EGCG與大豆7S-11S蛋白互作對乳液穩(wěn)定性的影響

EGCG與大豆7S/11S蛋白互作對乳液穩(wěn)定性的影響

黃國，張江江，田澤鵬，羅小雪，孫書境，隋曉楠*（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院哈爾濱1500302東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院哈爾濱150030）大豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的食源性植物蛋白，因完整的氨基酸組成、優(yōu)良的功能特性和較高的營養(yǎng)價(jià)值而被廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)中[1]。根據(jù)沉降系數(shù)大豆蛋白被細(xì)分為2S、7S、11S和15S蛋白，其中7S和11S蛋白作為大豆蛋白的主要儲藏蛋白，其含量占大豆蛋白的70%～80%[2]。7S蛋白（約180ku）是一種三聚體糖蛋白，由3個(gè)糖基化亞基α（67ku），α'（71ku）和β（50ku）通過疏水及靜電相互作用連接[3-4]；而11S（約360ku）蛋白是一種六聚體非糖蛋白，由亞基酸性多肽A（35ku）和堿性多肽B（20ku）通過二硫鍵連接而成的三聚體進(jìn)一步聚合形成的六聚體[5-6]。近年來，以食源性蛋白為乳化劑的乳液體系被廣泛研究。大豆蛋白因良好的表面活性及安全性而被用作乳化劑。7S/11S蛋白作為大豆蛋白的主要蛋白，其蛋白結(jié)構(gòu)、組分的變化會引起乳化特性差異。7S蛋白較小的分子量，較高的柔韌性，可以很快移動(dòng)到油-水界面形成乳液[7]；而11S蛋白中高分子量和亞基中較多的二硫鍵限制了其在油滴表面的吸附能力，不能在界面處快速重排并迅速暴露與油相相互作用的疏水區(qū)域，使得11S蛋白的乳化效果不如7S蛋白[8]。11S蛋白較高的聚集度和較多的二硫鍵的特性使其在凝膠功能上優(yōu)于7S蛋白。這些表明大豆蛋白的不同組分因具有不同的功能而在食品加工中發(fā)揮不同的作用。7S/11S蛋白之間結(jié)構(gòu)和功能的差異性可能會影響乳液特性[9]。Puppo等[10]研究表明7S蛋白對整體大豆蛋白乳液起關(guān)鍵作用，在600MPa下，7S蛋白乳液液滴絮凝形成結(jié)構(gòu)化乳液，因而具有非常高的表觀黏度；而11S蛋白乳液微觀結(jié)構(gòu)的未發(fā)生變化。Keerati-U-Rai等[11]發(fā)現(xiàn)11S蛋白在大豆蛋白穩(wěn)定的乳液中的剪切稀化行為發(fā)揮了主要作用，與7S蛋白穩(wěn)定的乳液相比，較大的液滴尺寸、較高的絮凝程度和較高的蛋白質(zhì)含量都有助于11S蛋白乳液稠度指數(shù)的提高。此外，由于乳液是一種熱力學(xué)失穩(wěn)的混合膠體體系，特別是在長期儲存中，乳液往往會出現(xiàn)嚴(yán)重的絮凝失穩(wěn)現(xiàn)象，降低了乳液的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響食品的感官特性及營養(yǎng)價(jià)值。有研究表明在乳液中添加多酚類化合物可以改善乳液的穩(wěn)定性，以多酚與蛋白的復(fù)合體系構(gòu)建的新型乳化劑的研究近年來引起業(yè)界極大的興趣[12]。EGCG是綠茶中含量最高、活性最強(qiáng)的兒茶素，其特殊的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出優(yōu)異的生物學(xué)活性，如抗氧化、抗炎、抗病毒等，同時(shí)也被廣泛地添加于食品之中[13]。EGCG通過氫鍵與疏水相互作用與蛋白發(fā)生相互作用，進(jìn)而影響蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其乳液的穩(wěn)定性。