第八章 核酸化學與代謝課件

第八章、核酸化學核酸的組成成分DNA的結(jié)構(gòu)DNA和基因組RNA的結(jié)構(gòu)核酸生物合成核酸的生物學功能核酸的分子生物學第八章、核酸化學核酸的組成成分DNA的結(jié)構(gòu)DNA和基因組RN12一、核酸的生物學功能（一）核酸與遺傳信息的傳遞DNA是基本遺傳物質(zhì)一定結(jié)構(gòu)的DNA產(chǎn)生一定結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，才有一定形態(tài)和生理特征，所以DNA的特定遺傳密碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)就代表特定生物的遺傳性。在遺傳過程中DNA的具體作用：（1）在細胞分裂時按照自己的結(jié)構(gòu)精確復制傳給后代；（2）作為模板將所貯遺傳信息傳給mRNA。2一、核酸的生物學功能（一）核酸與遺傳信息的傳遞DNA是基本23RNA在傳遞遺傳信息上的作用

1)mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板；2)tRNA識別mRNA上的遺傳密碼，轉(zhuǎn)運特定氨基酸到核糖體上合成肽鏈；3)rRNA是核糖體的主要成分，是翻譯工作的場所。（二）核酸與蛋白質(zhì)的生物合成DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA是有選擇的，tRNA和rRNA也是DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。（三）核酸結(jié)構(gòu)改變與生物變異一切生物的變異和進化都可以說是由于DNA的結(jié)構(gòu)改變而引起蛋白質(zhì)改變的結(jié)果。3RNA在傳遞遺傳信息上的作用（二）核酸與蛋白質(zhì)的生物合成D34生物遺傳的變異起源于DNA堿基配對的改變。１）有的由于DNA堿基的顛倒（如TA被顛倒為AT）或被調(diào)換（如GC被換為TA）；２）有的由于在DNA復制過程中被遺漏了一對或多了一對核苷酸，３）或者在轉(zhuǎn)譯時發(fā)生了差誤，如氨酰tRNA合成酶錯將一個結(jié)構(gòu)與正常氨基酸十分相似的物質(zhì)交給tRNA。４）還有一些生物的遺傳性狀發(fā)生了突變。4生物遺傳的變異起源于DNA堿基配對的改變。45（四）DNA與細菌轉(zhuǎn)化一種細菌的遺傳性狀因吸收了另一種細菌的DNA而發(fā)生改變的現(xiàn)象，稱為細菌的轉(zhuǎn)化。（五）核酸與病變遺傳性疾病是由于遺傳缺陷而產(chǎn)生的，也就是DNA結(jié)構(gòu)改變的結(jié)果。鐮刀型紅細胞貧血和白化病(albinism)。病毒對活細胞的侵染是寄主發(fā)生疾病，主要是由于核酸的作用。如流感、肝炎、帶狀皰疹、脊髓灰質(zhì)炎、白血病、煙草斑紋病。5（四）DNA與細菌轉(zhuǎn)化一種細菌的遺傳性狀因吸收了另一種56（六）遺傳工程遺傳工程是用人工方法改組DNA，從而培育新型生物品種的技術(shù)。實驗室中將細菌作材料研究遺傳工程過程可分為：（1）重組DNA分子（基因重組）；（2）將重組DNA引入受體細胞（轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導）。有利：（1）改良微生物品種使產(chǎn)生人工難以制得的生物活性物質(zhì)如胰島素、干擾素等；（2）解決某些疾病病因和控制這些疾病。6（六）遺傳工程遺傳工程是用人工方法改組DNA，從而培育6第八章核酸化學與代謝課件7第八章核酸化學與代謝課件8（一）核糖和脫氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12β-D-2-核糖β-D-2-脫氧核糖O核糖+H+糠醛甲基間苯二酚FeCl3綠色產(chǎn)物Δ脫氧核糖+H+

