云錦杜鵑根系歐石南菌根菌株培養(yǎng)的氮源吸收特性

云錦杜鵑根系歐石南菌根菌株培養(yǎng)的氮源吸收特性

0erm真菌h.在發(fā)酵植物中的應(yīng)用[研究意義]杜鵑植物的根系通常形成歐石南菌根（erm）。ERM真菌在杜鵑花氮獲取中發(fā)揮重要作用,尤其在營養(yǎng)貧瘠的生境中杜鵑花主要依賴菌根吸收氮源。因此,研究ERM真菌氮營養(yǎng)特性,分析ERM在不同氮源條件下對寄主植物生長的影響,有助于了解ERM作用機制及菌根技術(shù)在杜鵑花栽培中的應(yīng)用潛力,并為ERM生物肥料的研制和推廣提供基礎(chǔ)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】杜鵑花科植物生境土壤主要礦質(zhì)營養(yǎng)常以復(fù)雜的有機態(tài)存在,植物自身難以吸收利用,因此ERM及其真菌有機氮利用特性受到較多關(guān)注。Stribley等最先發(fā)現(xiàn)了杜鵑花科植物藍(lán)莓(Vacciniumssp.)ERM具有利用有機殘基為氮源的能力。后來研究認(rèn)為由于ERM真菌,如Hymenoscyphusericae(Read)Korf&Kernan,可以產(chǎn)生一系列的酶類,包括蛋白酶類、纖維素酶類、幾丁質(zhì)分解活性酶等,因而可以降解復(fù)雜有機質(zhì)作為營養(yǎng)來源,并能在接種后促進(jìn)寄主植物對有機氮的吸收。而且不同土壤生境分離的ERM真菌吸收利用有機氮源及其輔助寄主植物氮源吸收的功能存在明顯差異。ERM同樣也可能影響寄主植物對硝態(tài)氮(NO3-)的吸收。試驗表明硝態(tài)氮可以作為ERM真菌H.ericae生長的惟一氮源。而且接種H.ericae形成ERM后,藍(lán)莓(V.macrocarponL)根系吸收硝態(tài)氮的能力提高。【本研究切入點】云錦杜鵑(RhododendronfortuneiL.)是杜鵑花屬常綠無鱗類杜鵑花之一,廣泛分布于中國浙江、江西、安徽等地海拔620—2000m山脊向陽處或林下,優(yōu)良的觀賞性及抗逆性在同類杜鵑花中表現(xiàn)突出。自然狀態(tài)下,云錦杜鵑是典型的ERM植物,菌根侵染率較高。已從云錦杜鵑根系中分離到ERM真菌菌株。這些菌株的氮源吸收特性如何,以及中國ERM真菌資源的營養(yǎng)特性值得研究。以前關(guān)于ERM氮源營養(yǎng)特性的研究僅關(guān)注有機氮或者硝態(tài)氮,同時把銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和有機氮作為研究對象的文獻(xiàn)很少,而ERM對氮源的選擇性在杜鵑花類植物栽培中氮營養(yǎng)選擇具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗擬研究云錦杜鵑4個ERM真菌菌株有機氮、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的吸收利用特性,并分析菌株在不同氮源培養(yǎng)基上對云錦杜鵑接種幼苗生長的影響,篩選菌株培養(yǎng)的適宜氮源,初步探討ERM效應(yīng)的氮源利用機理,以期為ERM菌根技術(shù)在杜鵑花栽培和繁育應(yīng)用中奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1云錦推動erm真菌供試菌株5個,其中4個菌株是從云錦杜鵑根系中分離得到的,并已經(jīng)確認(rèn)為ERM真菌。2個菌株為樹粉孢屬(Oidiodendronsp.)菌種,分別分離自浙江華頂山和湖南幕阜山森林公園的云錦杜鵑;1個菌株為Cryptosporiopsisericae,和另一個未知菌株都分離自浙江華頂山森林公園;還有1個菌株,也是樹粉孢屬菌種(Oidiodendronsp.1),為購自德國的ERM真菌商業(yè)菌株。接種幼苗為云錦杜鵑無菌播種幼苗。