影響麻疹igm抗體檢測的因素分析

影響麻疹igm抗體檢測的因素分析

為了認真落實衛(wèi)生部《2006-2012年全國消除癲癇計劃》，在控制和消除癲癇發(fā)作的過程中，不僅要有效地接種流動人口的疫苗，還要準確、及時地檢測皮疹。酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)一步法檢測麻疹I(lǐng)gM抗體具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點而被廣泛應用。為了保證麻疹在實驗室檢測中的穩(wěn)定性、準確性,我們不斷實踐,反復驗證,現(xiàn)就實際工作中發(fā)現(xiàn)的一些影響因素進行探討。1材料和方法1.1材料表面對疑似、確診的麻疹病例進行血液采集,對分離后的血清進行檢測。血清樣本使用統(tǒng)一試劑盒,進行酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA法)。1.2血清樣品由一個單一的測試盒制成，用于酶聯(lián)免疫吸附試驗elisa法1.2.1微板孔溫度的測定先從冰箱中拿出試劑盒,在室溫下放置20~30min后進行測定,可使試劑盒在使用前與室溫平衡,這樣反應微板孔內(nèi)的溫度能較快地達到所需的溫度,以滿足后面的測定需求。1.2.2樣品選擇1.2.2.igm抗體穩(wěn)定性測定使用ELISA方法檢測麻疹I(lǐng)gM抗體,我們一般選用出疹后4~28天的首份血樣。1.2.2.2血液標本的使用(1)盡量低溫保存,防止污染;(2)避免樣本溶血;(3)嚴禁反復凍融,以免對IgM抗體的穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響;(4)實驗樣本過多時,可分批次操作,以減少實驗時間延長造成的誤差;(5)加酶試劑后,用吸水紙吸干孔外試劑;(6)作定量試驗時,使用加樣器加注試劑,并經(jīng)常校正其準確性。1.2.2.存時限不同血清在運輸之前應置于4~8℃保存,保存時限不能超過7天。如果需要保存更長的時間應置于-20℃或更低的溫度冷凍保存。運輸過程要放置冰袋,嚴禁上下顛倒。1.2.3出現(xiàn)在模型試驗中,各部門對結(jié)果準確性比將液體及標本加在孔底,不外濺,避免加在孔壁上部,以免影響結(jié)果的準確性。加樣頭的尖端要避免在孔底掛擦,一次性使用加樣頭,禁止在未充分洗凈或消毒不完全時使用,以免交叉感染而使結(jié)果不準確。1.2.4微孔板溫度測定中的問題根據(jù)試劑盒的說明書選擇溫育的時間、溫度。加完樣本和(或)試劑后將微孔板從室溫放入水浴箱或溫箱中時,孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃需要一定時間,如果是將微孔板一放入溫箱即開始計時,這樣就容易造成實際測定中溫育時間不夠,易致弱陽性標本無法測出。1.3洗不生洗液污染每次溫育結(jié)束后要仔細在每孔加,手工洗板時,入洗液300μl,謹防洗液溢出污染,同時避免洗液量不足造成洗不干凈。洗板間隔按照試劑使用要求停留足夠的時間。洗板流程全部結(jié)束后,再進行拍板干燥板孔,嚴禁洗板中間過程中拍板。進行機洗時,應注意觀察是否有洗液外溢等污染板孔的現(xiàn)象。拍板干燥工作也在洗完的最后進行。1.4按照順序添加“a”溶液和“b”溶液，混合，放入37水浴，冷卻反應30分鐘，并停止溶液的觀察結(jié)果1.5觀察結(jié)果肉眼觀察陽性結(jié)果呈藍色,但弱陽性結(jié)果不易觀察。應使用多功能酶標儀檢測,以保證結(jié)果判斷的正確性。2假陰性產(chǎn)生的原因在大量的日常工作中,ELISA實驗的質(zhì)量保證是一個復雜的過程,許多重要的環(huán)節(jié)都影響到檢測的質(zhì)量,在實際操作中會我們通常會遇到以下一些問題:(1)假陽性的出現(xiàn);(2)復檢與初檢結(jié)果不一致;(3)假陰性的產(chǎn)生導致的漏檢。