趙思明等[14]研究表明EGCG與大豆分離蛋白（Soyproteinisolates，SPI）之間依靠疏水作用結(jié)合，并降低了SPI的β-折疊含量。β-乳球蛋白-EGCG復(fù)合物能夠在油-水界面發(fā)生結(jié)構(gòu)變化并趨于展開，形成薄而帶電的界面膜，從而穩(wěn)定乳液[15]。祝鋼等[16]研究發(fā)現(xiàn)EGCG與SPI之間的相互作用增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的抗氧化性；以SPIEGCG復(fù)合物制備的Pickering乳液具有較好的乳化活性和乳化穩(wěn)定性，乳液液滴分布均勻，不易聚集。雖然大量研究表明EGCG的加入能夠改善大豆蛋白乳液的穩(wěn)定性[17-19]，并明晰了EGCG與7S/11S蛋白的相互作用[20-21]，但是相關(guān)研究未涉及EGCG與7S/11S蛋白的相互作用對蛋白乳液穩(wěn)定性的影響。明確EGCG與7S/11S蛋白的相互作用，不僅可以了解7S/11S蛋白穩(wěn)定的乳液的特性差異，還可能通過開發(fā)蛋白-多酚復(fù)合乳化劑來提高蛋白乳液穩(wěn)定性?；诖?，本文在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在中性條件下構(gòu)建大豆蛋白-EGCG復(fù)合體系，通過測定復(fù)合體系三維熒光光譜、熱穩(wěn)定性等探究其相互作用。以其為乳化劑，制備O/W型乳液。通過測定乳液的粒徑分布、色差、液滴形態(tài)，觀察儲藏期分層情況及界面蛋白分布等，研究EGCG對7S/11S蛋白乳液穩(wěn)定性差異的影響，為EGCG調(diào)控大豆蛋白乳液穩(wěn)定性提供理論依據(jù)，也為大豆蛋白-多酚穩(wěn)定乳液食品的開發(fā)與應(yīng)用提供參考。1材料與方法1.1材料與試劑大豆（綏農(nóng)53號），國家大豆工程技術(shù)研究中心；福臨門玉米油，中糧佳悅（天津）有限公司。EGCG（純度≥98%），西安通澤生物科技有限公司；SDS凝膠制備試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；十二烷基磺酸鈉（分析純），廣州化學(xué)試劑廠；所用試劑均為分析純級；試驗(yàn)用水均為去離子水。1.2儀器與設(shè)備RF-6000型熒光分光光度計(jì)，日本Shimadzu公司；DSCQ2000差示掃描量熱儀，美國TA公司；NANOZS90粒度及電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；BX53正置顯微鏡，奧林巴斯（中國）有限公司；Mastersize2000粒度分布儀，英國馬爾文儀器有限公司；ZE-600色差計(jì)，日本色電工業(yè)株式會社；SPCH-EP-IC-10-60高壓微通道射流均質(zhì)機(jī)，英國HomogenisingSystemsLtd公司；T25高速均質(zhì)機(jī)，德國IKA公司。1.3方法1.3.1伴大豆球蛋白與大豆球蛋白的制備參考Nagano等[22]的方法并稍作修改。大豆經(jīng)萬能粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，按料液比1∶3（g/mL）將大豆粉用正己烷脫脂。室溫下攪拌2h，重復(fù)脫脂5次，干燥得到脫脂大豆粉。將脫脂大豆粉按料液比1∶10（g/mL）加入去離子水中，用2mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH值至7.5，室溫?cái)嚢?h后離心（4℃，10000×g，30min），向上清液中添加0.98g/L干燥后的亞硫酸氫鈉，攪拌使其充分溶解。用2mol/LHCl調(diào)節(jié)pH值至6.4，置4℃冰箱保持過夜，經(jīng)離心（4℃，6500×g，20min）得到11S沉淀物。