高密度固體發(fā)酵白酒糟的研究

高密度固體發(fā)酵白酒糟的研究

白酒灰是酒精生產(chǎn)的主要副產(chǎn)品。中國每年約有2000萬噸新鮮白酒灰，相當(dāng)于600萬噸干酒灰。白酒糟水分大,酸度高,易腐爛變質(zhì),不易保管和運(yùn)輸,且其中含有50%左右難于消化的稻殼,直接飼喂效果欠佳。因此,目前絕大多數(shù)白酒糟都以低廉價(jià)格作為粗飼料,部分作為廢棄物任意堆放,嚴(yán)重污染環(huán)境。我國是一個(gè)飼料蛋白資源嚴(yán)重短缺的大國,每年需從國外進(jìn)口大量豆粕、魚粉等以填補(bǔ)國內(nèi)市場的不足。基于此,本研究以白酒糟為基質(zhì)進(jìn)行酵母細(xì)胞的高密度固體發(fā)酵,通過提高白酒糟中的酵母細(xì)胞數(shù)量,既可充分利用白酒糟,減少它對(duì)環(huán)境的污染,又可提高其營養(yǎng)價(jià)值,使之成為新型的蛋白飼料,創(chuàng)造出更大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,從而更好地滿足養(yǎng)殖業(yè)和農(nóng)牧業(yè)的需求,具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1病毒釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。1.1.2復(fù)合酶制劑濃度固體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:將白酒糟于60℃烘48h,過60目篩,向其中添加適量復(fù)合酶制劑。其中復(fù)合酶制劑由武漢新地生物技術(shù)發(fā)展有限公司提供,白酒糟由湖北十堰白泉酒業(yè)有限公司提供。酵母菌活化培養(yǎng)基:YPD液體培養(yǎng)基;酵母菌平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基:YPD固體培養(yǎng)基。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1母細(xì)胞激活法挑取酵母菌一環(huán),接種于200ml的YPD液體培養(yǎng)基中28℃、200r/min搖瓶培養(yǎng)24h,得到活化好的酵母菌懸液備用。1.2.2計(jì)算螺母細(xì)胞的方法酵母菌生長曲線的測定:稀釋涂平板計(jì)數(shù)法;酵母細(xì)胞總數(shù)的測定:顯微鏡血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法。1.2.3固體發(fā)酵條件的優(yōu)化1.2.3.酵母菌種發(fā)酵250ml三角瓶中分別裝入干酒糟5、10、15、20g,加入干糟質(zhì)量4%的復(fù)合酶制劑,接種活化后的酵母菌液,接種量為1億/g干酒糟,控制料水比為1:1,搖勻,封口膜封口后于30℃恒溫箱中培養(yǎng),培養(yǎng)周期為72h,自然pH值。自發(fā)酵起始每隔12h翻料一次至發(fā)酵結(jié)束。每組設(shè)3個(gè)平行,以發(fā)酵結(jié)束后血球計(jì)數(shù)法所得酵母總數(shù)為指標(biāo)確定裝料量。1.2.3.復(fù)合酶制劑添加量的確定選取裝料量10g,按干糟質(zhì)量的1%、2%、3%、4%、5%添加復(fù)合酶制劑,并設(shè)不加復(fù)合酶制劑的對(duì)照,其余條件不變。每組設(shè)3個(gè)平行,以發(fā)酵結(jié)束后血球計(jì)數(shù)法所得酵母總數(shù)為指標(biāo)確定復(fù)合酶制劑添加量。1.2.3.調(diào)整培養(yǎng)基初始含水量選取裝料量10g,加入干酒糟質(zhì)量4%的復(fù)合酶制劑,調(diào)整培養(yǎng)基初始含水量分別為40%、45%、50%、55%、60%,其余條件不變。每組設(shè)3個(gè)平行,以發(fā)酵結(jié)束后血球計(jì)數(shù)法所得酵母總數(shù)為指標(biāo)確定初始水分。