elisa技術(shù)在抗體檢測中的應(yīng)用

elisa技術(shù)在抗體檢測中的應(yīng)用

酶聯(lián)免疫吸附試驗是目前檢驗檢疫中常見的免疫檢查方法之一。它的手術(shù)簡單，無需特殊設(shè)備，因此在各級醫(yī)院都可以使用。但是,如果忽視了影響其結(jié)果的因素,難免造成假陰性或假陽性,現(xiàn)對影響實驗結(jié)果的常見影響因素及控制方法探討如下。1試劑的原因2樣本的要素2.1內(nèi)源性干擾因素：包括油流因素r、補(bǔ)體、濃度較高的非特異性免疫球蛋白、異質(zhì)性抗體、某些自身阻力2.2外源性干擾因素：包括樣品溶血、樣品被細(xì)菌污染、樣品儲存時間長、樣品硬化等3操作中的技術(shù)要素3.1加酶帶試劑量不確定孵育前加樣時間過長,酶試劑加出孔外,使用滴瓶滴加試劑時,滴加的角度不同和擠壓的力度不同,致使滴加的試劑量不準(zhǔn),都可導(dǎo)致試驗結(jié)果不準(zhǔn)確?？刂品椒?(1)實驗樣本過多時,可分批次操作,以減少實驗時間延長造成的誤差;(2)加酶試劑后,用吸水紙吸干孔外試劑;(3)作定量試驗時,使用加樣器加注試劑,并經(jīng)常校正其準(zhǔn)確性,此外,要做到一份樣本一個移液頭,防止交叉污染。3.2溫育3.3抽吸不完全,清洗不規(guī)范ELISA測定的洗板一般有兩種方式,即手工和洗板機(jī)洗板。采用手工洗板,孔與孔之間液體易交叉,采用半自動洗板機(jī)時,洗液量不足導(dǎo)致洗板不徹底,洗板針堵塞導(dǎo)致抽吸不完全,洗板不暢導(dǎo)致清洗效果差?？刂品椒?(1)手工洗板時,拍板時要垂直,避免交叉污染,用力不能過猛,防止抗原抗體復(fù)合物脫離;(2)洗板機(jī)洗板時應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢,若被雜物堵塞時可用注射器針頭挑出;(3)為了洗滌效果好,實驗室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法,在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1~3次,或適當(dāng)增加洗板的次數(shù),有資料報道洗板7次能達(dá)到理想的洗滌效果。3.5elisa測定的程序及方法讀取結(jié)果要在15~30分鐘內(nèi)完成,定性測定用肉眼判讀試驗結(jié)果時,反應(yīng)板應(yīng)水平距離白色背景10~15分鐘;定量測定時用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果,酶標(biāo)儀不應(yīng)置于陽光或強(qiáng)光下,需先預(yù)熱15~30分鐘再進(jìn)行測試。綜上所述,盡管ELISA法操作簡單,但可能影響測定結(jié)果的因素也較多。故在實際操作的過程中,要加強(qiáng)質(zhì)量管理,排除各種影響因素干擾,力求結(jié)果準(zhǔn)確,為臨床疾病的診斷和科研提供可靠的依據(jù)。1.1試劑的選擇:試劑的選擇是保證血液檢測質(zhì)量的關(guān)鍵因素。雖然國家采用批批檢定的形式對ELISA試劑嚴(yán)格把關(guān),但不同廠家的試劑在使用效果上存在一定的差別。要選知名度相對高、具有“三證”的試劑,不要用無批號的試劑,更不要使用過期的試劑和混用不同批號的試劑。1.2在臨床實驗室,對試劑的準(zhǔn)備一般不太注意,通常的做法是在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用,這種做法的直接后果是對一些弱陽性標(biāo)本的檢測出現(xiàn)假陰性。因此,在ELISA測定中試劑的準(zhǔn)備最為關(guān)鍵的是,將試劑盒先從4℃冰箱中拿出來,在室溫下放置20~30分鐘后,再進(jìn)行測定,使試劑盒在使用前與室溫平衡,這樣做的目的能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度較快地達(dá)到所需的溫度,以滿足后面的測定需求。