為獲得7S蛋白，在離心后的上清液中加入固體NaCl使其濃度為0.25mol/L，并用2mol/LHCl調(diào)節(jié)pH值至5.0，攪拌1h使其充分溶解，然后離心（4℃，10000×g，30min）除去沉淀物。向上清液添加等體積的冰冷水，用2mol/LHCl調(diào)節(jié)pH值至4.8，靜置1h后離心（4℃，6500×g，20min）得到7S沉淀物。將5次水洗后的7S/11S沉淀物重新分散于10倍的去離子水中溶解并調(diào)節(jié)pH值至7.5，將蛋白溶液透析48h（3500u），凍干，備用。經(jīng)杜馬斯法（N×6.25）測定獲得的（91.01±0.05）%和（95.90±0.12）%的7S/11S蛋白。經(jīng)SDS凝膠電泳分析，制備的7S/11S蛋白純度分別為（80.07±0.13）%，（93.43±0.06）%。1.3.2伴大豆球蛋白/大豆球蛋白-EGCG復(fù)合物的制備將EGCG、7S/11S蛋白分別溶解于磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.01mol/L，pH7.0）中攪拌2h，而后將避光的EGCG溶液超聲脫氣，與7S/11S蛋白溶液在4℃冰箱中放置過夜12h，以確保充分水化。將EGCG、7S/11S蛋白溶液按比例混合，最終配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的7S/11S蛋白，蛋白與EGCG質(zhì)量比為1∶0和2∶1的混合溶液。避光攪拌2h，確保充分反應(yīng)。將混合溶液透析48h（3500u），除去游離的EGCG，然后，冷凍干燥獲得7S/11S蛋白-EGCG復(fù)合物。1.3.3三維熒光光譜測定為了描述蛋白-多酚的相互作用，使用三維熒光光譜技術(shù)來測量峰位置和峰強(qiáng)度值的相應(yīng)變化。將7S/11S蛋白及其EGCG復(fù)合物溶于PBS（0.01mol/L，pH7.0）中，最終質(zhì)量濃度為0.05mg/mL。室溫下勻速攪拌2h后4℃放置過夜12h，以確保充分水化。取出，恢復(fù)室溫后進(jìn)行三維熒光光譜測量。激發(fā)波長（Ex）設(shè)置為200～350nm，發(fā)射波長（Em）為200～500nm，激發(fā)/發(fā)射狹縫寬帶均為5nm，掃描速度2000nm/min。1.3.4熱穩(wěn)定性的測定參考Ren等[23]的方法并稍作修改。取5mg的EGCG、7S/11S蛋白及其EGCG復(fù)合物放入空白坩堝中，加入20μLPBS（0.01mol/L，pH7.0），壓片放置過夜平衡。用Q2000差示掃描量熱儀測定蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，以空白坩堝為對照，測定溫度20～100℃，加熱速度10℃/min。采用機(jī)身自帶軟件記錄數(shù)據(jù)及處理DSC曲線。1.3.5蛋白顆粒粒徑分布及ζ-電位的測定參考Sui等[24]的方法，使用NANOZS90粒度及電位分析儀對大豆蛋白及其EGCG復(fù)合物進(jìn)行粒徑分布及電位測定。用PBS（0.01mol/L，pH7.0）將樣品稀釋至0.1mg/mL，過0.45μm水系膜，避免顆粒聚集。其中粒徑分布設(shè)置參數(shù)：折射率分別為1.46和1.33，吸收參數(shù)為0.001。ζ-電位采用激光多普勒電泳光散射技術(shù)測量，將稀釋后蛋白溶液注入兩端加有電壓的電泳池中，使用Helmholtz-Smoluchowski方程從試驗(yàn)確定的電泳遷移率直接積分計(jì)算ζ-電位，溫度設(shè)置為25℃。1.3.6乳液的制備將EGCG、7S/11S蛋白分別溶解于PBS（0.01mol/L，pH7.0）中攪拌2h，而后將避光的EGCG溶液超聲脫氣，與7S/11S蛋白溶液在4℃冰箱中放置過夜12h，以確保充分水化。將EGCG、7S/11S蛋白溶液按比例混合，使其混合溶液包含最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的7S/11S蛋白及0.00%，0.01%，0.02%和0.03%的EGCG。