GID-CTLH復合體的研究進展

GID/CTLH復合體的研究進展

張秀飛李清平孫雯雯陳新王璐文趙慶臻(聊城大學生命科學學院,山東聊城252059)0引言酵母中的葡萄糖誘導降解缺陷(glucoseinduceddeficient,GID)復合體是由多個亞基組成的高分子量蛋白復合體,它能夠幫助細胞快速應對微環(huán)境中營養(yǎng)狀態(tài)的改變,在單細胞酵母糖類代謝途徑調(diào)控中發(fā)揮重要作用[1];哺乳動物中也存在著一種在進化上與酵母GID復合體同源的CTLH(Carboxy-terminaltoLisH)復合體,該復合體的命名來源于其多個組成亞基中大都含有CTLH結(jié)構(gòu)域[2]。這兩類高分子量的蛋白復合體在進化上具有同源關系,盡管對于此類蛋白復合體的研究仍處于起步階段,但現(xiàn)有的研究結(jié)果已證明其具有獨特的作用方式和極其重要的生物學功能。1存在于GID/CTLH復合體蛋白亞基中主要結(jié)構(gòu)域保守的蛋白質(zhì)基序或結(jié)構(gòu)域通常意味著蛋白質(zhì)具有特定的功能特征。CTLH復合體是一個穩(wěn)定的多亞基復合體,其亞基成員由多個結(jié)構(gòu)域組成,其中常見的結(jié)構(gòu)域包括LisH(LIS1-homology,LisH)、CTLH、CRA等。酵母GID復合體和哺乳動物CTLH復合體分別由7個和8個亞基組成,其中各有5個核心亞基且均具有LisH和CTLH結(jié)構(gòu)域,這也是CTLH復合體名稱的由來原因。具有LisH-CTLH結(jié)構(gòu)域的亞基中,大部分成員同時還包含CRA結(jié)構(gòu)域;此外,在不同亞基中還分別存在SPRY、ARM和RING等結(jié)構(gòu)域。具體情況見表1。表1GID/CTLH復合體的亞基及其結(jié)構(gòu)域組成(修改自[13]及[20])LIS1-同源性(LIS1-homology,LisH)區(qū)域,最初發(fā)現(xiàn)于影響人神經(jīng)元遷移過程的LIS1蛋白。Lis1序列在不同生物中高度保守,其中由第1～39氨基酸殘基組成的N端部分即為LisH基序[3,4],目前已知LisH基序存在于100多種真核蛋白中,一般包含35個氨基酸左右[4];研究發(fā)現(xiàn)含有LisH基序蛋白質(zhì)的一般特征是二聚作用,而且依賴LisH的二聚化是包含此結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的共同特征[4-6];同時LisH二聚化對蛋白質(zhì)功能非常重要,二聚化功能缺失會影響蛋白質(zhì)的半衰期和定位[7]。而且由LisH起始的二聚化是形成蛋白質(zhì)多聚體的必須條件[8,9];LisH基序還有可能通過影響蛋白質(zhì)二聚化或其他一些過程從而調(diào)節(jié)微管的動態(tài)變化和細胞遷移[3]。CTLH一般位于LisH的C端,大約由60個氨基酸組成,其結(jié)構(gòu)域以α-螺旋區(qū)為主,結(jié)構(gòu)預測表明其中包括三個被短環(huán)隔開的α-螺旋。CTLH結(jié)構(gòu)域一般是與LisH共同存在于同一個蛋白中,但也有個別情況下單獨出現(xiàn);多種蛋白質(zhì)中包含CTLH結(jié)構(gòu)域,其中一些與微管動力學、核分裂、細胞遷移和染色體分離有關[10]。CRA(CT11-RanBPM)結(jié)構(gòu)域最初是在人RanBPM蛋白中鑒定出的一個新結(jié)構(gòu)域,位于RanBPM的C末端區(qū)域,由大約100個氨基酸組成,此區(qū)域具有很強的螺旋化傾向,共形成約六個α-螺旋結(jié)構(gòu)。研究表明,RanBPM正是通過其C末端的CRA結(jié)構(gòu)域與其互作蛋白FMTP的相互作用,因此CRA也具有識別其他蛋白并實現(xiàn)蛋白-蛋白相互作用的功能[10,11]。