樣品前處理技術(shù)課件

第三章農(nóng)藥殘留分析的前處理技術(shù)3.1樣品制備目的和原理3.2樣品制備常規(guī)技術(shù)3.3樣品制備新技術(shù)第三章農(nóng)藥殘留分析的前處理技術(shù)3.1樣品制備目的和原13.1樣品制備的目的和原理

樣品制備（samplepreparation）是農(nóng)藥殘留分析方法的重要部分。包括從樣品中提取殘留農(nóng)藥，濃縮提取液和去除提取液中干擾性雜質(zhì)的分離凈化等步驟，是將實驗室樣品處理成適合測定的檢測溶液的過程。

3.1樣品制備的目的和原理2樣品制備的目的

1）提高靈敏度和降低檢測限。

2）提高測試精度。

3）提高方法的選擇性。（衍生化）

4）延長儀器的使用壽命。樣品制備的目的3樣品制備原理主要是利用殘留農(nóng)藥與樣品基質(zhì)的物理化學(xué)特性差異，使其從對檢測系統(tǒng)有干擾作用的樣品基質(zhì)中提取分離出來。農(nóng)藥的極性和溶解性是選擇提取和凈化條件的重要依據(jù)，在殘留農(nóng)藥的溶劑提取中常采用“相似相溶”原理：使用與農(nóng)藥極性相近的溶劑為提取劑，使殘留農(nóng)藥在溶劑中達到最大溶解度。

1）極性：共價鍵電子密度不均衡分布結(jié)果產(chǎn)生了鍵偶極。常用溶劑的極性大?。杭和椋ㄊ兔眩?lt;苯<乙醚<氯仿<二氯甲烷<丙酮<乙酸乙酯<乙腈<二甲亞砜<甲醇<水樣品制備原理4

2）溶解性指農(nóng)藥在水相和有機相中的溶解能力。溶解度的大小很大程度上取決于農(nóng)藥分子所含官能團的種類、數(shù)量、溶劑的性質(zhì)和其他外部因素。農(nóng)藥的水溶性還受溫度、含鹽量、有機質(zhì)、PH值的影響。2）溶解性53.2樣品制備常規(guī)技術(shù)提取技術(shù)提?。╡xtraction）是指通過溶解、吸著或揮發(fā)等方式將樣品中的殘留農(nóng)藥分離出來的操作步驟，也稱為萃取。3.2樣品制備常規(guī)技術(shù)提取技術(shù)6提取原則：根據(jù)農(nóng)藥理化性質(zhì)按“相似相溶”原理進行。溶劑的選擇是關(guān)鍵。

1.溶劑的極性（“相似相溶”原理）

2.溶劑的純度（分析純以上）

3.溶劑的沸點（45~80℃之間）。常用的提取溶劑：石油醚、正己烷、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、水等提取原則：根據(jù)農(nóng)藥理化性質(zhì)按“相似相溶”原理進行。7提取方法-

液固提取法：將固體放入提取劑中，加以振蕩，必要時加熱，再利用離心或過濾的方法使液、固分離，欲提取的農(nóng)藥組分進入溶劑。常用提取方法有振蕩法、搗碎法、超聲波法、索氏提取法、吹掃捕集法。

提取方法-8振蕩提取法振蕩浸提法是最常用的一種方法。它是將樣品粉碎后置于具塞三角瓶中，加入一定量的提取溶劑，用振蕩器振蕩1~3次，每次振蕩0.5~1h，過濾出溶劑后，再用溶劑洗滌濾渣一次或數(shù)次，合并提取液后進行濃縮凈化。適用于土壤、谷物等樣品中農(nóng)藥的提取。振蕩提取法振蕩浸提法是最常用的一種方法。它是將樣品粉碎后置于9組織搗碎法組織搗碎法也是一種常用的方法。它是將樣品先進行適當?shù)那兴?，再放入組織搗碎機中，加入適當?shù)娜軇焖贀v碎3~5min，過濾后進行濃縮凈化。適用于蔬菜、水果等新鮮動植物組織樣品中農(nóng)藥的提取。組織搗碎法組織搗碎法也是一種常用的方法。它是將樣品先進行適當10超聲波法目前一般是用超聲波清洗機來進行超聲波提取。在超聲波清洗槽中裝入一定量的水，將裝有樣品和提取溶劑的玻璃瓶放入其中，提取溶劑的液面要與槽中水面齊平。超聲波法目前一般是用超聲波清洗機來進行超聲波提取。在超聲波清11索式提取法用適當?shù)奶崛∪軇┰谒魇教崛∑髦羞B續(xù)回流提取幾小時，獲得提取液。提取效率高，但耗時長8h以上）適用于勻漿法等難提取樣品中殘留農(nóng)藥的提取或是作為其他提取方法提取效率的參照標準。不適合于熱不穩(wěn)定農(nóng)藥的提取。