室溫下避光攪拌2h，確保充分反應(yīng)。將玉米油按照油水體積比1∶4添加至混合溶液中，經(jīng)T25高速均質(zhì)機(jī)預(yù)乳化（10000r/min，2min），高壓均質(zhì)（150MPa，4次）處理后得到新鮮乳液。使用0.1mol/LHCl/NaOH將乳液pH值調(diào)節(jié)至7.0，而后加入0.02%疊氮化鈉抑制微生物生長。1.3.7乳液色差的測定使用ZE-600色差計(jì)測定7S/11S蛋白乳液的色差。測定前使用白板以及光源器件對儀器進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。測定參數(shù)包括亮度值（L*）、紅度值（a*）、黃度值（b*）和總色差（ΔE）。總色差（ΔE）計(jì)算公式：式中：L0、a0、b0——分別是不添加EGCG對照樣品的亮度值、紅度值和黃度值；Li、ai、bi——分別是添加EGCG樣品的亮度值、紅度值和黃度值。1.3.8乳液液滴尺寸及其粒徑分布的測定采用Mastersize2000粒度分布儀測定乳液液滴尺寸。儀器參數(shù)設(shè)置：顆粒折射率1.473，顆粒吸收率0.001，分散劑為水，分散劑折射率1.330。采用d4，3、d3，2表示乳液液滴尺寸。1.3.9乳液顯微鏡及儲藏穩(wěn)定性觀察將制備好的新鮮乳液用PBS（0.01mol/L，pH7.0）適當(dāng)稀釋，用高速漩渦振蕩器混勻，移取10μL稀釋乳液滴在載玻片上，在顯微鏡下觀察。將新鮮乳液置于2.5cm×2.4cm×10cm的樣品瓶中觀察，室溫避光儲藏60d，期間記錄樣品分層情況。1.3.10乳液界面蛋白組成的測定參考Maneephan等[25]的方法測定吸附在界面上的蛋白質(zhì)組成。將新鮮乳液離心（25°C，20000×g，30min），小心地從離心管頂部刮除乳霜并在濾紙上干燥，然后，重新分散在PBS（0.01mol/L，pH7.0）中至初始體積。重復(fù)離心步驟3次，確保除去未吸附蛋白。將最后一次的乳液分散液做SDS凝膠電泳分析。取80μL分散液加到20μL不含還原劑的5×上樣緩沖液中，沸水浴3min變性處理并離心（25°C，10000×g，10min），備用。取10μL上清液等分試樣裝入含有12%分離膠與5%濃縮膠中，用于蛋白質(zhì)分離。對濃縮膠、分離膠分別調(diào)節(jié)電壓為60，120V。用含R-250考馬斯亮藍(lán)染色液進(jìn)行浸染，用含冰乙酸及甲醇的脫色液洗脫。1.4數(shù)據(jù)結(jié)果與分析9.5軟件繪制圖像。2結(jié)果與分析2.1三維熒光光譜結(jié)果分析采用三維熒光光譜技術(shù)深入了解多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合的微環(huán)境和構(gòu)象變化。通過比較添加和不添加EGCG的7S/11S蛋白的光譜變化，可以獲得有關(guān)7S/11S蛋白構(gòu)象和微環(huán)境變化的有用信息。如圖1所示，PeakI的“指紋型”峰是典型的色氨酸、酪氨酸殘基的熒光峰，而PeakII的“指紋型”峰主要揭示了蛋白質(zhì)多肽鏈的骨架結(jié)構(gòu)的熒光行為[26]。11S蛋白具有較高含量的色氨酸與酪氨酸，與7S蛋白相比，顯示出更高的熒光強(qiáng)度[3]。添加EGCG，導(dǎo)致7S/11S蛋白的兩種峰形變得稀疏，顏色變淺，說明EGCG的加入使氨基酸特征熒光峰與多肽鏈骨架峰均有不同程度的降低，表明色氨酸、酪氨酸殘基附近的微環(huán)境發(fā)生變化，多肽鏈發(fā)生解折疊，蛋白三級結(jié)構(gòu)變得伸展[27]。11S蛋白的稀疏程度要高于7S蛋白，表明EGCG與11S蛋白的互作強(qiáng)度要強(qiáng)于7S蛋白，使11S蛋白熒光強(qiáng)度下降更多。