RING(Reallyinterestingnewgene)結(jié)構(gòu)域是RING類型泛素連接酶特有的結(jié)構(gòu)域,一般包含40-60個氨基酸,其中的8個保守的半胱氨酸(Cys)和組氨酸(His)殘基與兩個Zn2＋離子結(jié)合從而維持住一個獨特的交叉支撐結(jié)構(gòu);根據(jù)這8個關鍵氨基酸位點的組成,又將RING結(jié)構(gòu)域分為C3H2C3及C3HC4兩大類型。GID/CTLH復合體中的少數(shù)亞基成員具有RING結(jié)構(gòu)域,該復合體也已被證明確實具有泛素連接酶活性。GID/CTLH復合體由多個亞基組成,而這些亞基也基本上各自包含多種結(jié)構(gòu)域,這個特征也暗示該復合體具有多方面的生物學功能。雖然目前關于GID/CTLH復合體的生物學功能的研究尚處于初步階段,但已有結(jié)果已表明其參與細胞內(nèi)多個重要生理生化途徑的調(diào)節(jié),這也與該復合體多亞基及多結(jié)構(gòu)域的特征相一致。2不同生物中GID/CTLH復合體的亞基組成2.1酵母GID/CTLH復合體的組成當釀酒酵母細胞從非發(fā)酵碳源轉(zhuǎn)移到含有足量葡萄糖的培養(yǎng)基環(huán)境中時,糖異生關鍵酶果糖-1,6-二磷酸酶(Fbp1)會發(fā)生快速的代謝降解,以關閉糖異生途徑[1,12-14]。本世紀初,德國Wolf實驗室通過篩選對葡萄糖誘導的Fbp1代謝降解缺陷(glucoseinduceddeficient,GID)的酵母突變體,先后共找到9個GID相關基因,分別命名為GID1-9[15,16]。隨后對這些基因的功能分析發(fā)現(xiàn),GID3是泛素耦合酶UBC8p[16],GID6是去泛素化酶Ubp14p[15];其余七個GID蛋白則同屬于一個蛋白復合體即GID復合體。因此GID復合體至少由七個亞基組成[1],在細胞內(nèi)進行糖異生反應狀態(tài)下,GID復合體由除GID4之外的其余6個亞基組成,當有足夠的葡萄糖可供酵母細胞利用時,作為誘導亞基的GID4結(jié)合到復合體上,從而引發(fā)GID復合體的泛素連接酶E3活性,使得Fbp1等糖異生關鍵酶發(fā)生泛素化降解[1,17],從而快速關閉糖異生途徑,保證酵母細胞能夠經(jīng)濟有效地利用碳源和能量物質(zhì)。2.2動植物GID/CTLH復合體的組成GID復合體和哺乳動物中高分子量蛋白復合體CTLH復合體的蛋白質(zhì)亞基成分存在于真核生物的多個譜系中,說明它們起源于真核生物共同的祖先[10]。在細胞質(zhì)和細胞核中廣泛定位的CTLH復合體就是酵母GID復合體的同源物,七種酵母GID蛋白在人體CTLH復合體亞基中均有同源蛋白,但相對于單細胞真核生物酵母來說,酵母中的單基因在人中又進化成兩個高度同源的不同基因,如GID1在人類體內(nèi)已經(jīng)進化成兩個高度同源的不同基因RanBP9(Ranbpm)和RanBP10(又稱Scorpins)[18];GID2則對應于人中的RMND5A和RMND5B[19]。另外,CTLH復合體中的YPEL5亞基與酵母Moh1同源,但后者被認為并不是酵母GID復合體的必須亞基[20]。具體見表1。植物由于其固著生長的特性,不能像動物通過改變位置來躲避惡劣環(huán)境,因此長期進化過程中在植物體內(nèi)形成了更加精細復雜的基因表達調(diào)控系統(tǒng),以幫助植物體盡量適應復雜多變的環(huán)境條件,因此相對于酵母和動物,在植物體內(nèi)往往存在更多數(shù)目的同源基因,同時也使得植物中有更多的基因冗余現(xiàn)象,GID/CTLH復合體的亞基在植物體內(nèi)的同源基因亦是如此。到目前為止,還沒有任何有關在植物體內(nèi)GID/CTLH完整復合體的報道,但進化關系分析表明GID/CTLH復合體的絕大多數(shù)亞基在模式植物擬南芥體內(nèi)都具有更多數(shù)目的同源基因[10]。3GID/CTLH復合體是有功能的泛素連接酶3.1泛素26S蛋白酶體系統(tǒng)及泛素連接酶泛素26S蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin26Sproteasomesystem,UPS)是所有真核生物體內(nèi)具有的高度選擇性的蛋白質(zhì)降解途徑,其中泛素化修飾是底物蛋白被送入26S蛋白酶體中降解的前提條件。