索式提取法用適當?shù)奶崛∪軇┰谒魇教崛∑髦羞B續(xù)回流提取幾小時，12吹掃捕集法主要用于水樣中揮發(fā)性有機物的分析。主要構(gòu)件有吹沸器、捕集管，氣相色譜儀操作步驟：吹沸捕集解吸GC分析吹掃捕集法主要用于水樣中揮發(fā)性有機物的分析。13樣品前處理技術(shù)課件14提取方法-液-液提取法：常用于水樣或其他液體樣品中殘留農(nóng)藥的提取。將一種溶劑加入被測溶液中，利用被測組分在兩相中的分配不同而進入有機相，其他組分仍留在原液中而達到分離的目的。通常使用的是分液漏斗。常用的二相溶劑對系統(tǒng)有：乙酸乙酯-水、二氯甲烷-水，石油醚-水、石油醚-丙酮等。提取方法-15液液分配提取效率的高低取決于化合物與提取溶劑的親和性、二相的體積比和提取次數(shù)三個因素。影響提取效率的因素：

1.提取溶劑的選擇

2.水相的鹽濃度

3.水相的PH值乳化現(xiàn)象液液分配提取效率的高低取決于化合物與提取溶劑的親和性、二相的16

有機相、水相、乳化物和外力是乳化形成的主要因素。

破除乳化的方法：離心(2000rpm，2min）過濾（濾紙或無水硫酸鈉）在水相中加入一定量的鹽（氯化鈉或其水溶液）加入少量不同的有機溶劑（無水乙醇）在振搖時，采用輕緩地向一個方向振搖的方式。有機相、水相、乳化物和外力是乳化形成的主要因素。17

凈化技術(shù)

凈化（cleanup）是指通過物理的或化學(xué)的方法除去提取物中對測定有干擾作用的雜質(zhì)的過程。主要是利用分析物與基體中干擾物質(zhì)的理化特性的差異，將干擾物質(zhì)的量減少到能正常檢測目標殘留農(nóng)藥的水平。凈化技術(shù)18主要干擾雜質(zhì)及性質(zhì)類別化合物及其性質(zhì)脂類色素蠟質(zhì)肽、氨基酸碳水化合物木質(zhì)素脂肪、油脂（動物樣品），不溶于水，溶于多少有機溶劑葉綠素、葉黃素、胡蘿卜素等（植物樣品），不溶于水，能溶于乙醇、丙酮和石油醚蠟質(zhì)（許多蔬菜），易溶于有機溶劑含氮，對NPD、FPD檢測器有干擾糖、淀粉等，對低揮發(fā)性和高水溶性農(nóng)藥有干擾酚類及其衍生物，影響氨基甲酸酯類和苯氧羧酸類農(nóng)藥酚類代謝物的分析主要干擾雜質(zhì)及性質(zhì)類別化合物及其性質(zhì)脂類脂肪、油脂（動物樣品19常用凈化方法柱層析法濃硫酸處理法（水解脂類和色素，如凈化含有機氯類樣品）低溫冷凍（-80℃）法（凈化動物樣品，除去脂肪和某些色素）常用凈化方法柱層析法20柱層析法

柱層析法是應(yīng)用最普遍的傳統(tǒng)凈化方法。原理是將提取液中的農(nóng)藥和雜質(zhì)一起通過一支裝有吸附劑的層析柱，它們即被吸附在具有表面活性的吸附劑上，然后用溶劑進行淋洗，以達到目標物與雜質(zhì)分離的目的。