以上變化表明EGCG與7S/11S蛋白之間存在相互作用，兩者形成復(fù)合物，并改變7S/11S蛋白的微環(huán)境和三級構(gòu)象，這與Ren等[23]的研究結(jié)果一致，表明7S/11S蛋白的PeakI和II熒光在很大程度上被花青素-3-葡萄糖苷猝滅，進(jìn)而引起蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)的解折疊，誘導(dǎo)氨基酸微環(huán)境由疏水向親水轉(zhuǎn)變。圖17S（a）/11S（b）蛋白及其EGCG復(fù)合物的三維熒光等高線圖Fig.1Three-dimensionalfluorescencecontourmapof7S（a）/11S（b）proteinanditsEGCGcomplex2.2熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性是了解EGCG與7S/11S蛋白相互作用的另一方式。如圖2所示，與7S蛋白相比，11S蛋白表現(xiàn)出更高的熱轉(zhuǎn)變溫度，這是由于11S蛋白含有較高含量的含硫氨基酸，能夠形成較多的二硫鍵以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)所致[28]。在圖2a中，出現(xiàn)微小的11S蛋白的變性峰，這是因?yàn)樵?S蛋白提取時(shí)，殘留著少量的11S蛋白，這與A?ón等[29]的報(bào)道一致。當(dāng)添加EGCG時(shí)，7S/11S蛋白的變性轉(zhuǎn)變溫度Td和變性焓ΔH發(fā)生不同程度的改變，EGCG與7S/11S蛋白的相互作用可能使蛋白質(zhì)部分結(jié)構(gòu)展開，從而降低了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。在蘋果幼果多酚-豬胰腺α-淀粉酶[30]、桑樹多酚-肌原纖維蛋白[31]等多酚-蛋白相互作用中也報(bào)道了類似的發(fā)現(xiàn)。此外，11S蛋白的Td、ΔH比7S蛋白下降的多，表明EGCG與11S蛋白具有更強(qiáng)的相互作用，這與三維熒光的結(jié)果是一致的。圖27S（a）/11S（b）蛋白及其EGCG復(fù)合物的熱穩(wěn)定性Fig.2Thermalstabilityof7S（a）/11S（b）proteinanditsEGCGcomplex2.3蛋白顆粒粒徑分布及ζ-電位粒徑分布如圖3a所示，所有樣品均呈單峰分布狀態(tài)。當(dāng)添加EGCG后，7S/11S蛋白的粒徑分布均向粒徑大的方向移動(dòng)。大粒徑方向的移動(dòng)暗示蛋白之間可能發(fā)生解折疊和聚集。有研究表明，茶多酚與大豆蛋白間的相互作用可能會形成高分子量的大顆粒，進(jìn)一步導(dǎo)致聚集體的形成[32]。這可能是由于EGCG具有多個(gè)酚羥基，可與蛋白發(fā)生交聯(lián)作用；其中，EGCG充當(dāng)交聯(lián)劑，使蛋白質(zhì)發(fā)生一定的聚集現(xiàn)象[33]。在Ren等[34]的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，黑豆皮提取物多酚的加入使SPI顆粒的粒徑增大，并且隨著多酚濃度的增加，多酚作為蛋白質(zhì)分子的架橋劑，形成粒徑更大的復(fù)合物。由于11S蛋白具有較高的聚集度，在EGCG的作用下，可能形成更大的聚集體，與7S蛋白相比，11S蛋白粒徑變化更為明顯，這與OCHNIO等[35]的結(jié)果一致：當(dāng)葉酸作用于7S/11S蛋白時(shí)，蛋白平均粒徑增加；11S蛋白似乎更易于自組裝，被葉酸誘導(dǎo)形成更廣泛的聚集體。ζ-電位是決定膠體粒子帶電基團(tuán)之間相互作用強(qiáng)度的重要因素，結(jié)果如圖3b所示。大豆蛋白的ζ-電位的絕對值因添加EGCG而增加，這歸因于在pH7.0時(shí)添加帶負(fù)電荷的EGCG，中和了部分帶正電荷的蛋白質(zhì)基團(tuán)。該結(jié)果表明EGCG可能包圍大豆蛋白質(zhì)分子的表面，進(jìn)而改變其表面電荷分布，進(jìn)一步增強(qiáng)了粒子間的靜電斥力，相對提高了分散體的穩(wěn)定性。