哺乳動物中通過26S蛋白酶體降解約80%的多泛素化蛋白包括異常蛋白質(zhì)以及大量的調(diào)節(jié)蛋白等,因此UPS在真核細胞內(nèi)參與各種生理生化途徑及信號通路的調(diào)控[21-23]。泛素(ubiquitin,Ub)是一種只有76個氨基酸的小蛋白,泛素共價連接到底物蛋白上(主要結(jié)合位點是賴氨酸側(cè)鏈的氨基)稱為蛋白質(zhì)的泛素化修飾,該過程是通過泛素激活酶E1(ubiquitin-activating-enzyme)、泛素耦合酶E2(ubiquitin-conjugating-enzyme)和泛素連接酶E3(ubiquitinligase)的依次級聯(lián)反應完成[23];蛋白質(zhì)的泛素化修飾有不同的立體構(gòu)型,E2在這方面具有很大的影響作用,而E3主要負責底物蛋白的特異性[24],特定的E2-E3組合能夠調(diào)控特定的底物蛋白發(fā)生特定類型的泛素化修飾,從而決定底物蛋白的命運[25]。目前已知人體中大約有600種不同的E3泛素連接酶,負責將短壽命的調(diào)控蛋白、異常蛋白等送入26S蛋白酶體中降解[26]。E3蛋白的活性結(jié)構(gòu)域主要包括兩大類型:HECT(homologtoE6-APCterminal,HECT)和RING(Reallyinterestingnewgenes,RING)[27]。具有HECT結(jié)構(gòu)域的E3首先接受來自于E2-Ub中間體的泛素分子,然后再將泛素轉(zhuǎn)移到底物蛋白上;RING類型E3則不直接結(jié)合泛素,而是幫助E2將泛素轉(zhuǎn)移到底物上,其中的RING域負責與E2結(jié)合并刺激泛素轉(zhuǎn)移。RING結(jié)構(gòu)域采用具有兩個Zn2＋離子的保守交叉支撐結(jié)構(gòu),可以是單體或二聚體,二聚化由RING結(jié)構(gòu)域單獨或由側(cè)翼螺旋區(qū)域促進。另外還有與經(jīng)典的RING結(jié)構(gòu)域很相似但又有所不同的Ubox及Ring變異體(RINGvariants,RINGv)[28]以及較晚發(fā)現(xiàn)的RBR結(jié)構(gòu)域等。3.2GID/CTLH復合體具有E3泛素連接酶活性根據(jù)亞基組成,E3泛素連接酶分為單亞基E3和多亞基E3。常見的單亞基E3有HECT類型E3和RING類型E3,多亞基E3有SCF類E3、BTB類E3、DDB類E3以及APC類E3;而這幾種多亞基E3中均包括具有RING結(jié)構(gòu)域的亞基成員[29]。GID/CTLH復合體雖然也是由多個亞基組成的蛋白復合體行使E3功能,而且GID復合體的GID2和GID9及CTLH復合體中RMND5A和MAGA亞基都具有RING結(jié)構(gòu)域[1,10,30,31],但其的其他亞基組成與SCF、BTB、DDB及APC類E3大不相同,是比較特殊的一類蛋白復合體類E3。另外,雖然CTLH復合體與酵母GID復合體在進化上同源,但作為E3泛素連接酶,這二者在底物特異性上又大不相同。GID復合體能夠泛素化糖異生酶,如果糖-1,6-二磷酸酯酶(Fbp1),磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pck1)和蘋果酸脫氫酶(Mdh2),調(diào)控它們泛素化降解[1,12],從而保證酵母細胞在不同碳源環(huán)境下快速啟動或關閉糖異生途徑。而目前已知在人類細胞中與CTLH復合體參與的泛素化降解相關的底物蛋白有該復合體自身組成亞基之一Muskelin[31]和細胞增殖相關轉(zhuǎn)錄因子Hbp1[19]。這二者均不是糖異生途徑調(diào)節(jié)酶,這種底物特異性的差別可能與多細胞復雜有機體與單細胞酵母生理特性的區(qū)別有關。最新研究發(fā)現(xiàn),人類GID復合體(hGID)即CTLH復合體具有兩種不同的底物識別模塊,分別依賴WDR26和GID4。在體外條件下,WDR26與RanBP9共同作用將Hbp1泛素化,此過程不需要GID4;而對另一個底物ZMYND19的識別中則需要GID4的參與,令人驚奇的是ZMYND19并不具有Pro/N-末端規(guī)則的特征[32]。