影響麻疹igm抗體檢測(cè)的因素分析

影響麻疹igm抗體檢測(cè)的因素分析

為了認(rèn)真落實(shí)衛(wèi)生部《2006-2012年全國(guó)消除癲癇計(jì)劃》，在控制和消除癲癇發(fā)作的過程中，不僅要有效地接種流動(dòng)人口的疫苗，還要準(zhǔn)確、及時(shí)地檢測(cè)皮疹。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)一步法檢測(cè)麻疹I(lǐng)gM抗體具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。為了保證麻疹在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性,我們不斷實(shí)踐,反復(fù)驗(yàn)證,現(xiàn)就實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)的一些影響因素進(jìn)行探討。1材料和方法1.1材料表面對(duì)疑似、確診的麻疹病例進(jìn)行血液采集,對(duì)分離后的血清進(jìn)行檢測(cè)。血清樣本使用統(tǒng)一試劑盒,進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA法)。1.2血清樣品由一個(gè)單一的測(cè)試盒制成，用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa法1.2.1微板孔溫度的測(cè)定先從冰箱中拿出試劑盒,在室溫下放置20~30min后進(jìn)行測(cè)定,可使試劑盒在使用前與室溫平衡,這樣反應(yīng)微板孔內(nèi)的溫度能較快地達(dá)到所需的溫度,以滿足后面的測(cè)定需求。1.2.2樣品選擇1.2.2.igm抗體穩(wěn)定性測(cè)定使用ELISA方法檢測(cè)麻疹I(lǐng)gM抗體,我們一般選用出疹后4~28天的首份血樣。1.2.2.2血液標(biāo)本的使用(1)盡量低溫保存,防止污染;(2)避免樣本溶血;(3)嚴(yán)禁反復(fù)凍融,以免對(duì)IgM抗體的穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響;(4)實(shí)驗(yàn)樣本過多時(shí),可分批次操作,以減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)造成的誤差;(5)加酶試劑后,用吸水紙吸干孔外試劑;(6)作定量試驗(yàn)時(shí),使用加樣器加注試劑,并經(jīng)常校正其準(zhǔn)確性。1.2.2.存時(shí)限不同血清在運(yùn)輸之前應(yīng)置于4~8℃保存,保存時(shí)限不能超過7天。如果需要保存更長(zhǎng)的時(shí)間應(yīng)置于-20℃或更低的溫度冷凍保存。運(yùn)輸過程要放置冰袋,嚴(yán)禁上下顛倒。1.2.3出現(xiàn)在模型試驗(yàn)中,各部門對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性比將液體及標(biāo)本加在孔底,不外濺,避免加在孔壁上部,以免影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。加樣頭的尖端要避免在孔底掛擦,一次性使用加樣頭,禁止在未充分洗凈或消毒不完全時(shí)使用,以免交叉感染而使結(jié)果不準(zhǔn)確。1.2.4微孔板溫度測(cè)定中的問題根據(jù)試劑盒的說明書選擇溫育的時(shí)間、溫度。加完樣本和(或)試劑后將微孔板從室溫放入水浴箱或溫箱中時(shí),孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃需要一定時(shí)間,如果是將微孔板一放入溫箱即開始計(jì)時(shí),這樣就容易造成實(shí)際測(cè)定中溫育時(shí)間不夠,易致弱陽性標(biāo)本無法測(cè)出。1.3洗不生洗液污染每次溫育結(jié)束后要仔細(xì)在每孔加,手工洗板時(shí),入洗液300μl,謹(jǐn)防洗液溢出污染,同時(shí)避免洗液量不足造成洗不干凈。洗板間隔按照試劑使用要求停留足夠的時(shí)間。洗板流程全部結(jié)束后,再進(jìn)行拍板干燥板孔,嚴(yán)禁洗板中間過程中拍板。進(jìn)行機(jī)洗時(shí),應(yīng)注意觀察是否有洗液外溢等污染板孔的現(xiàn)象。拍板干燥工作也在洗完的最后進(jìn)行。1.4按照順序添加“a”溶液和“b”溶液，混合，放入37水浴，冷卻反應(yīng)30分鐘，并停止溶液的觀察結(jié)果1.5觀察結(jié)果肉眼觀察陽性結(jié)果呈藍(lán)色,但弱陽性結(jié)果不易觀察。應(yīng)使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè),以保證結(jié)果判斷的正確性。2假陰性產(chǎn)生的原因在大量的日常工作中,ELISA實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量保證是一個(gè)復(fù)雜的過程,許多重要的環(huán)節(jié)都影響到檢測(cè)的質(zhì)量,在實(shí)際操作中會(huì)我們通常會(huì)遇到以下一些問題:(1)假陽性的出現(xiàn);(2)復(fù)檢與初檢結(jié)果不一致;(3)假陰性的產(chǎn)生導(dǎo)致的漏檢。