吸附劑的基本要求：具有較大的比表面；適宜的表面孔徑和吸附活性；粒度分布范圍盡量窄，并具有一定的強度。柱層析法柱層析法是應(yīng)用最普遍的傳統(tǒng)凈化方法。21常用四種吸附劑的比較吸附劑名稱主要成分活性強弱活化處理方法弗羅里硅土（Florisil)硫酸鎂與硅酸鈉作用生成的沉淀物適合脂肪含量高的樣品的凈化650℃烘烤3h，干燥器存放。使用前再于130℃活化1-2h。氧化鋁(alumina)氧化鋁（酸性、中性、堿性）對色素、脂肪、蠟質(zhì)有較強吸附能力先550℃加熱4h，用前130℃活化1-2h。加入5%~10%重量的水，混勻，放置過夜。硅膠硅酸鈉溶液加入鹽酸而制得的溶膠沉淀物對糖等極性雜質(zhì)有較強吸附能力先110℃加熱1h，再加入0%~10%重量的水，混勻后使用?；钚蕴刻亢趯χ参锷赜泻軓姷奈侥芰Γ瑢χ?、蠟質(zhì)吸附不強常與弗羅里硅土或氧化鋁按一定比例配合使用。常用四種吸附劑的比較吸附劑名稱主要成分活性強弱活化處理方法弗22柱層析法操作步驟：

裝柱（濕法或干法，一般2~10g）：用適當?shù)娜軇ㄈ鯓O性）預(yù)淋柱子，讓柱處于濕潤和適于接受溶液的狀態(tài)。上樣：將用溶劑稀釋的樣品溶液加在柱上，使樣品通過柱子。洗脫：以洗脫分析物而讓雜質(zhì)保留的溶劑（一般為混合淋洗液）梯度洗脫柱子，回收分析物。柱層析法操作步驟：裝柱（濕法或干法，一般2~10g）：用適23樣品濃縮技術(shù)

樣品濃縮的目的是使檢測溶液中待測物達到分析儀器靈敏度以上的濃度。常用的濃縮方法有：減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法

K-D濃縮法氮氣吹干法樣品濃縮技術(shù)樣品濃縮的目的是使檢測溶液中待測物達到分24減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法是利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在較低溫度下使大體積（50~500mL）提取液得到快速濃縮的方法，操作方便，但殘留農(nóng)藥容易損失，且樣品還須轉(zhuǎn)移、定容。原理是利用旋轉(zhuǎn)濃縮瓶對濃縮液起攪拌作用，并在瓶壁上形成液膜，擴大蒸發(fā)面積，同時又通過減壓，使溶劑的沸點降低，從而達到高效率濃縮目的。減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法是利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在較低溫度下使大25K-D濃縮法K-D濃縮法是利用K-D濃縮器直接濃縮到刻度試管中的方法，適合于中等體積(10~50mL)提取液的濃縮。特點是可有效減少濃縮過程中農(nóng)藥的損失，且能直接定容測定，無需轉(zhuǎn)移樣品。但只適用于少量體積的的樣品，且操作較煩瑣。

K-D濃縮法K-D濃縮法是利用K-D濃縮器直接濃縮到刻度試管26氮氣吹干法氮氣吹干法是直接利用氮氣流輕緩吹拂提取液及提高水浴溫度，加速溶劑的蒸發(fā)速度來濃縮樣品，可以有效防止氧化反應(yīng)但只適合于小體積濃縮。

氮氣吹干法氮氣吹干法是直接利用氮氣273樣品制備新技術(shù)固相萃取（solidphaseextraction,SPE）固相微萃?。╯olidphasemicroextraction，SPME）基質(zhì)固相分散（MatrixSolid–PhaseDispersion,MSPD）QuEChERS法免疫親和層析（immunoaffinitychromatography,IAC）凝膠滲透色譜（gelpermeationchromatography,GPC）加速溶劑萃?。╝cceleratedsolventextraction,ASE）超臨界流體萃?。╯upercriticalfluidextraction,SFE）3樣品制備新技術(shù)固相萃?。╯olidphaseextr28固相提取法（SPE）SPE利用顆粒細小的多孔固相吸附劑將液體樣品中的目標化合物選擇性地吸附，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達到分離和富集目標化合物的目的。只能分離性質(zhì)差別較大的物質(zhì)。固相提取法（SPE）SPE利用顆粒細小的多孔固相吸附劑將液體29固相萃取分離模式正相萃?。何絼O性大于洗脫液極性，用于萃取極性物質(zhì)。如硅膠、弗羅里硅土、氧化鋁、氨基等。