Δω-羥基-γ-酮戊醛二苯胺藍色產(chǎn)物RNA和DNA定性、定量測定（一）核糖和脫氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2C9（二）嘌呤堿和嘧啶堿NNNNHHHHNNNNHHHH123456789嘌呤NH2腺嘌呤adenine（A）NNNNHHHHOH2N鳥嘌呤guanine（G）（二）嘌呤堿和嘧啶堿NNNNHHHHNNNNHHHH123410NNHHHH123645嘧啶NNHHHHNH2OH胞嘧啶Cytosine（C）NNHHHHOOHH尿嘧啶uracil（U）NNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶thymine（T）NNHHHH123645嘧啶NNHHHHNH2OH胞嘧啶C11NNOOHHH酮式HNNOOHHH酮式HHH烯醇式NNOOHHH酮式HNNOOHHH酮式HHH烯醇式12（三）核苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHHHH9腺嘌呤胸苷（三）核苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核13OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖OHOH2COHOH1′2′3′4′5′核糖NNOOHHH尿嘧啶H1尿苷NCOONHHH51OH假尿苷（ψ）OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖OHOH14（四）核苷酸OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHHHH9腺嘌呤胸苷PO--O—O‖胸苷-5′-磷酸AMPP

O--O—O‖~ADPATPP

O--O—O‖~（四）核苷酸OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核15各種核苷三磷酸和脫氧核苷三磷酸是體內(nèi)合成RNA和DNA合成的直接原料。在體內(nèi)能量代謝中的作用：ATP——能量“貨幣”UTP——參加糖的互相轉(zhuǎn)化與合成CTP——參加磷脂的合成GTP——參加蛋白質(zhì)和嘌呤的合成第二信使——cAMP各種核苷三磷酸和脫氧核苷三磷酸是體內(nèi)合成RNA和DNA合成的16OHO-O

O—CH2

TO=P—O-3′5′OHOHO-O

O—CH2

GO=P—O-3′5′OHO

O—CH2OHOH

AO=P—OO-3′5′3′5′1′PPPOHATGpGpTpAOHpG-T-ApGTAOHO-OO—CH2TO=P—O-3′5′OHOHO-17三、DNA的結(jié)構(gòu)（一）DNA的一級結(jié)構(gòu)

1)因為DNA的脫氧核苷酸只在它們所攜帶的堿基上有區(qū)別，所以脫氧核苷酸的序列常被認為是堿基序列（basesequence)。2)通常堿基序列由DNA鏈的5′→3′方向?qū)憽?)DNA中有4種類型的核苷酸，有n個核苷酸組成的DNA鏈中可能有的不同序列總數(shù)為4n。三、DNA的結(jié)構(gòu)（一）DNA的一級結(jié)構(gòu)1)因為DNA的脫181.雙螺旋結(jié)構(gòu)的主要依據(jù)（１）DNA中A＝T、C＝G。后發(fā)現(xiàn)：Ａ與T生成2個氫鍵、C與G生成3個氫鍵。（２）電位滴定證明，嘌呤與嘧啶的可解離基團由氫鍵連接。（二）DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)1953年，Watson

和Crick

提出。1.雙螺旋結(jié)構(gòu)的主要依據(jù)（１）DNA中A＝T、C＝G。（1920202021鳥嘌呤－胞嘧啶堿基對腺嘌呤－胸腺嘧啶堿基對21鳥嘌呤－胞嘧啶堿基對腺嘌呤－胸腺嘧啶堿基對2122磷酸二酯鍵22磷酸二酯鍵22232.雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點（1）兩條多核苷酸鏈反向平行。（2）堿基內(nèi)側(cè)，A與T、G與C配對，分別形成3和2個氫鍵。（3）雙螺旋每轉(zhuǎn)一周有10個bp，螺距3.4nm，直徑2nm。3.雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素（1）氫鍵（太弱）；（2）堿基堆積力（basestackingforce，由芳香族堿基π電子間的相互作用引起的，能形成疏水核心，是穩(wěn)定DNA最重要的因素；（3）離子鍵（減少雙鏈間的靜電斥力）。232.雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點（1）兩條多核苷酸鏈反向平行。23242424252525262626（三）DNA的三級結(jié)構(gòu)線形分子、雙鏈環(huán)狀(dcDNA)→超螺旋染色體包裝（三）DNA的三級結(jié)構(gòu)線形分子、雙鏈環(huán)狀(dcDNA)→超螺27染色體包裝的結(jié)構(gòu)模型多級螺旋模型壓縮倍數(shù)76405

