新型殺菌劑苯噻菌酯生物學(xué)特性及其對(duì)小麥生長的影響

新型殺菌劑苯噻菌酯生物學(xué)特性及其對(duì)小麥生長的影響

苯妥英鈉，試驗(yàn)代碼y5247，化學(xué)名稱為（e）-2-h-【2-5-甲基苯基二-硫甲基）-3-甲基丙烯酸酯（結(jié)構(gòu)見scheme1）。這是由中國和外國研究人員成功開發(fā)的一種新型qoi劑。目前，它正在申請(qǐng)中國的農(nóng)藥登記。QoI類殺菌劑是一類可阻止病原菌細(xì)胞色素b和c1之間的電子傳遞、干擾其呼吸作用和ATP合成的化合物。前期研究表明,在室內(nèi)條件下苯噻菌酯對(duì)黃瓜霜霉病菌、黃瓜白粉病菌和草莓白粉病菌具有強(qiáng)烈的抑菌活性,在田間也表現(xiàn)出良好的防治效果。本研究進(jìn)一步報(bào)道該化合物對(duì)9種重要植物病原菌的毒力及其對(duì)小麥白粉病的保護(hù)與治療作用,同時(shí)揭示其在小麥植株上的內(nèi)吸與輸導(dǎo)特性、耐雨淋能力和持效期等生物學(xué)特性,旨在為苯噻菌酯安全、高效地使用提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1試驗(yàn)藥劑和儀器試驗(yàn)用野生敏感型的植物病原菌包括小麥赤霉病菌Fusariumgraminearum、水稻紋枯病菌Rhizoctoniasolani、小麥白粉病菌Blumeriagraminis、油菜菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum、辣椒疫霉病菌Phytophthoracapsici、稻瘟病菌Pyriculariaoryzae、番茄早疫病菌Alternariasolani、辣椒炭疽菌Colletotrichumcapsici和草莓灰霉病菌Botrytiscinerea,均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)殺菌劑實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。97%苯噻菌酯(benzothiostrobin)原藥由華中師范大學(xué)提供;對(duì)照藥劑93%嘧菌酯(azoxystrobin)原藥由先正達(dá)公司提供。供試藥劑用甲醇配制成1.0×104μg/mL的母液后稀釋使用。99%水楊肟酸(salicylhydroxamicacid,SHAM),由美國AcrosOrganics公司生產(chǎn),用甲醇配制成5.0×104μg/mL的母液后稀釋使用。試驗(yàn)用培養(yǎng)基AEA的組成為:酵母5g,甘油20mL,MgSO40.25g,NaNO36g,KCl0.5g,KH2PO41.5g,瓊脂粉20g,用去離子水定容至1000mL,pH約為6.0;PDA培養(yǎng)基、利馬豆培養(yǎng)基及2%WA培養(yǎng)基按文獻(xiàn)[4–5]方法配制。1.2藥物處理對(duì)辣椒炭疽病原菌和草莓灰霉病菌抗菌力的影響采用菌絲生長速率法測定苯噻菌酯對(duì)8種植物病原菌菌絲生長的抑制作用。根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)不同病原菌毒力測定用的藥劑系列濃度:0、0.001、0.004、0.016、0.064、0.256μg/mL(水稻紋枯病菌和稻瘟病菌);0、0.0156、0.0313、0.0625、0.125、0.25、0.5μg/mL(油菜菌核病菌);0、0.0032、0.016、0.08、0.4、2、4μg/mL(草莓灰霉病菌);0、0.04、0.2、1、5、25μg/mL(辣椒疫霉病菌);0、0.16、0.8、4、20、100μg/mL(小麥赤霉病菌和番茄早疫病菌);0、0.08、0.4、2、10、50μg/mL(辣椒炭疽病菌)。在預(yù)培養(yǎng)的病原菌菌落邊緣打取直徑為5mm的菌碟,分別接種于含苯噻菌酯的AEA或含有50μg/mLSHAM的AEA平板中央,每處理重復(fù)3皿,試驗(yàn)重復(fù)2次。于25℃培養(yǎng)2~14d后計(jì)算菌落生長抑制率,用DPS軟件處理數(shù)據(jù),建立藥劑質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)(x)與菌絲生長抑制機(jī)率值(y)之間的毒力回歸方程y=a+bx,計(jì)算相關(guān)系數(shù)(r)及有效抑制中濃度(EC50)。采用孢子萌發(fā)法測定苯噻菌酯對(duì)辣椒炭疽病菌和草莓灰霉病菌孢子萌發(fā)的影響。將供試病原菌的新鮮菌碟分別接種于AEA平板上,各4個(gè)重復(fù),分別于25℃下黑暗培養(yǎng)12和10d,用無菌水洗下孢子,過濾并調(diào)節(jié)孢子濃度至1×106個(gè)/mL。將50μL孢子懸浮液涂于含系列濃度苯噻菌酯的2%WA平板上。辣椒炭疽病菌和草莓灰霉病菌藥劑處理質(zhì)量濃度分別為:0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8μg/mL和0、0.0063、0.0125、0.025、0.05、0.1μg/mL。