生物化學(xué)-重組DNA技術(shù)

重組DNA技術(shù)

RecombinantDNAtechnology鄧益斌

主要內(nèi)容掌握重組DNA技術(shù)的定義掌握限制性核酸內(nèi)切酶的概念熟悉常用工具酶的種類及用途熟悉重組DNA技術(shù)的基本步驟第一節(jié)重組DNA技術(shù)

的定義及步驟

基因重組技術(shù):在體外對不同來源的DNA分子進(jìn)行共價(jià)連接形成重組DNA，再將重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞，擴(kuò)增、繁殖和表達(dá)。

基本步驟2.將目的基因與運(yùn)載體DNA在體外進(jìn)行重組目的基因運(yùn)載體DNA限制性核酸內(nèi)切酶DNA重組體引入宿主細(xì)胞篩選出含有重組體的細(xì)胞無性繁殖擴(kuò)增、表達(dá)基因產(chǎn)物3.轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染4.篩選5.克隆（cloning）基因的表達(dá)、檢測、分離1.目的基因獲得一、限制性核酸內(nèi)切酶選用II型限制酶，能專一識別和切割雙鏈DNA限制酶的命名HaemophilusinfluenzaeRd嗜血桿菌屬流感桿菌（種名）株名取H取indHindI第二節(jié)重要的工具酶若該微生物有不同的變種和品系，再加上該變種和品系的第一個(gè)字母，需大寫；從同一種微生物中發(fā)現(xiàn)多種限制酶，依據(jù)發(fā)現(xiàn)的前后順序用羅馬數(shù)字表示：例如從淀粉液化芽孢桿菌（Bacillsamyloliquefaciens)H株分離的第一種限制型內(nèi)切酶，命名為BamHIII型限制內(nèi)切酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生三種不同的切口（1）產(chǎn)生平末端：5’AGCT3’AluI

5‘AGCT3’3’TCGA5‘3’TCGA5‘（2）產(chǎn)生5’端突出的粘性末端5’GGATCC3’BamHI

5’GGATCC3’3’CCTAGG5’3’CCTAGG5’（3）產(chǎn)生3’端突出的粘性末端5’GAGCTC3’SaCI

5’GGAGCTC3’3’CTCGAG5’3’CTCGAG5’二、DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段):

大腸桿菌DNA聚合酶I分子量109kD,它具有三種酶活性。Klenow片段分子量76kD，

它具有二種酶活性（去除5’3’外切酶活性）。2.Taq

DNA聚合酶:耐熱（75-80℃），分子量65kD,也具5’3’外切酶活性。反轉(zhuǎn)錄酶(RDDP):多功能酶，無3’5’DNA外切酶活性，具有3’5’RNA外切酶活性。4.末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶:60kD(3’羥基端）三、DNA連接酶：

1.T4噬菌體DNA連接酶：兩個(gè)不同片段雙鏈DNA存在互補(bǔ)粘性末端（Km=0.6μmol/L)或平末端(Km=50μmol/L)。2.大腸桿菌DNA連接酶四、T4多核苷酸激酶:催化將ATP的γ-磷酸轉(zhuǎn)移到DNA鏈5’末端五、堿性磷酸酶：催化切除DNA、RNA、dNTP上5’磷酸基團(tuán)重組5’—A3’—TTCGA—AGCTT—3’A—5’目的基因粘性末端運(yùn)載體DNA粘性末端5’—AAGCTT—3’—TTCGAA—DNA連接酶退火末端轉(zhuǎn)移酶粘端連接平端連接dTTP末端轉(zhuǎn)移酶dATP退火DNA連接酶第一部分

獲得目的基因

第一節(jié)目的基因的獲得原核生物基因組較小,目的基因定位較容易，一般可直接分離獲得。即用限制性核酸內(nèi)切酶將基因組切成若干片段后，用帶標(biāo)記的核酸探針從中篩選、確定、提純、擴(kuò)增。真核生物基因組龐大，一個(gè)單拷貝僅占整個(gè)基因組的10-7~10-5，從中獲取某一基因常采用以下幾種方法：1.PCR獲取目的基因