我們通過大量的臨床實驗發(fā)現(xiàn),以下幾個步驟中較易出現(xiàn)對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響:2.1試劑的準備對試劑的準備一般不太注意,通常的做法是在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用,而忽略了這種做法有可能影響后面時間不夠的問題,其直接的后果是對一些弱陽性標本的檢測出現(xiàn)假陰性。而樣本中含有的類風濕因子在類風濕患者及正常人血清中,常含有較高或不同濃度的類風濕因子(RF),其一般為IgM型,亦有IgG和IgA型,具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點,因為在ELISA測定中,其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標的特異抗體IgG結(jié)合,從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。2.2記錄血液樣品的采集在出疹后的前3天內(nèi),麻疹特異IgM抗體可能會出現(xiàn)30%的假陰性結(jié)果。因此在工作中要仔細記錄血液樣品的采集時間,以備實驗中查找可疑因素。在采血時應注意手法,采集的血液勿用力振蕩,嚴防標本溶血。2.3凍融法分離標本成功率高標本的溶血血紅蛋白中含鐵血紅素有類過氧化物酶的活性,因此,在以辣根過氧化物酶(HRP)為標志的ELISA測定中,如血清樣本中血紅蛋白濃度較高,則很容易在溫育過程中吸附于固相,從而與后面加入的HRP底物反應顯色。冰凍保存的標本反復凍融產(chǎn)生機械剪切力對標本中的蛋白等分子有破壞作用,可引起假陰性結(jié)果。因此,ELI-SA檢測盡量采用新鮮標本,標本凝固不全的血清中含有部分纖維蛋白原,可使結(jié)果呈假陽性。溶血標本易使麻疹I(lǐng)gM抗體產(chǎn)生假陽性結(jié)果,可能是因為溶血標本有過氧化物酶活性,與辣根過氧化物酶作用相似,能與聚乙烯孔內(nèi)預包被的抗體結(jié)合,由于難于完全洗脫,殘留過氧化物催化底物顯色,產(chǎn)生假陽性。2.4滴瓶滴加試劑量不確定在加樣過程中,加樣時間過長,酶試劑加出孔外,使用滴瓶滴加試劑時,滴加的角度不同和擠壓的力度不同,致使滴加的試劑量不準,都可導致試驗結(jié)果不準確。2.5elisa檢測表現(xiàn)酶聯(lián)免疫法加入酶標物37℃溫育30min對測定結(jié)果有影響,易產(chǎn)生弱陽性造成誤檢。加入酶標物37℃溫育60min,溫育時間長,殘留的過氧化物酶含量極微,再經(jīng)洗滌降低了殘留的可能性,雖然費時,但與37℃溫育30min相比,靈敏度更高、特異性更強,能保證結(jié)果的準確性。因此,在實際操作中采用37℃溫育60min。此外,我們還應在實驗中注意“邊緣效應”,其產(chǎn)生的原因可能是因為96孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學梯度造成的,因此在溫育時盡量采用水浴。慎重選擇試劑盒和內(nèi)部質(zhì)控血清檢測值做質(zhì)控圖,能讓我們很容易監(jiān)測ELISA實驗的一致性,從而盡早發(fā)現(xiàn)實際工作中的問題,避免在實際工作中的一些客觀影響因素。隨著科技在各個領(lǐng)域的飛速發(fā)展,麻疹病毒的檢測方法也在不斷地更新,酶聯(lián)免疫吸附法檢測麻疹I(lǐng)gM抗體作為診斷麻疹的重要方法,目前已被廣泛應用。在長期大量的工作實踐中,我們發(fā)現(xiàn)不同批次的ELISA試劑在制作過程中很難保證質(zhì)量完全一致,即使是通過批檢的試劑其檢測結(jié)果也存在差異,因此必須選擇和訂購長批號的試劑,并按保存條件存放。嚴格執(zhí)行這一標準可以避免因試劑批號改變而重新建立質(zhì)量控制體系及重新評估試劑的復雜過程,并且能夠保證結(jié)果的穩(wěn)定性;對于效期短、使用率低的試劑,應當小量分裝,每次使用則取分裝部分即可,避免反復凍融造成試劑的失效。在實際的工作中我們也認識到,除了要提高操作技術(shù)水平外,還有必要對常用試劑的性能進行比較考察,從而選擇靈敏度和特異性相對較高的試劑盒。同時,我們按一定的時間間隔在實驗中加入一些按照部、