1.2學(xué)習(xí)方法1.2.1氮源濃度的篩選以無氮源MMN培養(yǎng)基(modifiedMelin–Norkransagar)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別添加(NH4)2HPO4、Ca(NO3)2、精氨酸和牛血清蛋白(bovineserumalbumin,BSA)4種氮源;氮源的濃度為0.053g·L-1(MMN培養(yǎng)基含氮量),培養(yǎng)基滅菌前pH5。用直徑為0.3cm的打孔器在活化好的菌斑上打孔,每個試管中接入3個菌塊,設(shè)置3個重復(fù)。培養(yǎng)溫度為25℃,轉(zhuǎn)速為150r/min。15d后,取出過濾,在65℃烘箱中烘至恒重,稱量干重。1.2.2云錦松茸接種苗/苗種培養(yǎng)無氮源MMN培養(yǎng)基高壓滅菌后,并分別加入(NH4)2HPO4、Ca(NO3)2、精氨酸、BSA4種氮源作為接種苗培養(yǎng)基,并設(shè)置無氮培養(yǎng)基對照,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5。將供試的5個菌株作為菌劑接種云錦杜鵑播種幼苗。選取高度、長勢一致的云錦杜鵑無菌播種小苗,接種直徑約3mm的活化菌塊,并設(shè)置不接菌株空白對照,置于25℃,相對濕度為65%的氣候箱內(nèi)培養(yǎng),4個月后統(tǒng)計幼苗成活率、觀察接種苗根系侵染率、測量植株干重。1.2.3菌根感染率檢測接種5個月后檢測菌根感染率,菌根感染率采用錐蟲藍(lán)染色法進(jìn)行檢測,在光學(xué)顯微鏡下觀察幼根表皮及皮層細(xì)胞中是否有菌絲結(jié)或菌絲,并估算菌根感染率。菌根感染率=菌根感染的根段長度/檢查的菌根根段總長度×100%2結(jié)果2.1erm真菌在不同氮源培養(yǎng)中的感染情況云錦杜鵑接種幼苗根系錐蟲藍(lán)染色壓片檢測結(jié)果顯示,5個ERM菌株在4種氮源和對照培養(yǎng)基上均能與云錦杜鵑根系形成菌根結(jié)構(gòu)。ERM真菌在有機氮源培養(yǎng)中侵染率較高,無機氮源培養(yǎng)基中較低,無氮條件下侵染率最低(表1)。兩種有機氮源中,樹粉孢屬3個菌株在以BSA為氮源時侵染率較高,分別為56.5%、81.8%和80.5%,C.ericae菌株和未知菌株在以精氨酸為氮源時侵染率較高,分別為73.2%和37.9%;2種無機氮源對接種苗侵染率影響表現(xiàn)也不一致,其中以硝態(tài)氮為氮源時侵染率較高。2.2無機氮與有機氮源對菌株產(chǎn)量的影響純培養(yǎng)條件下,5個菌株的菌絲產(chǎn)量變化較大(表2)。菌株在不同氮源培養(yǎng)基中的菌絲產(chǎn)量差異明顯,3個菌株Oidiodendronsp.2、Oidiodendronsp.3和C.ericae在無機氮與有機氮源條件下產(chǎn)量顯著高于無氮源培養(yǎng)基。除C.ericae菌株外,無機氮培養(yǎng)基中菌絲產(chǎn)量都高于有機氮培養(yǎng)基。以2種無機氮為氮源時,除菌株Oidiodendronsp.3的菌絲產(chǎn)量在(NH4)2HPO4培養(yǎng)基中顯著高于Ca(NO3)2培養(yǎng)基,其它菌株菌絲產(chǎn)量差異都不顯著;2種有機氮源培養(yǎng)基中,菌株Oidiodendronsp.1和Oidiodendronsp.2菌絲產(chǎn)量差異不顯著,菌株Oidiodendronsp.3和C.ericae在BSA培養(yǎng)基菌絲產(chǎn)量顯著高于精氨酸為氮源培養(yǎng)基,未知菌株則在精氨酸培養(yǎng)基菌絲產(chǎn)量顯著高于BSA培養(yǎng)基。2.3接種苗干重的比較5個菌株接種苗在不同氮源培養(yǎng)基中植株干重差異較大(表3)。除菌株C.ericae接種苗干重在以精氨酸為氮源時略高于無氮對照未達(dá)到顯著外,其它菌株接種苗均顯著高于無氮對照。