生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)市公開課獲獎(jiǎng)?wù)n件省名師優(yōu)質(zhì)課賽課一等獎(jiǎng)?wù)n件

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)1/432/43四、試驗(yàn)室規(guī)則1.穿工作服。2.嚴(yán)格按操作規(guī)程使用儀器設(shè)備。3.試驗(yàn)完成后，洗凈所用器材。4.每次一個(gè)試驗(yàn)小組(輪番)做清潔衛(wèi)生。3/43五、試驗(yàn)匯報(bào)書寫實(shí)驗(yàn)名稱1.目要求日期2.實(shí)驗(yàn)原理3.主要方法及儀器4.基本操作過程5.現(xiàn)象與繪圖6.計(jì)算或結(jié)果7.意義8.注意事項(xiàng)9.討論與小結(jié)10.思考題4/43試驗(yàn)一分光光度法5/43一、實(shí)驗(yàn)?zāi)浚赫莆辗止夤舛确ǜ拍?、基本原理和?yīng)用；并經(jīng)過試驗(yàn)了解分光光度計(jì)操作方法和步驟以及了解分光光度計(jì)主要組成部件與工作原理。

6/43單色光與復(fù)色光單色光:僅含有某一波長(zhǎng)光，由含有相同能量光子所組成。復(fù)色光:與上相反，各種人眼可見色光都屬復(fù)色光。7/43γ射線x射線真空紫外近紫外可見近紅外紅外遠(yuǎn)紅外無線電波380－760nm10μm－－200－380nm8/43二、分光光度法概念分光光度法是基于被測(cè)物質(zhì)分子對(duì)光含有選擇性吸收特征而建立起來分析方法（也稱為吸光光度法）。9/43在分光光度計(jì)中，將不一樣波長(zhǎng)光連續(xù)照射到一定濃度樣品溶液時(shí)，便可得出與不一樣波長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)吸收強(qiáng)度。如以波長(zhǎng)（λ）為橫坐標(biāo)，吸收強(qiáng)度（A）為縱坐標(biāo)，就可繪出該物質(zhì)吸收光譜曲線。利用該曲線能夠進(jìn)行物質(zhì)定性、定量分析。10/43特點(diǎn)—靈敏度高：測(cè)定下限可達(dá)10－5～10－6mol/L,10-4%～10-5%準(zhǔn)確度能夠滿足微量組分測(cè)定要求：相對(duì)誤差2～5％（1～2％）操作簡(jiǎn)便快速應(yīng)用廣泛11/43三、分光光度法基本原理12/431.物質(zhì)對(duì)光選擇性吸收吸收(absorption):一個(gè)物質(zhì)展現(xiàn)何種顏色，是與入射光組成和物質(zhì)本身結(jié)構(gòu)相關(guān)。溶液展現(xiàn)不一樣顏色是由溶液中質(zhì)點(diǎn)（離子或分子）對(duì)不一樣波長(zhǎng)光含有選擇性吸收而引發(fā)。13/43

當(dāng)依次將各種波長(zhǎng)單色光經(jīng)過某一有色溶液,測(cè)量每一波長(zhǎng)下有色溶液對(duì)該波長(zhǎng)光吸收程度(吸光度A)，然后以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得到一條曲線，稱為該溶液吸收光譜。吸收光譜14/43可見、紫外吸收光譜示意圖15/43

物質(zhì)對(duì)不一樣色光能有選擇性吸收,即一定物質(zhì)主要吸收一定波長(zhǎng)光(互補(bǔ)吸收)，是因?yàn)槲镔|(zhì)本身分子、原子都處于一定能級(jí)運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，當(dāng)物質(zhì)吸收了光輻射能以后，會(huì)產(chǎn)生能級(jí)躍遷，產(chǎn)生吸收光譜。吸收光譜產(chǎn)生16/432.光吸收基本定律

依據(jù)吸收光譜特征和形狀可作該物質(zhì)判別、純度檢驗(yàn)和初步結(jié)構(gòu)分析等。不過可見／紫外吸收光譜主要應(yīng)用在定量分析方面，其定量基礎(chǔ)即為L(zhǎng)amber-Beer定律，是說明吸光物質(zhì)對(duì)單色光吸收強(qiáng)弱與該物質(zhì)濃度與厚度間關(guān)系定律。17/43透光度T(%)與吸光度A18/43

透光度T(%)當(dāng)一束平行單色光經(jīng)過一濃度為C，液層厚度為L(zhǎng)溶液時(shí)，該溶液將對(duì)此入射光進(jìn)行吸收，使透過光強(qiáng)減弱。透光度則為入射前后光強(qiáng)比值。CL入射光強(qiáng)透射光強(qiáng)I0ItT(%)＝ItI019/43透光度與吸光度相互關(guān)系溶液透光度與吸光度呈負(fù)相關(guān)。A＝lg—I0It＝lg—＝－lgT1T吸光度A吸光度A是透光度負(fù)對(duì)數(shù)20/43