DNA→核小體→螺線管→超螺線管→染色單體2nm10nm30(10)nm400nm2~10μm

一級包裝二級包裝三級包裝四級包裝染色體包裝的結(jié)構(gòu)模型多級螺旋模型28四、DNA與基因組織DNATranscription

RNA（mRNA、tRNA、rRNA）TranslationProtein基因基因是DNA片段的核苷酸序列，DNA分子中最小的功能單位。結(jié)構(gòu)基因調(diào)節(jié)基因基因組四、DNA與基因組織DNATranscription2930五、RNA結(jié)構(gòu)１、其基本結(jié)構(gòu)同DNA，主要區(qū)別：１）核糖為：RNA；２）含氮堿基中有Ｕ，沒有Ｔ。２、RNA主要有三種：１）結(jié)構(gòu)RNA（rRNA)；２）信使RNA(mRNA)；３）轉(zhuǎn)運RNA（tRNA).30五、RNA結(jié)構(gòu)１、其基本結(jié)構(gòu)同DNA，主要區(qū)別：3031313132323233主要特征：1.四臂四環(huán)；2.氨基酸臂3′端有CCAOH的共有結(jié)構(gòu)；3.D環(huán)上有二氫尿嘧啶(D)；4.反密碼環(huán)上的反密碼子與mRNA相互作用；5.可變環(huán)上的核苷酸數(shù)目可以變動；6.TψC環(huán)含有T和ψ；7.含有修飾堿基和不變核苷酸。33主要特征：3334343435六核酸的生物合成一）DNA的生物合成二）RNA的生物合成35六核酸的生物合成一）DNA的生物合成二）RNA的生3536一）DNA的生物合成（一）DNA的半保留復制36一）DNA的生物合成（一）DNA的半保留復制36371、原核微生物的單鏈環(huán)狀DNA主要采用滾環(huán)式復制5′3′5′3′5′一）DNA的生物合成-半保留DNA復制的起點和方向371、原核微生物的單鏈環(huán)狀DNA主要采用滾環(huán)式復制5′3′37382、真核生物DNA的多起點復制Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓn382、真核生物DNA的多起點復制Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓn3839（三）原核細胞的DNA復制1.DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ）（dNMP）n+dNTPMg2+（dNMP）n+1+PPi特點（1）不能催化從無到有的聚合反應。（2）催化的反應只能在引物的3′延伸。（3）3′接上的核苷酸決定于模板鏈。（4）具有5′→3′和3′→5′外切酶活性。39（三）原核細胞的DNA復制1.DNA聚合酶Ⅰ（Pol39402.PolⅡ和PolⅢPCR（多聚酶鏈式反應）5′5′1熱變性2退火5′5′5′5′3DNA聚合酶5′5′5′5′重復1，2，3PCR反應全過程402.PolⅡ和PolⅢ40413.雙鏈DNA復制的分子機制（1）岡崎片段和半不連續(xù)復制5′3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′復制叉上DNA合成的三種可行性413.雙鏈DNA復制的分子機制（1）岡崎片段和半不連續(xù)4142（2）岡崎片段的RNA引物利福酶素對RNA聚合酶有抑制作用。氯霉素對蛋白質(zhì)合成有抑制作用。引物RNA在復制過程中暫時存在，最后通過PolⅠ的5′→3′外切酶活力水解。（3）DNA連接酶催化一條DNA鏈的3′末端與相鄰的另一條DNA鏈的5′末端之間的磷酸二酯鍵的合成。42（2）岡崎片段的RNA引物利福酶素對RNA聚合酶有抑制作4243