于25℃培養(yǎng)6~8h后,顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況,每個(gè)處理重復(fù)3次,試驗(yàn)重復(fù)2次。計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率,運(yùn)用DPS軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)算藥劑的毒力回歸方程y=a+bx、r及EC50值。1.3觀察組型及毒力檢測采用活體植株法。將苯噻菌酯母液用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%吐溫-80的蒸餾水稀釋成0、0.078、0.313、1.25、5和20μg/mL的藥液,噴霧處理二葉一心期小麥苗(豫麥49),直至液滴即將流失為止,每濃度處理3缽,每缽12株,試驗(yàn)重復(fù)2次。噴霧處理24h后用沉降法接種小麥白粉病菌新生分生孢子(接種前晚用自來水沖洗的病葉在培養(yǎng)箱中產(chǎn)生的孢子),于20℃、16h/d光照下培養(yǎng)7d,根據(jù)病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查病情,計(jì)算防治效果。將防治效果轉(zhuǎn)換成機(jī)率值,藥劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換成其對(duì)數(shù)值,應(yīng)用DPS軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)算毒力回歸方程y=a+bx、r及EC50值。以下有關(guān)小麥白粉病試驗(yàn)的接種方法和計(jì)算方法均用該方法。1.4保護(hù)作用測定采用活體植株法。于小麥苗二葉一心期進(jìn)行噴霧處理。苯噻菌酯的質(zhì)量濃度分別為0、0.078、0.313、1.25、5和20μg/mL,每處理3個(gè)重復(fù),試驗(yàn)重復(fù)2次。保護(hù)作用測定采用噴施藥劑24h后接種小麥白粉病菌;治療作用測定則在接種病菌24h后進(jìn)行噴施藥劑處理。1.5防治效果處理采用生物測定方法測定小麥葉片、穗頸和根系對(duì)苯噻菌酯的吸收和輸導(dǎo)性。選取四葉期小麥中部兩片葉,在葉片中部2cm葉段表面用毛刷涂布質(zhì)量濃度分別為0、50、100和200μg/mL的苯噻菌酯藥液,每處理重復(fù)20片葉;或在小麥揚(yáng)花期的穗下3cm處用毛刷分別涂布0、50、100和200μg/mL的苯噻菌酯藥液,涂藥長度為2cm,每處理重復(fù)20株;或用200μg/mL苯噻菌酯藥液20mL澆灌直徑為8cm的盆栽四葉期小麥苗,每處理重復(fù)3缽。分別以清水及嘧菌酯為空白及藥劑對(duì)照。于施藥24h后接種小麥白粉病菌,培養(yǎng)7d后調(diào)查葉片或穗部發(fā)病情況,計(jì)算防治效果。試驗(yàn)重復(fù)2次。1.6對(duì)小麥干法菌的防治效果用25μg/mL的苯噻菌酯和對(duì)照藥劑嘧菌酯藥液噴霧處理二葉一心期的小麥苗,以含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%吐溫-80的蒸餾水處理為對(duì)照,分別于處理后0.5、1、2、4、6、8、12和24h用噴壺模擬雨水沖刷麥苗20min,然后接種小麥白粉病菌孢子,每處理3個(gè)重復(fù),試驗(yàn)重復(fù)2次,培養(yǎng)7d后調(diào)查防治效果。1.7小麥白領(lǐng)菌子處理對(duì)小麥灰的防治效果用25μg/mL的苯噻菌酯和嘧菌酯藥液噴霧處理二葉一心期小麥苗,以含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%吐溫-80的蒸餾水處理為對(duì)照,分別于處理后3、7、10和14d接種小麥白粉病菌孢子,每處理3個(gè)重復(fù),試驗(yàn)重復(fù)2次,培養(yǎng)7d后調(diào)查防治效果。1.8處理數(shù)據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPSv7.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。并通過鄧肯氏新復(fù)極差法和Studentt檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。2結(jié)果與分析2.1苯噻菌酯的抗菌活性苯噻菌酯對(duì)供試8種植物病原菌的菌絲生長均有抑制活性,旁路氧化抑制劑SHAM對(duì)苯噻菌酯的抑菌活性具有顯著增效作用。從表1可以看出,苯噻菌酯對(duì)不同病原菌的抑制活性存在極大差異。在含有SHAM的AEA培養(yǎng)基上,苯噻菌酯對(duì)野生型水稻紋枯病菌、水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、草莓灰霉病菌和辣椒疫霉病菌的菌絲生長表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用,EC50值在0.004~1.147μg/mL之間,而對(duì)小麥赤霉病菌、辣椒炭疽病菌和番茄早疫病菌的菌絲生長抑制活性則較低,EC50值在4.338~14.081μg/mL之間。