反相萃?。何絼O性小于洗脫液極性，用于萃取中等極性到非極性化合物。如C18、C8等。

離子交換萃?。何絼┒际菐в须姾傻碾x子交換樹脂，用于萃取帶有電荷的化合物。如SAX，SCX等。固相萃取分離模式30固相萃取流程吸附柱的選擇：根據(jù)待分離對象的特點選擇合適的吸附柱?；罨絼狠腿悠非坝眠m當?shù)娜軇┝芟垂滔嘀＜訕樱簩⒁呀?jīng)濃縮后的樣品采用適當溶劑溶解后加入到吸附小柱上。洗去干擾雜質(zhì)：選擇合適的淋洗溶劑將干擾雜質(zhì)先淋洗出小柱，農(nóng)藥保留在小柱中。洗脫分析物：選擇合適的淋洗溶劑將保留在小柱中的目標農(nóng)藥洗脫出來并收集。固相萃取流程31影響萃取效率的因素

吸附劑選擇：盡量選擇與目標化合物極性相似的吸附劑。

淋洗劑選擇：與目標化合物性質(zhì)及吸附劑有關(guān)。流速：樣品溶液的流速一般不超過5mL/min。影響萃取效率的因素32

固相萃取的優(yōu)缺點

高的回收率和富集系數(shù)

不需要大量溶劑

萃取時間短（是液液萃取的1/2）

操作簡單、快速、易實現(xiàn)自動化

缺點：復(fù)雜樣品有時會堵塞填料空隙；

復(fù)雜樣品的雜質(zhì)干擾等固相萃取的優(yōu)缺點33固相微萃?。⊿PME）SPME是在SPE基礎(chǔ)上發(fā)展起來高效的樣品預(yù)處理技術(shù)。它是利用固相提取的方法實現(xiàn)對樣品的分離和凈化，但所用的固相材料和分離機制不同。固相微萃?。⊿PME）SPME是在SPE基礎(chǔ)上發(fā)展起來高效的34SPME不是將待測物全部分離出來，而是通過殘留農(nóng)藥在樣品與固相涂層之間的平衡來達到分離目的。其固相是一支覆蓋著一層高聚物固定相（聚丙烯酸酯）的熔融石英纖維。浸入樣品中，待測組分擴散吸附到石英纖維表面的涂層，當吸附平衡后，與GC或HPLC聯(lián)用進行分析測定。SPME不是將待測物全部分離出來，而是通過殘留農(nóng)藥在樣品與固35樣品前處理技術(shù)課件36固相微萃取流程

吸附：萃取過程中應(yīng)用磁力攪拌、超聲振蕩等方式，可縮短達到平衡的時間。

解吸：高溫解吸（GC）或溶劑洗脫（HPLC）

纖維的老化和清洗：使用前都需要0.5-4h的老化。固相微萃取流程37

固相微萃取的影響因素固相涂層的性質(zhì)：非極性固相涂層（聚二甲基硅氧烷）；極性固相涂層（聚丙烯酸酯）液膜厚度：液膜越厚，吸附量越大，但平衡時間越長。攪拌效率：有利于縮短平衡時間。溫度：有利于縮短平衡時間，但會減少吸附量。鹽的作用和溶液酸度：可改變被分離物質(zhì)在水中的溶解度，提高靈敏度。固相微萃取的影響因素38

SPME的優(yōu)缺點

操作時間短(一般只需15min，是液液萃取的30%)

操作簡便無需萃取溶劑所需樣品量少適用范圍廣泛

缺點：石英纖維非常脆弱，易折斷，重復(fù)性較差。SPME的優(yōu)缺點39基質(zhì)固相分散萃?。∕SPD）MSPD是將樣品與吸附填料（與SPE吸附材料一致）一起混合研磨，得到半干狀態(tài)的混合物并將其作為填料裝柱，然后用不同的溶劑淋洗柱子，將各種待測物洗脫下來?；|(zhì)固相分散萃?。∕SPD）MSPD是將樣品與吸附填料（與S40反相吸附劑，如C8，C18，主要用來分離親脂性物質(zhì)正相吸附劑，用于分離極性較大的農(nóng)藥反相吸附劑，如C8，C18，主要用來分離親脂性物質(zhì)41優(yōu)點：樣品分析時間短溶劑用量少避免了樣品均化、轉(zhuǎn)溶、乳化等帶來的損失缺點：取樣量小造成檢測限較高雜質(zhì)凈化方面不如其他提取技術(shù)理想優(yōu)點：42QuEChERS法QuEChERS法是利用固相分散材料與樣品或樣品提取液充分接觸，吸附其中的雜質(zhì)而得到凈化的目的，或者是利用固相吸附劑吸附目標分析物，再進行解析而凈化。QuEChERS法QuEChERS法是利用固相分散材料與樣43其核心技術(shù)是凈化材料或萃取劑能夠選擇性地吸附樣品溶液中的目標化合物或干擾物質(zhì)，以達到凈化樣品的目的，PSA其核心技術(shù)是凈化材料或萃取劑能夠選擇性地吸附樣品溶液中的目標44優(yōu)點：快速、簡單、廉價、有效、可靠、安全（Quick,easy,cheap,effective,ruggedandsafe）缺點：PSA價格較貴，不適合大批量農(nóng)藥殘留的檢測