非接種苗在以(NH4)2HPO4為氮源培養(yǎng)基中干重顯著高于在其它氮源培養(yǎng)基上,而接種苗干重在有機氮源培養(yǎng)基高于無機氮源培養(yǎng)基。5個菌株接種苗在BSA為氮源培養(yǎng)基中干重顯著高于在精氨酸培養(yǎng)基上,菌株Oidiodendronsp.1、Oidiodendronsp.2和未知菌株接種苗干重在Ca(NO3)2培養(yǎng)基上顯著高于(NH4)2HPO4培養(yǎng)基。不同菌株接種苗干重在相同氮源中也表現(xiàn)很大的差異,如在Ca(NO3)2培養(yǎng)基中,菌株Oidiodendronsp.1接種苗干重顯著高于其它菌株,在BSA培養(yǎng)基上3個Oidiodendronsp.菌株接種苗干重顯著高于其它菌株。3討論3.1土壤理化性質(zhì)與菌根初始感染的關(guān)系試驗結(jié)果顯示不同氮源的培養(yǎng)基影響云錦杜鵑菌根侵染率。云錦杜鵑幼苗在有機氮精氨酸、BSA培養(yǎng)基上菌根侵染率較高,其中BSA培養(yǎng)基上菌根侵染率最高,而在無機氮培養(yǎng)基上侵染率低。Xiao&Birch調(diào)查發(fā)現(xiàn),在礦質(zhì)營養(yǎng)低、有機質(zhì)含量高的自然生境土壤中,杜鵑花科植物菌根侵染率常比較高。所以,杜鵑花栽培在有機氮源營養(yǎng)豐富的條件下有利于ERM的形成。另外,在不同來源Oidiodendronsp菌株侵染率也不同,如2個分離自云錦杜鵑菌株侵染率明顯高于Oidiodendronsp1菌株,表明ERM菌株與寄主植物間具有一定的選擇性,來自寄主植物的菌株回接親和性最高。3.2云錦松茸增加了硝態(tài)氮、氮、有機氮吸收及在生物中的作用非接種苗在銨態(tài)氮[(NH4)2HPO4]培養(yǎng)基上植株干重顯著高于其它氮源培養(yǎng)基上的幼苗,說明銨態(tài)氮是沒有菌根的云錦杜鵑幼苗生長的較好氮源。菌根形成后,4種氮源培養(yǎng)基上幼苗生長良好,均優(yōu)于非接種苗;尤其是BSA、精氨酸、硝態(tài)氮培養(yǎng)基上接種幼苗生長優(yōu)勢突出,80%以上的接種幼苗比銨態(tài)氮培養(yǎng)上相同菌株的接種苗生長量大。這些結(jié)果表明,菌根的形成增加了云錦杜鵑對銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和有機氮吸收,而且菌根苗更易于吸收硝態(tài)氮和有機氮。對于ERM可以增加寄主植物對有機氮的吸收,文獻(xiàn)從不同角度(主要是圍繞H.ericae及其ERM)對這一功能進(jìn)行了研究,在試驗條件下和自然生境中ERM都能提高藍(lán)莓有機氮的吸收效率,促進(jìn)寄主植物的生長[4,5,6,7,8,9,10,18,19]。因此在杜鵑花生長良好的自然生境中,土壤有機質(zhì)含量常比較高,栽培土腐殖質(zhì)含量的多少直接影響杜鵑花生長的速度和質(zhì)量。這種現(xiàn)象可能與杜鵑花在自然或栽培條件下根系常形成ERM密切相關(guān)。關(guān)于ERM在寄主植物硝態(tài)氮吸收中的作用,相關(guān)的研究資料很少,僅見Kosola等報道了藍(lán)莓苗菌根化后吸收硝態(tài)氮的能力提高。不少文獻(xiàn)對外生菌根在硝態(tài)氮吸收中作用進(jìn)行了研究,根據(jù)不同的栽培條件、寄主植物和共生的菌株類型試驗結(jié)果差異很大,有正向效應(yīng)、負(fù)向效應(yīng)或者沒有影響。依據(jù)本試驗結(jié)果,ERM有效促進(jìn)了云錦杜鵑硝態(tài)氮的吸收及生長,硝態(tài)氮比銨態(tài)氮更適合作為ERM植物的氮源。因此,硝態(tài)氮可能在杜鵑花等ERM植物氮營養(yǎng)利用中扮演著重要角色,但目前仍需要自然或栽培環(huán)境條件下ERM對硝態(tài)氮利用效應(yīng)的更多研究證據(jù)。4云錦松茸erm真菌培養(yǎng)的氮源5個菌株在無機氮培養(yǎng)基中的菌絲產(chǎn)量顯著高于有機氮中的產(chǎn)量,而且硝態(tài)氮和銨態(tài)