其它功能：（1）修補雙螺旋DNA中單股的缺口；（2）連接線狀雙螺旋DNA以產(chǎn)生環(huán)狀DNA；（3）重組過程中將幾段DNA鏈連接起來。（4）母本DNA雙鏈的分離DNA解螺旋酶（DNAhelicase）拓撲異構(gòu)酶Ⅱ（typeⅡtopoisomerase）43其它功能：（4）母本DNA雙鏈的分離DNA4344（5）DNA聚合酶的“校對”作用DNA聚合酶的3′→5′外切酶活力是校對新生DNA鏈和改正聚合酶活性所造成“錯配”的一種手段。4.真核細胞DNA的復制（1）真核細胞DNA復制有多個起始點。（2）至少有5種DNA聚合酶，即α、β、γ、δ、ε。（3）端粒由端粒酶催化復制。生物細胞DNA復制分子機制的基本特點44（5）DNA聚合酶的“校對”作用DNA聚44455.反轉(zhuǎn)錄作用利用反轉(zhuǎn)錄酶可制造與任何RNA（mRNA、tRNA、rRNA）的互補DNA（cDNA）。6.DNA的損傷與修復（1）DNA損傷的各種結(jié)構(gòu)變化①堿基缺失或插入②堿基改變③形成TT二聚體455.反轉(zhuǎn)錄作用利用反轉(zhuǎn)錄酶可制造與任何R4546（2）修復機制①光復活；②切除修復；③重組修復；④SOS修復（3）修復缺陷和疾病癌癥；著色性干皮病；貧血病。46（2）修復機制①光復活；（3）修復缺陷和疾病癌癥；著色性4647重組修復5′5′重組修復5′47重組修復5′5′重組修復5′47487.細菌的限制—修飾系統(tǒng)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生平頭末端或粘性末端。5′—G—T—T—A—A—C—3′3′—C—A—A—T—T—G—5′5′—G—T—TA—A—C—3′3′—C—A—AT—T—G—5′平頭末端HpaⅠ487.細菌的限制—修飾系統(tǒng)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)48495′—G—A—A—T—T—C—3′3′—C—T—T—A—A—G—5′5′—GT—T—A—A—C—3′3′—C—A—A—T—TG—5′粘性末端EcoRⅠ495′—G—A—A—T—T—C—3′3′—C—T—T—A—4950二RNA的生物合成（一）轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有mRNA、tRNA、rRNA。1.原核細胞的轉(zhuǎn)錄E.coli的RNA聚合酶中，α2ββ′稱為核心酶。σ因子辨認模板DNA的起始位點。50二RNA的生物合成（一）轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有mRNA、t50512.真核細胞的轉(zhuǎn)錄真核細胞RNA聚合酶有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三類。3.轉(zhuǎn)錄過程的選擇性抑制放線菌素D是原核和真核細胞RNA聚合酶的專一抑制劑。利福平是原核細胞RNA聚合酶的抑制劑。α-鵝膏蕈堿是真核細胞RNA聚合酶的抑制劑。4.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工（1）rRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工原核細胞30S前體17S25S16S23S5S512.真核細胞的轉(zhuǎn)錄真核細胞RNA聚合酶有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三5152真核細胞45S前體18S28S5.8S（2）tRNA前體的加工（3）真核細胞mRNA的加工52真核細胞45S前體18S28S5.8S（2）tRNA前體52537、DNA的分子生物學技術(shù)(后面我來講）方法應用局限性變形梯度凝膠電泳(DGGE)利用基因序列和長度差異分析群落多樣性，適于分析較多種微生物條帶序列較短，靈敏度有限，不能定量末端限制性片段長度多態(tài)性分析(T–RFLP)利用限制性位點差異分析群落多樣性，快速，半定量分析限制性酶切不完全；高效高通量需要多次反復酶切克隆文庫(Cloninglibrary)利用序列差異和測序可知群落中各種群系統(tǒng)分類；為新引物和探針設計提供信息克隆步驟耗時較長,

不適合大量分析,不適合反應器監(jiān)測熒光原位雜交(FISH)原位定量和識別特定菌群背景熒光會干擾檢測，探針的穿透性差會造成假陰性實時熒光定量PCR(QRT-PCR)目標基因的擴增和定量分析不適合各種基因的快速同時分析；PCR高靈敏度易造成污染基因芯片(Microarray)高通量快速檢測群落多樣性，鑒定微生物并明確其生態(tài)作用環(huán)境樣品特異性和靈敏度低，不能定量，樣品處理復雜，儀器貴重537、DNA的分子生物學技術(shù)(后面我來講）方法應用局限性變53541.變形梯度凝膠電泳1）變性梯度凝膠電泳(DGGE)原理：在堿基序列上存在差異的不同DNA雙鏈解鏈時需要不同的變性劑濃度，DNA雙鏈解鏈后，在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度將會急劇下降。將PCR擴增得到的等長的DNA片段加入到含有變性劑梯度的凝膠中進行電泳，染色后可以在凝膠上呈現(xiàn)為分開的條帶。在不同泳道中停留在相同位置的條帶，一般可視為具有相同的DNA序列。該技術(shù)可以分辨具有相同大小片段的序列差異，可以用于檢測單一堿基的變化，微生物群落遺傳多樣性以及PCR擴增DNA片段的多態(tài)性。該技術(shù)主要操作過程如下（圖1）:541.變形梯度凝膠電泳1）變性梯度凝膠電泳(DGGE)原5455DGGE技術(shù)主要操作過程如下:樣品預處理;