這與Zhou等[36]的研究結(jié)果相似，添加EGCG提高了SPI的ζ-電位，EGCG-SPI的交聯(lián)可形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。其中，靜電排斥力對網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響小于交聯(lián)引起的影響。隨著ζ-電位的增加，蛋白質(zhì)顆粒的粒徑也增加。在Peng等[37]對EGCG與7S蛋白的相互作用研究中也觀察到類似的現(xiàn)象。圖37S/11S蛋白及其EGCG復(fù)合物的粒徑分布（a）及ζ-電位（b）Fig.3Particlesizedistribution（a）andζ-potential（b）of7S/11SproteinanditsEGCGcomplex2.4乳液色差大豆蛋白乳液食品的可接受性高度取決于乳液食品的顏色特性。如表1所示，與不添加EGCG的7S/11S蛋白乳液相比，添加EGCG的7S/11S蛋白乳液顯示出較低的亮度值L*，更高的紅度值a*和黃度值b*。EGCG因自身的顏色效應(yīng)，故作為食品添加劑添至7S/11S蛋白乳液，使7S/11S蛋白乳液中呈現(xiàn)一定的紅色[38]。當(dāng)EGCG為最大添加量時(shí)，7S/11S蛋白乳液的L*沒有顯著差異，而7S蛋白乳液的a*高于11S蛋白乳液，7S蛋白乳液的b*和ΔE低于11S蛋白乳液。這種乳液產(chǎn)品顏色的差異可能影響消費(fèi)者對大豆蛋白乳液食品的選擇。表1不同濃度的EGCG對7S/11S蛋白乳液的顏色及其液滴尺寸的影響Table1EffectofdifferentEGCGconcentrationsonthecolorandemulsiondropletsizeof7S/11Sproteinemulsion2.5乳液粒徑及其分布顆粒的體積加權(quán)平均直徑（d4，3）及表面積加權(quán)平均直徑（d3，2）對乳液液滴的聚集狀態(tài)高度敏感。d3，2值可以提供大多數(shù)顆粒的尺寸信息；而d4，3值可以提供大聚集體的尺寸信息，因?yàn)樗鼘Υ箢w粒或聚集體的存在高度敏感[39]。兩者常被用于乳液穩(wěn)定性的評價(jià)。較小的液滴可能有利于乳液穩(wěn)定性的提高。由表1及圖4可知，對于7S蛋白乳液，添加EGCG導(dǎo)致乳液液滴粒徑分布向左移動(dòng)，d4，3值逐漸降低，d3，2值變化不明顯。當(dāng)EGCG添加量為0.02%，d4，3值為1.429μm時(shí)，達(dá)到最小值。同樣的，對于11S蛋白乳液，乳液液滴粒徑分布變化與7S蛋白類似，其d4，3、d3，2值逐漸降低。當(dāng)EGCG添加量為0.02%，d4，3值為29.639μm時(shí)，達(dá)到最小值，d3，2值為6.536μm。相比于7S蛋白，11S蛋白乳液液滴粒徑較大，這與Keerati-U-RAI等[11]的研究一致，表明7S/11S蛋白具有不同的界面特性，其粒徑和分子結(jié)構(gòu)的差異影響乳液液滴的尺寸和穩(wěn)定性。7S蛋白由于自身分子量小，聚集度低，能夠快速吸附到油-水界面形成穩(wěn)定的乳液，因此乳化能力強(qiáng)，粒徑較小。而11S蛋白分子量高，聚集度高，導(dǎo)致其吸附到油-水界面的速率相對較慢，并且，11S蛋白剛性的球狀結(jié)構(gòu)在油-水界面處難以展開，極大地保持了完整的球形結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致乳液液滴高度絮凝，出現(xiàn)較多的乳液液滴聚集狀態(tài)。另一方面，11S蛋白的不良的溶解度，當(dāng)作為以凝膠能力主導(dǎo)的大豆蛋白時(shí)，其乳液液滴粒徑>10μm，乳液樣品黏稠、不易流動(dòng)，在高壓均質(zhì)作用下可能發(fā)生部分凝膠作用，形成凝膠型乳液[40]。