1.Lamber定律—吸光度與液層厚度關(guān)系

1760年，Lamber指出，當(dāng)單色光經(jīng)過濃度一定、均勻吸收溶液時(shí)，該溶液對(duì)光吸收程度與液層厚度L成正比。A＝lg—I0It＝K1LLamber-Beer定律21/43吸光度與光程（厚度：L）關(guān)系

A=KLc

檢測(cè)器L樣品光源0.22吸光度光源檢測(cè)器0.00吸光度光源檢測(cè)器0.44吸光度L樣品L樣品22/432.Beer定律—吸光度與溶液中吸光物質(zhì)濃度關(guān)系關(guān)系

1852年，Beer指出，當(dāng)單色光經(jīng)過液層厚度一定、均勻吸收溶液時(shí)，該溶液對(duì)光吸收程度與溶液中吸光物質(zhì)濃度C成正比。A＝lg—I0It＝K2C23/43吸光度與濃度關(guān)系

A=KLc

吸光度0.00光源檢測(cè)器

吸光度0.22光源檢測(cè)器c1

吸光度0.44光源檢測(cè)器c224/433.Lamber-Beer定律

將前面兩條定律結(jié)合起來，就得到以下結(jié)果：

A＝KCL

K:吸光系數(shù)，為單位濃度、單位厚度時(shí)吸光度。C:吸光物質(zhì)濃度。單位mol/LL:光經(jīng)過液層厚度。單位cm25/43A=klcA—吸光度(absorbance)L—介質(zhì)厚度(length/cm)c—濃度(concentration)K—吸光系數(shù)(absorptivity)A＝lg—I0ItItI0lc26/43四、

分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)27/43分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)

光源單色器吸收池檢測(cè)系統(tǒng)穩(wěn)壓電源28/43722型分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)方框圖光源吸收池檢測(cè)系統(tǒng)分光系統(tǒng)顯示系統(tǒng)29/43

在分光光度計(jì)上外來光源（混合光）經(jīng)過棱鏡或光柵得到一束近似單色光.即將混合光中某一波長(zhǎng)單色光分出，故稱為“分光”。優(yōu)點(diǎn)：波長(zhǎng)可調(diào),故選擇性好,準(zhǔn)確度高.30/43

光源必須含有穩(wěn)定足夠強(qiáng)度連續(xù)光譜?？梢姽夥止夤舛扔?jì)光源通常為白灼鎢燈，其光譜范圍為320nm---2500nm。紫外分光光度計(jì)光源是低壓氫弧燈，其光譜范圍為150nm---400nm。1.光源31/43

單色器是將復(fù)雜白光分散成單色光裝置，其過程為光色散。色散后單色光經(jīng)反射、聚光，經(jīng)過狹縫抵達(dá)溶液。慣用單色器是棱鏡或光柵。2.單色器32/43

也叫比色皿,比色杯，用來盛被測(cè)試溶液。可見光區(qū)使用玻璃制比色皿，紫外光區(qū)使用石英制比色皿。因?yàn)椴Ａ?huì)吸收紫外線。吸收池種類很多，其光徑可在0.1~10cm之間，其中以1cm光徑吸收池最為慣用。3.吸收池33/43

即光電轉(zhuǎn)換元件，為光電管或光電倍增管，可將透過比色皿光信號(hào)變成可測(cè)量電信號(hào)。檢測(cè)器34/435.顯示儀表或統(tǒng)計(jì)儀可直接讀到結(jié)果，如檢流計(jì)，微安表。35/43五、定量分析方法㈠標(biāo)準(zhǔn)曲線法0濃度C吸光度A36/43幾點(diǎn)注意：理想標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為：用不一樣濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液所測(cè)得吸光度對(duì)濃度作圖時(shí)，是一條斜率靠近于1經(jīng)過原點(diǎn)直線；標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍應(yīng)在被測(cè)物質(zhì)濃度二分之一到二倍之間；吸光度在0.05---1.0之間為宜。37/43㈡對(duì)比法將標(biāo)準(zhǔn)與樣品分別在相同條件下顯色，測(cè)定其吸光度。因是相同物質(zhì)在相同條件下測(cè)定，故可按下式計(jì)算出樣品濃度：A標(biāo)A樣KC樣LKC標(biāo)L=則：C樣=A標(biāo)A樣C標(biāo)38/43六．顯色反應(yīng)條件選擇

對(duì)各種物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，常利用顯色反應(yīng)將被測(cè)組分轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢úㄩL(zhǎng)范圍有吸收物質(zhì)。39/43這些顯色反應(yīng)，必須滿足以下條件：1．反應(yīng)生成物必須在紫外-可見光區(qū)有較強(qiáng)吸光能力，即摩爾吸光系數(shù)較大；2．反應(yīng)有較高選擇性，即被測(cè)組分生成化合物吸收曲線應(yīng)與共存物質(zhì)吸收光譜有顯著差異；40/433．反應(yīng)生成產(chǎn)物有足夠穩(wěn)定性，以確保測(cè)量