樣品DNA(或RNA)提取及純化;16SrDNA或基因片段的PCR(或RT-PCR)擴增;預實驗(DGGE條件優(yōu)化);

制膠;樣品的DGGE分析;圖譜分析;條帶序列分析。55DGGE技術(shù)主要操作過程如下:樣品預處理;5556DGGE過程示意圖56DGGE過程示意圖5657DGGE特點：GC夾板(GC–clamp)使用。為取得好的分離效果，常在DNA片段上連接一段長為30~50堿基富含GC的核苷酸序列GC夾板(GC–clamp)，可分辨相差一個堿基的序列。

DGGE技術(shù)快速簡便、分離效果好。從理論上講，只要選擇的電泳條件如變性劑梯度、電泳時間、電壓等足夠精細，DGGE技術(shù)對于DNA片段的分辨率可以達到一個堿基差異水平，DGGE法只能對微生物群落中數(shù)量上大于1%的優(yōu)勢種群進行分析。DGGE技術(shù)無法提供代謝活性、細菌數(shù)量和基因表達水平方面的信息。57DGGE特點：GC夾板(GC–clamp)使用。為取得5758應用舉例：----變形梯度凝膠電泳（DGGE）分析生化反應器微生物58應用舉例：58一、取樣與預處理1、微生物取樣

穩(wěn)定運行條件下，不同溫度條件（冬季、夏季）的生物強化一體化反應器的厭氧區(qū)、好氧區(qū)填料上生物膜，HPES生物濾塔填料上的生物膜。2、樣品的預處理高速離心處理生物膜樣品，

用PBS（磷酸鹽緩沖液）洗脫與固定生物膜。59一、取樣與預處理1、微生物取樣5959二、總DNA提取土壤基因組提取試劑盒快速提取生物膜中的總DNA。60Marker60Marker23130bp9416bp6559bp2322bp2927bp二、總DNA提取土壤基因組提取試劑盒快速提取生物膜中的總DN60611、反應體系：試劑50ul體系終濃度Fowardprimer（F468）2ul0.4uMReverseprimer（R468）2ul0.4uM2×2TaqMasterMix25ul1×TemplateDNA﹤1ug﹤1ug/reactionRNase-freeWaterUpto50ul三、PCR擴增611、反應體系：試劑50ul體系終濃度Fowardpri616262引物序列Primer名稱序列(5'to3')堿基數(shù)細菌通用引物F468CGC

CCG

GGG

CGC

GCC

CCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGACTCCTACGGGAGGCAG56細菌通用引物R468GACTACCAGGGTATCTAATCC216262引物序列Primer名稱序列(5'to3')堿基數(shù)細6263步驟溫度時間預變性94℃2min變性94℃30s退火55-65℃30s延伸72℃30s終延伸72℃2min變性—延伸，25-35個循環(huán)；2、PCR反應條件：63步驟溫度時間預變性94℃2min變性94℃30s退火5563643、瓊脂糖電泳后紫外成像。Marker643、瓊脂糖電泳后紫外成像。Marker6465三、PCR擴增DGGE紫外成像DGGE成像切膠65三、PCR擴增DGGE紫外成像65四、測序過程與結(jié)果一）測序過程1、對回收的DGGE條帶進行二次PCR擴增二

及產(chǎn)物回收；

2、目的片斷TA克隆；3、藍白斑篩選；4、質(zhì)粒提取5、M13+/-測序（見測序圖譜）66四、測序過程與結(jié)果一）測序過程6666二）測序結(jié)果DGGE條帶編號測序編號V3區(qū)菌種屬名14.19X1323-1198bpNovosphingobium