Puppo等[10]也報(bào)道了類似的發(fā)現(xiàn)，凝膠型乳液的形成可能有利于乳液穩(wěn)定性的提高。添加EGCG后，在EGCG的作用下，7S/11S蛋白分子部分結(jié)構(gòu)展開，在油-水界面發(fā)生結(jié)構(gòu)重排，親水、疏水基團(tuán)重新排布使乳液液滴界面結(jié)構(gòu)變得緊湊，從而降低蛋白乳液液滴的尺寸，并改善了絮凝的程度，這與Tian等[41]的研究結(jié)論較一致。Li等[42]研究表明，與單獨(dú)的米糠蛋白相比，兒茶素-米糠蛋白復(fù)合物展開的結(jié)構(gòu)，在均質(zhì)化過程中更能有效減小乳液液滴尺寸，阻止液滴聚合。圖4不同濃度的EGCG對7S（a）/11S（b）蛋白乳液液滴粒徑分布的影響Fig.4EffectofdifferentEGCGconcentrationsontheparticlesizedistributionof7S（a）/11S（b）proteinemulsiondroplets2.6乳液顯微鏡觀察結(jié)果及儲藏穩(wěn)定性乳液樣品經(jīng)高速漩渦稀釋后，通過光學(xué)顯微鏡標(biāo)尺測算的乳液液滴大小可能與激光粒度儀測定的數(shù)據(jù)不一致。如圖5光學(xué)顯微鏡圖像所示，7S/11S蛋白單獨(dú)穩(wěn)定的乳液中出現(xiàn)液滴的絮凝，這與圖4的結(jié)果較一致。隨著EGCG濃度的增加，乳液液滴尺寸減小，特別是當(dāng)EGCG含量為0.02%時(shí)，7S/11S蛋白乳液液滴較小，分布較為均勻，液滴絮凝狀態(tài)得到改善。圖6為7S/11S蛋白及其EGCG復(fù)合乳液在60d儲藏期的分層情況，7S蛋白單獨(dú)穩(wěn)定的乳液液滴絮凝程度較低，1周后出現(xiàn)乳析現(xiàn)象，而隨著儲存時(shí)間的延長，分層情況逐漸加劇。添加EGCG后，7S蛋白乳液的乳析程度減弱，乳液儲藏穩(wěn)定性得到改善。這表明EGCG能夠提高7S蛋白乳液儲藏穩(wěn)定性，這是由于EGCG使7S蛋白結(jié)構(gòu)部分展開，7S蛋白牢牢吸附于油-水界面處并形成穩(wěn)定的界面膜，從而削弱了液滴的絮凝作用。據(jù)報(bào)道，花青素的加入使SPI乳液界面膜牢固，提高了SPI的乳化性及乳化穩(wěn)定性，并在儲存過程中表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性[12，43]。與7S蛋白相比，11S蛋白及其EGCG復(fù)合乳液由于較大的液滴尺寸，在制備1d后觀察到乳析現(xiàn)象。此后，這些樣品的分層位置在60d的儲藏期間沒有移動(dòng)，表明這些乳液中沒有發(fā)生進(jìn)一步的乳化。11S蛋白由于在溶液中不良的聚集狀態(tài)，因此很少作為穩(wěn)定乳液的乳化劑，然而，在儲存期間，能夠?yàn)槿橐禾峁┝己玫膬Σ胤€(wěn)定性[44]。雖然添加EGCG能使11S蛋白乳液乳滴減小，但是對11S蛋白乳液的儲藏穩(wěn)定性無明顯影響。這可能是由于添加EGCG濃度較低，11S蛋白乳液液滴主要以大尺寸存在。較大的乳液液滴在儲存期間容易發(fā)生絮凝耗竭，導(dǎo)致乳析現(xiàn)象。Zhu等[45]同樣發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象：低濃度的大豆皂苷（0.05%至0.2%）添加至11S蛋白乳液中，液滴d4，3略有下降，并觀察到顯著的相分離；而添加高濃度（0.25%）的大豆皂苷時(shí)，蛋白乳液液滴d4，3最小，乳液未出現(xiàn)相分離現(xiàn)象。圖5不同濃度EGCG下7S（a）/11S（b）蛋白乳液的光學(xué)顯微鏡圖片F(xiàn)ig.5Opticalmicroscopyof7S（a）/11S（b）proteinemulsiondropletswithdifferentEGCGconcentrations圖6不同濃度的EGCG下7S（a）/11S（b）蛋白乳液60d儲藏期觀察Fig.6Observationof