隨著研究的深入,相信會有更多的CTLH復合體的泛素化修飾底物被發(fā)現(xiàn),從而幫助我們更加深入地理解CTLH復合體的生理功能及作用機制。4GID/CTLH復合體的功能目前在原核生物中并未發(fā)現(xiàn)GID/CTLH復合體亞基同源成分[1,2],因此GID/CTLH復合體應該是真核細胞中特有的,這也與泛素化修飾是真核細胞中特有的翻譯后修飾相符合。4.1酵母GID復合體的功能當葡萄糖缺乏時,糖異生途徑可以從前體分子合成細胞所需要的葡萄糖,該途徑的活性受到嚴格調(diào)控,以避免在有足夠葡萄糖存在時,糖異生和糖酵解途徑同時運轉(zhuǎn)導致無效ATP水解造成能量浪費[33]。酵母GID復合體的作用就是在給饑餓細胞補充足夠的葡萄糖時,作為E3泛素連接酶快速泛素化細胞內(nèi)的糖異生途徑關鍵酶,介導它們的蛋白酶體降解,從而快速關閉糖異生途徑[1,12,13]。后來發(fā)現(xiàn)N末端Pro及其隨后的一段靈活可變的氨基酸序列可以作為GID復合體底物的識別標志,說明酵母細胞中可能存在一種基于GID的保守的蛋白降解途徑,并將其命名為Pro/N-末端規(guī)則通路(Pro/N-endrulepathway)[12]。迄今為止酵母中已知的GID底物僅限于在特定糖環(huán)境下的糖異生關鍵酶,是否存在其他類型的底物目前仍不清楚。4.2哺乳動物CTLH復合體的功能CTLH復合體在細胞核與細胞質(zhì)中均有表達,它能夠迅速接收細胞外的不同信號,協(xié)調(diào)細胞發(fā)生可逆的變化,從而適應不斷變化的環(huán)境。目前CTLH復合體的研究仍處于初期階段,復合體中大多數(shù)的成分以及功能仍不清楚,但從已知的研究中已發(fā)現(xiàn)哺乳動物該復合體的功能涉及細胞內(nèi)多個不同的生理途徑。比如CTLH復合體成員可以參與智力障礙、神經(jīng)退化性疾病和人格障礙有關過程[8,13,34],且能調(diào)控c-Raf的降解、抑制細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成[35],并且CTLH蛋白也可參與特定細胞群和組織發(fā)育過程[34,36-38]。例如TWA1是CTLH復合體中最小的組成蛋白,僅由LisH、CTLH和CRA這三個結(jié)構(gòu)域組成,在真核生物中高度保守,在結(jié)構(gòu)二聚化中發(fā)揮重要作用[39];Armc8能夠促進肝細胞生長因子調(diào)節(jié)酪氨酸激酶底物(HRS)與泛素化蛋白相互作用以及調(diào)節(jié)環(huán)蛋白降解[40];MAEA是紅細胞巨噬細胞的附著蛋白,能夠在紅細胞被擠壓時發(fā)揮作用;但在非紅細胞中,MAEA則是核蛋白[41];WDR47是真核生物中最大的蛋白家族的成員之一,它在細胞增殖、神經(jīng)元遷移和纖維束投射中發(fā)揮作用,同時WDR47與LIS1結(jié)構(gòu)同源,其突變會導致無腦畸形[42];Muskelin和RanBP9是CTLH復合物蛋白中研究最詳細、功能最清楚的蛋白,Muskelin在細胞內(nèi)的分布受寡聚狀態(tài)的調(diào)控,并依賴于LisH結(jié)構(gòu)域介導的二聚化[43],同時它在細胞形態(tài)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和突觸過程中發(fā)揮作用[44-46],RanBP9可整合到多種蛋白質(zhì)復合體中,進而參與信號轉(zhuǎn)導、神經(jīng)退行性變和精子形成等過程[36,47-49]。在泛素化修飾的三個關鍵酶中,E3泛素連接酶主要負責底物蛋白的特異性選擇。酵母中GID復合體的底物是糖異生途徑的調(diào)節(jié)酶,但研究表明人類CTLH復合體對于糖異生調(diào)節(jié)酶的泛素化降解并不是必須的[19]。因此,雖然很多代謝途徑從細菌到人類均高度相似,但其相關生物學過程以及調(diào)控機制由于適應不同生物體的需求而產(chǎn)生了很大區(qū)別。