2.用DNA合成儀人工合成目的基因3.從DNA文庫（genelibrary）中篩選出目的基因DNA文庫

各種重組DNA分子的集合體，叫DNA文庫

cDNA文庫

基因組文庫

將DNA用酶法裂解（鳥槍法）裂解為相當(dāng)于基因長度的片段分別與質(zhì)粒重組并引入大腸桿菌即為基因組文庫（G-文庫）基因組文庫：分離純化基因組DNA篩選目的基因分離純化mRNA用oligo-dT親和層析法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并復(fù)制成雙鏈的DNA與質(zhì)粒重組并引入大腸桿菌即為cDNA文庫篩選目的基因核酸雜交法和免疫結(jié)合法cDNA文庫：一、構(gòu)建cDNA文庫篩選目的基因

1.真核細(xì)胞mRNA的分離純化◆提取細(xì)胞內(nèi)總RNA：裂解、離心去核、抽提RNA◆分離純化mRNA：oligo-dT纖維親和層析柱模板：mRNA引物：oligo-dT逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴RNA的DNA聚合酶底物：dNTP合成方向：5’→3’2.反轉(zhuǎn)錄合成cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶RNaseHDNA聚合酶mRNA模板雜化雙鏈單鏈DNAcDNA與載體連接、導(dǎo)入宿主細(xì)胞AAA3’AAA3’TTT5’TTT5’3’GGG3’GGG5‘CCCTTT5’AAA3’3.構(gòu)建cDNA文庫cDNA兩端加接頭或銜接頭cDNA與載體相連導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行克隆（來自一個(gè)細(xì)胞的克隆體）4.篩選目的基因核酸雜交法：用與目的基因互補(bǔ)、帶放射性標(biāo)記的寡核苷酸鏈為“探針”，與目的基因特異結(jié)合并示蹤免疫結(jié)合法：應(yīng)用特異性抗體—免疫學(xué)探針進(jìn)行篩選(表達(dá)性載體）第二節(jié)獲得目的基因方法的選擇原則一、根據(jù)獲得目的基因的目的二、根據(jù)目的基因本身特點(diǎn)三、根據(jù)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件第二部分

重組體的構(gòu)成、導(dǎo)入和篩選

第一節(jié)基因克隆的載體載體分為克隆載體（cloningvector）和表達(dá)載體（expressionvector），是攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞擴(kuò)增和表達(dá)的工具。常用質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA或病毒進(jìn)行適當(dāng)改建而成?；蜉d體的功能：1.是運(yùn)載體，攜帶目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞;2.能自主復(fù)制，進(jìn)入細(xì)胞后可以進(jìn)行復(fù)制或表達(dá)基因產(chǎn)物;3.具備篩選標(biāo)志;4.適當(dāng)限制酶切位點(diǎn);5.在細(xì)胞中拷貝數(shù)高。質(zhì)粒（plasmid）是細(xì)菌內(nèi)攜帶的染色體外的小型雙鏈環(huán)狀DNA，能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制。具備下列特點(diǎn)：1.分子量相對較小能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)。2.具有一個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于在宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇。3.具有多個(gè)限制性酶的單一切口，稱為多克隆位點(diǎn)。便于外源基因的插入。常用質(zhì)粒載體pBR322質(zhì)粒：由一系列大腸桿菌質(zhì)粒DNA通過重組技術(shù)構(gòu)建成，長度為4.36kb，特點(diǎn)：（1）含有復(fù)制起始點(diǎn)和復(fù)制調(diào)節(jié)信號；（2）有單個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)，可切開插入目的基因；（3）有抗四環(huán)素基因Ter+和抗氨芐青霉素基因Amp+，便于重組體細(xì)胞的篩選。pUC系列載體:由pBR質(zhì)粒與M13噬菌體構(gòu)建而成，長度為2.674kb，特點(diǎn)：（1）含有抗氨芐青霉素基因Amp+和復(fù)制起始點(diǎn)。（2）含有大腸桿菌lacZ操縱子的DNA片段（lacZ’基因），與宿主細(xì)胞實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)，形成完整的β-半乳糖苷酶基因，能分解生色底物5-溴-4-氫-3-吲哚-β-D半乳糖苷,形成藍(lán)色菌落——藍(lán)白斑篩選。（一）粘性末端連接1.全同源粘性末端

同一單酶切；方便，但高背景（空白載體）和雙向插入載體：5’---GAATTC---3’3’---CTTAAG---5’目的DNA：5’GAATTC----GAATTC3’3’CTTAAG----CTTAAG5’第二節(jié)目的基因與載體的連接定向克?。菏雇庠碊NA片段定向插入到載體分子。

雙酶切，(1)載體不能自連

(2)目的DNA定向插入

粘-粘，粘-