苯噻菌酯對(duì)供試病原菌孢子萌發(fā)的抑制活性高于對(duì)菌絲生長的抑制活性。其中抑制辣椒炭疽病菌孢子萌發(fā)的EC50值只有0.439μg/mL,活性是其抑制菌絲生長活性的12倍;對(duì)草莓灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制活性也高于抑制菌絲生長的20%以上(表2)。2.2加回歸方程盆缽試驗(yàn)結(jié)果表明:苯噻菌酯對(duì)小麥白粉病菌有很好的抑制活性,毒力回歸方程為y=4.891+1.090x,相關(guān)系數(shù)0.981,EC50值為(1.016±0.224)μg/mL。當(dāng)苯噻菌酯的質(zhì)量濃度為20μg/mL時(shí),對(duì)白粉病的防效達(dá)92.70%。2.3治療和作用作用ec50苯噻菌酯防治小麥白粉病有較好的保護(hù)作用和治療作用,EC50值分別為0.991和1.823μg/mL,保護(hù)作用顯著好于治療作用(表3)。2.4區(qū)葉的防治效果苯噻菌酯對(duì)小麥葉片涂藥區(qū)白粉病的防效為100%(表4,圖1),對(duì)涂藥區(qū)葉片上部及下部的防效較差,對(duì)涂藥葉片相鄰的未處理葉片則無防治效果;穗頸部涂藥的麥穗在接種7d后全部發(fā)病;根部澆灌施藥對(duì)小麥地上部分沒有防治效果。這些研究結(jié)果表明,苯噻菌酯在小麥體內(nèi)的輸導(dǎo)性較差,且不能被小麥根系吸收并輸導(dǎo)。2.5接種養(yǎng)血工酶后各處理對(duì)小麥的抗菌效果用25μg/mL的苯噻菌酯噴施處理葉片后0.5~24h模擬雨水沖刷20min,接種培養(yǎng)7d后各處理都只有輕微的發(fā)病癥狀,防治效果均在86%以上,與對(duì)照藥劑嘧菌酯的防效相當(dāng)(表5),說明苯噻菌酯在小麥葉片上具有很好的粘著性,耐雨水沖刷。2.6苯噻菌酯與對(duì)照藥劑的篩選結(jié)果用苯噻菌酯和嘧菌酯處理麥苗后不同時(shí)間后接種小麥白粉病菌,結(jié)果(表6)表明,苯噻菌酯防治小麥白粉病的持效性顯著好于對(duì)照藥劑嘧菌酯。25μg/mL的苯噻菌酯處理14d后接種,其防治效果仍達(dá)72.48%。3苯噻菌酯對(duì)小麥灰霉病菌子生長的抑制作用本研究表明,新型QoI類殺菌劑苯噻菌酯對(duì)不同植物病原菌具有不同的生物活性。離體條件下,其對(duì)野生敏感型水稻紋枯病菌及稻瘟病菌、油菜菌核病菌、草莓灰霉病菌和辣椒疫霉病菌的菌絲生長表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑菌活性,與金麗華等、張舒亞報(bào)道的嘧菌酯對(duì)上述幾類病原菌菌絲生長的抑制活性相比,苯噻菌酯表現(xiàn)出了更高或類似的抑菌活性,具有較好的應(yīng)用前景。苯噻菌酯對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的抑制活性顯著高于對(duì)菌絲生長的抑制活性,說明該殺菌劑阻止病菌侵染的保護(hù)作用可能好于侵染后的治療作用,本研究中的盆栽試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了該推測。值得指出的是,苯噻菌酯對(duì)病原菌孢子萌發(fā)和菌絲生長的抑制活性的差異因病原菌而異。本研究表明,苯噻菌酯對(duì)辣椒炭疽病菌菌絲生長的抑制活性較低,但對(duì)其孢子萌發(fā)的抑制活性很高,因此以其防治辣椒炭疽病時(shí)應(yīng)該利用其保護(hù)作用,而不是治療作用;但在防治小麥白粉病的試驗(yàn)中,苯噻菌酯卻表現(xiàn)出了很好的保護(hù)作用和治療作用。雖然,苯噻菌酯對(duì)草莓灰霉病菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長均有良好抑制活性,但是在研究中發(fā)現(xiàn),草莓灰霉病菌極易對(duì)苯噻菌酯產(chǎn)生高水平抗藥性,因此用其防治灰霉病的應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步評(píng)估。已有研究表明:QoI類殺菌劑嘧菌酯、吡唑醚菌酯等具有內(nèi)吸性,可以預(yù)防和治療多種植物病害。本研究通過在用苯噻菌酯處理的不同部位接種小麥白粉病菌,測定其對(duì)小麥白粉病的防效,結(jié)果證明苯噻菌酯不具有內(nèi)吸性,說明該藥劑也沒有內(nèi)吸治療作用。然而,試驗(yàn)證明苯噻菌酯對(duì)表面寄生的小麥白粉病具有治療作用。苯噻菌酯處理小麥葉片后不同時(shí)間淋洗,尤其是0.5h后與其他時(shí)間淋洗的防治效果均相似,進(jìn)一步說明藥劑無內(nèi)吸性。苯噻菌酯處理小麥葉片后淋洗與未淋洗,防治白粉病的效果差異不大,說明該藥劑在葉片上具有良好的粘著性,耐雨水沖刷。用苯噻菌酯處理小麥葉片14d