呈現(xiàn)較高的相關(guān)性。3討論3.1柑橘疫霉病概況本研究從檸檬苗病葉和病莖組織上獲得菌落形態(tài)特征較為一致的菌株,經(jīng)過(guò)對(duì)病原菌培養(yǎng)形狀、孢囊梗形態(tài)及孢子囊大小、厚垣孢子著生情況,以及寄主范圍等,鑒定該病原菌為棕櫚疫霉(P.palmivora),是引起檸檬苗發(fā)病的主要病原。該病菌大量產(chǎn)生厚垣孢子,厚垣孢子是許多植物疫病的重要初侵染源,在合適的條件下萌發(fā)侵入寄主。據(jù)報(bào)道,全世界柑橘疫霉病約12種,但不同國(guó)家,不同地區(qū),不同寄主,疫霉種不同[10,11,12,13,14,15,16]。廣東省柑橘上發(fā)現(xiàn)疫霉病菌有6種,有柑橘褐腐疫霉(Phytophthoracitrophthora)、煙草疫霉(P.nicotianae)、棕櫚疫霉(P.palmivora)、辣椒疫霉(P.capsici)、掘氏疫霉(P.drechsleri)和柑橘生疫霉(P.citricola)。目前,柑橘苗期疫病已報(bào)道的有柑橘褐腐疫霉和煙草疫霉。瑞麗市柚子果疫病為柑橘褐腐疫病。南美洲智利等國(guó)家報(bào)道在檸檬和甜橙上分離到柑橘褐腐疫霉、寄生疫霉(P.parasitica)和P.inundata等3種疫病病原菌。柑橘褐腐疫霉主要發(fā)生在果實(shí)上,表現(xiàn)為果實(shí)褐腐。美國(guó)佛羅里達(dá)報(bào)道了檸檬上有煙草疫霉和柑橘褐腐疫霉的存在。而檸檬棕櫚疫霉尚未見(jiàn)報(bào)道。所以檸檬上的棕櫚疫霉菌應(yīng)該得到廣泛的重視。3.2育苗地的選擇棕櫚疫霉的寄主范圍較廣,主要寄主為鳳梨、韭、木瓜、咖啡、橡膠樹(shù)、胡椒、芋、番木瓜、柑橘、枇杷、無(wú)花果、短筒倒掛金鐘、芒果、泡桐屬、鱷梨、蝶蘭屬、洋蒲桃、酸棗以及土壤等。棕櫚疫霉危害植物后殘留在土壤的病殘?bào)w或者周邊植株,在氣候適宜時(shí)對(duì)檸檬的種植帶來(lái)危害。因此,在選擇檸檬育苗基地時(shí),應(yīng)盡量避免周圍種植有棕櫚疫霉菌的寄主植物,防止該菌的侵染對(duì)檸檬產(chǎn)業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害。根據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn),檸檬上棕櫚疫霉病多發(fā)生在用土雜肥覆蓋的苗圃中,從發(fā)病時(shí)間看,苗疫病主要發(fā)生在夏梢抽發(fā)期,6-8月高溫高濕,雨水多的天氣發(fā)病重,冬秋干旱季節(jié)未見(jiàn)發(fā)病。育苗地應(yīng)選擇地勢(shì)較高,排灌方便,土質(zhì)疏松的地段,避免在地勢(shì)低洼易積水的地方育苗。若用溫床育苗,苗床最好在播種前用土壤消毒劑進(jìn)行消毒。3.3室內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果目前,市場(chǎng)上防治疫病的殺菌劑主要針對(duì)馬鈴薯晚疫病、番茄疫病、辣椒疫病和煙草黑脛病等,疫霉病病菌適應(yīng)性強(qiáng),許多藥劑使用后很快產(chǎn)生抗藥性。因此,有必要篩選針對(duì)棕櫚疫霉的有效防治藥劑,提出正確的使用方法和防治適期,進(jìn)行病害的有效控制。本研究選用7種防治疫病的選擇性殺菌劑和廣譜性殺菌劑進(jìn)行室內(nèi)抑菌試驗(yàn)。