2.1.1類風(fēng)濕因子在類風(fēng)濕患者及正常人血清中,常含有較高或不同濃度的類風(fēng)濕因子,其一般為IgM型,具有與變性IgG產(chǎn)生非特異性結(jié)合的特點,因為在ELISA測定中,其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的特異抗體IgG結(jié)合,從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。避免出現(xiàn)此現(xiàn)象的方法有:(1)用F(ab)2替代完整的IgG。(2)標(biāo)本用聯(lián)有熱變性IgG的固相吸附劑處理。(3)檢測抗原時,可用2-巰基乙醇加入到標(biāo)本稀釋液中使RF降解。2.1.2補(bǔ)體在固相酶免疫測定中,來自哺乳動物的固相抗體和酶標(biāo)二抗均有激活人補(bǔ)體系統(tǒng)的功能。一方面,固相抗體和酶標(biāo)二抗可因其吸附及結(jié)合過程中抗體分子發(fā)生變構(gòu),使Fc段的補(bǔ)體C1q結(jié)合點暴露出來,使C1q將二者連接起來出現(xiàn)假陽性結(jié)果另一方面,固相抗體因為活化補(bǔ)體的結(jié)合,封閉抗體和抗原的表位結(jié)合能力而引起假陰性。解決的方法是:(1)用EDTA稀釋標(biāo)本(2)56℃30分鐘加熱血清使C1q滅活。2.2.1標(biāo)本的溶血及混有紅細(xì)胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈,殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白有類過氧化物酶樣的活性,催化底物顯色造成假陽性。采集血液時勿用力振蕩,嚴(yán)防標(biāo)本溶血。2.2.2標(biāo)本的污染菌體可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶,可使實驗出現(xiàn)非特異性顯色。因此,ELISA檢測宜采集新鮮標(biāo)本,如不能當(dāng)時測定,5天之內(nèi)應(yīng)4℃保存,1周后檢測應(yīng)低溫凍存;同時,收集標(biāo)本采用無菌試管,可防止標(biāo)本的污染。2.2.3標(biāo)本的保存:標(biāo)本在冰箱中保存過久,血清中IgG可聚集成多聚體,AFP可形成二聚體,在用間接法測定中導(dǎo)致本底過深,甚至造成假陽性。冰凍保存的標(biāo)本反復(fù)凍融產(chǎn)生機(jī)械切力對標(biāo)本中的蛋白等分子有破壞作用,可引起假陰性結(jié)果。因此,ELISA檢測盡量采用新鮮標(biāo)本,長時凍存的標(biāo)本避免反復(fù)融凍。2.2.4標(biāo)本凝固不全:凝固不全的血清中含有部分纖維蛋白原,可使結(jié)果呈假陽性。解決的反方法有:(1)標(biāo)本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)目鼓齽?(2)血液標(biāo)本采集后必須充分凝固后再離心分離血清。3.2.1溫育時間、溫度的選擇一般根據(jù)試劑盒的說明書選擇溫育的時間、溫度。加完樣本和(或)試劑后將微孔板從室溫放入水浴箱或溫箱中時,孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃需要一定時間,如果是將微孔板一放入溫箱即開始計時,這樣就容易造成實際測定中溫育時間不夠,易致弱陽性標(biāo)本測不出來?？刂品椒?(1)如有兩種溫度,盡量使用較低的溫度、較長反應(yīng)時間的條件;(2)用1個小溫度計放置在板孔反應(yīng)液中測量觀察。3.2.2“邊緣效應(yīng)”的排除“邊緣效應(yīng)”是在使用96孔板的ELISA測定中,外周孔顯色較中心孔深的現(xiàn)象。產(chǎn)生的原因可能是96孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學(xué)梯度造成的,因此在溫育時盡量采用水浴。3.4鄰苯二胺odp為底物的試劑市售ELISA試劑盒中,如以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物,則提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液;如以鄰