我們通過大量的臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),以下幾個(gè)步驟中較易出現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響:2.1試劑的準(zhǔn)備對(duì)試劑的準(zhǔn)備一般不太注意,通常的做法是在實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑從冰箱中拿出來即用,而忽略了這種做法有可能影響后面時(shí)間不夠的問題,其直接的后果是對(duì)一些弱陽性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。而樣本中含有的類風(fēng)濕因子在類風(fēng)濕患者及正常人血清中,常含有較高或不同濃度的類風(fēng)濕因子(RF),其一般為IgM型,亦有IgG和IgA型,具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點(diǎn),因?yàn)樵贓LISA測(cè)定中,其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標(biāo)的特異抗體IgG結(jié)合,從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。2.2記錄血液樣品的采集在出疹后的前3天內(nèi),麻疹特異IgM抗體可能會(huì)出現(xiàn)30%的假陰性結(jié)果。因此在工作中要仔細(xì)記錄血液樣品的采集時(shí)間,以備實(shí)驗(yàn)中查找可疑因素。在采血時(shí)應(yīng)注意手法,采集的血液勿用力振蕩,嚴(yán)防標(biāo)本溶血。2.3凍融法分離標(biāo)本成功率高標(biāo)本的溶血血紅蛋白中含鐵血紅素有類過氧化物酶的活性,因此,在以辣根過氧化物酶(HRP)為標(biāo)志的ELISA測(cè)定中,如血清樣本中血紅蛋白濃度較高,則很容易在溫育過程中吸附于固相,從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。冰凍保存的標(biāo)本反復(fù)凍融產(chǎn)生機(jī)械剪切力對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子有破壞作用,可引起假陰性結(jié)果。因此,ELI-SA檢測(cè)盡量采用新鮮標(biāo)本,標(biāo)本凝固不全的血清中含有部分纖維蛋白原,可使結(jié)果呈假陽性。溶血標(biāo)本易使麻疹I(lǐng)gM抗體產(chǎn)生假陽性結(jié)果,可能是因?yàn)槿苎獦?biāo)本有過氧化物酶活性,與辣根過氧化物酶作用相似,能與聚乙烯孔內(nèi)預(yù)包被的抗體結(jié)合,由于難于完全洗脫,殘留過氧化物催化底物顯色,產(chǎn)生假陽性。2.4滴瓶滴加試劑量不確定在加樣過程中,加樣時(shí)間過長(zhǎng),酶試劑加出孔外,使用滴瓶滴加試劑時(shí),滴加的角度不同和擠壓的力度不同,致使滴加的試劑量不準(zhǔn),都可導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。2.5elisa檢測(cè)表現(xiàn)酶聯(lián)免疫法加入酶標(biāo)物37℃溫育30min對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響,易產(chǎn)生弱陽性造成誤檢。加入酶標(biāo)物37℃溫育60min,溫育時(shí)間長(zhǎng),殘留的過氧化物酶含量極微,再經(jīng)洗滌降低了殘留的可能性,雖然費(fèi)時(shí),但與37℃溫育30min相比,靈敏度更高、特異性更強(qiáng),能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此,在實(shí)際操作中采用37℃溫育60min。此外,我們還應(yīng)在實(shí)驗(yàn)中注意“邊緣效應(yīng)”,其產(chǎn)生的原因可能是因?yàn)?6孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學(xué)梯度造成的,因此在溫育時(shí)盡量采用水浴。慎重選擇試劑盒和內(nèi)部質(zhì)控血清檢測(cè)值做質(zhì)控圖,能讓我們很容易監(jiān)測(cè)ELISA實(shí)驗(yàn)的一致性,從而盡早發(fā)現(xiàn)實(shí)際工作中的問題,避免在實(shí)際工作中的一些客觀影響因素。隨著科技在各個(gè)領(lǐng)域的飛速發(fā)展,麻疹病毒的檢測(cè)方法也在不斷地更新,酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)麻疹I(lǐng)gM抗體作為診斷麻疹的重要方法,目前已被廣泛應(yīng)用。在長(zhǎng)期大量的工作實(shí)踐中,我們發(fā)現(xiàn)不同批次的ELISA試劑在制作過程中很難保證質(zhì)量完全一致,即使是通過批檢的試劑其檢測(cè)結(jié)果也存在差異,因此必須選擇和訂購長(zhǎng)批號(hào)的試劑,并按保存條件存放。嚴(yán)格執(zhí)行這一標(biāo)準(zhǔn)可以避免因試劑批號(hào)改變而重新建立質(zhì)量控制體系及重新評(píng)估試劑的復(fù)雜過程,并且能夠保證結(jié)果的穩(wěn)定性;對(duì)于效期短、使用率低的試劑,應(yīng)當(dāng)小量分裝,每次使用則取分裝部分即可,避免反復(fù)凍融造成試劑的失效。在實(shí)際的工作中我們也認(rèn)識(shí)到,除了要提高操作技術(shù)水平外,還有必要對(duì)常用試劑的性能進(jìn)行比較考察,從而選擇靈敏度和特異性相對(duì)較高的試劑盒。同時(shí),我們按一定的時(shí)間間隔在實(shí)驗(yàn)中加入一些按照部、