目前已明確的被CTLH復合體識別并泛素化降解的底物是調(diào)控很多促生長調(diào)節(jié)因子基因表達的轉(zhuǎn)錄因子Hbp1[19],且在此過程中與CTLH復合體協(xié)同作用的E2-UBC2H,也是酵母GID復合體協(xié)同作用的酵母E2-UBC8/GID3的人類同源基因。另外,還發(fā)現(xiàn)CTLH復合體在體外條件下可以降解其自身亞基之一的Muskelin,說明CTLH復合體可能具有自身調(diào)控功能。但此過程目前僅有體外實驗結(jié)果,且其中發(fā)揮作用的E2是UBE2D1、UBE2D2和UBE2D3而不是UBC2H,因此Muskelin是否為CTLH復合體的泛素化降解底物還需要體內(nèi)實驗來確定[31]。目前初步的研究結(jié)果已經(jīng)證實人類CTLH復合體的生物學功能涉及到多個細胞生理途徑,可以推測CTLH復合體應該有多個/種底物蛋白質(zhì),相信隨著研究的深入,會有更多的CTLH復合體的底物蛋白被發(fā)現(xiàn),進而CTLH復合體調(diào)節(jié)細胞生理途徑的機制也會越來越清晰。醫(yī)學領域的研究發(fā)現(xiàn)CTLH復合體的功能與癌癥的發(fā)生明顯相關。CTLH復合體在人類惡性腫瘤中的整體表達增強中發(fā)揮作用,對高增殖和應激性腫瘤細胞也很重要。它在腫瘤細胞發(fā)生的早期階段具有抑瘤作用,但在腫瘤形成以后,這種抗腫瘤功能將變成有利于腫瘤生長[50]。已知癌癥細胞的可塑性和適應性是癌癥治療困難的重要障礙[51,52],與各種信號通路相連的大分子復合體非常適合作為細胞可塑性的調(diào)節(jié)器,因為它們能夠快速重塑并改變成員組成,CTLH復合體正是這樣的大分子復合體。由于CTLH復合體在細胞核和細胞質(zhì)中均有定位、能夠影響其他蛋白的穩(wěn)定性和亞細胞定位[13,49],同時它與各種信號通路和癌細胞可塑性的基本生物學過程均有聯(lián)系,且已證明CTLH復合體基因的過表達影響了癌細胞可塑性[53,54],因此它可以結(jié)合不同的細胞外信號和快速可逆調(diào)節(jié)細胞變化,從而在癌癥發(fā)生或抑瘤過程中起著重要的調(diào)控作用。4.3植物中GID/CTLH復合體同源基因的功能研究進展目前尚未有植物中GID/CTLH復合體的相關報道,但已有少數(shù)與GID/CTLH復合體亞基同源的植物基因功能的分析結(jié)果。RanBPM(RanBP9)最初是作為人類細胞中與中心體相關蛋白被報道的,基于序列的相似性,找到了人類RanBPM在擬南芥中的同源物AtRanBPM,發(fā)現(xiàn)AtRanBPM主要存在于細胞質(zhì)中一個分子量約230-500kDa的蛋白復合體中,AtRanBPM具有高度保守的SPRY、LisH、CTLH、CRA結(jié)構(gòu)域利用IP-MS方法鑒定出多種AtRanBPM的相互作用蛋白,它們也是包含有LisH、CRA、RING-U-box等結(jié)構(gòu)域,且這些蛋白在酵母及人中的同源物都是GID/CTLH復合體的組成亞基[55],因此這個包含有AtRanBPM的大分子量復合體很有可能是植物中的GID/CTLH復合體。WDrepeat蛋白AtWDS1定位于細胞核中,它能夠與AtRanBPM相互作用,且AtRanBPM基因突變會導致AtWDS1部分定位于細胞質(zhì)。研究表明AtWDS1是一種新的氧化還原穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子,能夠通過響應發(fā)育和脅迫信號來調(diào)節(jié)葉片衰老的過程[56]。除了AtRanBPM及AtWDS1這種與GID/CTLH亞基同源的基因,還有一些雖不與GID/CTLH亞基同源但同樣具有SPRY、LisH、CTLH或CRA結(jié)構(gòu)域的植物基因。擬南芥中對于激素信號和發(fā)育過程有重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄共抑制因子TOPLESS(TPL)蛋白中就包含LisH、CTLH和CRA結(jié)構(gòu)域,相對于哺乳動物同源蛋白TBL1,植物TPL演化出了新的蛋白四聚化界面以及一個獨特的結(jié)合抑