濃縮倍數(shù)小，需要靈敏度高的檢測儀器，如UPLC-MS-MS優(yōu)點：45免疫親和層析（IAC）IAC是以抗原抗體中的一方作為配基，親和吸附另一方的分離系統(tǒng)。是將抗體與惰性微珠（如，瓊脂糖、纖維素）共價結(jié)合，然后裝柱，將抗原溶液過免疫親和柱，非目標化合物不保留，最后用洗脫緩沖液洗脫抗原，從而得到純化的抗原。免疫親和層析（IAC）IAC是以抗原抗體中的一方作為配基，親46

免疫親和層析流程

裝填親和層析柱加樣本樣本和抗體反應(yīng)洗去未結(jié)合的物質(zhì)再洗去疏松結(jié)合的物質(zhì)洗脫和抗體緊密結(jié)合的部分免疫親和層析流程47免疫親和柱的優(yōu)缺點特異性強、凈化效率高過程簡單、統(tǒng)一缺點：載體價格昂貴特異性抗體難得免疫親和柱的優(yōu)缺點48凝膠滲透色譜（GPC）GPC又稱為體積排阻色譜，是按溶質(zhì)分子的大小進行分離的一種色譜技術(shù)。其原理是根據(jù)多孔凝膠對不同大小分子的排阻效應(yīng)進行分離，樣品中的大分子先被洗脫出來，小分子后被洗脫出來。凝膠滲透色譜（GPC）GPC又稱為體積排阻色譜，是按溶49凝膠類型：交聯(lián)葡聚糖凝膠（SephadexLH-20)

交聯(lián)聚苯乙烯凝膠（Bio-BeadsS-X）。溶劑的選擇：所選用的溶劑應(yīng)該對目標物有良好的溶解度，并對凝膠有一定的膨脹力。常用的洗脫溶劑有：二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、己烷等。.凝膠類型：50優(yōu)點：自動化程度高凈化效率高回收率高柱子可以重復(fù)使用缺點：小分子的干擾物會與目標化合物一起流出，有時須再增加凈化步驟。優(yōu)點：51加速溶劑萃?。ˋSE）1995年，推出的一種新的全自動提取技術(shù)。原理是選擇合適的溶劑、通過提高溫度(50~200℃)和壓力（1.5~2.0MPa）來加快萃取速度，提高萃取效率。適用于固體、半固體樣品的提取。特點：所需溶劑少(約15ml/10g)，

快速(20min)，提取效率高。加速溶劑萃?。ˋSE）1995年，推出的一種新的全自動提取技52

ASE的裝置和流程裝置：由溶劑瓶、泵、氣路、加熱爐、萃取池和收集瓶等構(gòu)成。流程：將樣品放入萃取池；設(shè)定程序，自動進行。（泵液、加溫加壓、萃取5min、收集）溶劑瓶：4個；萃取池：24個；收集瓶：26個ASE的裝置和流程53樣品前處理技術(shù)課件54

幾種萃取技術(shù)的比較技術(shù)樣品大小/g溶劑體積/mL平均萃取時間索氏提取10~30300~5004~48h超聲提取30100~3000.5~1h微波提取5300.5~1h振蕩提取10~301301~4hASE10~3015~4512~20min技術(shù)樣品大小/g溶劑體積/mL平均萃取時間索氏提取55已被美國環(huán)保局（EPA）選定為推薦的標準方法（EPA3545,1999）。優(yōu)點：溶劑用量少、快速、提取效率高缺點：選擇性不高，萃取液多采用固相萃取、凝膠滲透色譜等加以凈化后再進儀器檢測。已被美國環(huán)保局（EPA）選定為推薦的標準方法（EPA35456超臨界流體提取法（