1.2.3.固體基質(zhì)接種量選取裝料量10g,加入干糟質(zhì)量4%的復(fù)合酶制劑,按0.1、0.3、0.5、0.7、1、2億/g固體基質(zhì)接種量接入活化后的酵母懸液,調(diào)整培養(yǎng)基初始含水量為45%,其余條件不變。每組設(shè)3個(gè)平行,以發(fā)酵結(jié)束后血球計(jì)數(shù)法所得酵母總數(shù)為指標(biāo)確定接種量。1.2.3.初始ph值對(duì)養(yǎng)基回收率的影響選取裝料量10g,加入干糟質(zhì)量4%的復(fù)合酶制劑,以稀硫酸和CaO調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0,對(duì)照組為自然pH值組(CK),接種量0.7億/g干酒糟,調(diào)整培養(yǎng)基初始含水量為45%,其余條件不變。每組設(shè)3個(gè)平行,以發(fā)酵結(jié)束后血球計(jì)數(shù)法所得酵母總數(shù)為指標(biāo)確定初始pH值。1.2.3.發(fā)酵溫度對(duì)酵母總菌數(shù)的影響選取裝料量10g,加入干糟質(zhì)量4%的復(fù)合酶制劑,自然pH值,接種量0.7億/g干酒糟,調(diào)整培養(yǎng)基初始含水量為45%,分別在25、28、30、37℃的發(fā)酵溫度下,發(fā)酵84h,每隔12h測定酵母總菌數(shù),其余條件不變。每組設(shè)3個(gè)平行,以血球計(jì)數(shù)法所得酵母總數(shù)為指標(biāo)確定最適培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。1.2.4固液體發(fā)酵技術(shù)的優(yōu)化1.2.4.無機(jī)氮源添加量本實(shí)驗(yàn)選用淀粉和糖蜜作為碳源,設(shè)定碳源添加量為8%(w/w);選用NH4Cl、NaNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4、尿素作為無機(jī)氮源,胰蛋白胨作為有機(jī)氮源,設(shè)定氮源添加量為0.5gN/kg干糟。外加碳、氮源均配置成一定濃度的混合營養(yǎng)液,向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中等體積補(bǔ)加進(jìn)去,搖勻分散,按照優(yōu)化后的固體發(fā)酵條件培養(yǎng)至72h。每組設(shè)3個(gè)平行,以發(fā)酵結(jié)束后酵母總數(shù)為指標(biāo)確定所添加碳、氮源的種類。1.2.4.糖蜜、尿素的添加量對(duì)高密度發(fā)酵的影響向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加相同體積(設(shè)定為2ml)不同濃度的糖蜜和尿素混合液(見表1),按照優(yōu)化后的固體發(fā)酵條件培養(yǎng)至72h,研究不同的糖蜜、尿素添加量對(duì)酵母高密度發(fā)酵的影響,設(shè)計(jì)兩因素四水平的正交實(shí)驗(yàn)表,以酵母總數(shù)為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。2結(jié)果與分析2.1優(yōu)化固發(fā)條件2.1.1裝料量對(duì)酵母生長的影響裝料量可在一定程度上影響酵母的生長。裝料量少,水分蒸發(fā)快,不利于酵母微環(huán)境穩(wěn)定,而且設(shè)備利用率較低;裝料量多,透氣性差,不利于氧氣等營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸,而且會(huì)出現(xiàn)酒糟中心溫度過高的現(xiàn)象。試驗(yàn)結(jié)果見圖1。從圖1中可以看出,裝料量過低或過高都對(duì)酵母生長不利,當(dāng)裝料量為10g時(shí),酵母生長較好。因此選擇最適裝料量為250ml三角瓶裝10g。2.1.2酵母質(zhì)降解實(shí)驗(yàn)復(fù)合酶制劑中含有β-葡聚糖酶、果膠酶、纖維素酶、淀粉酶等,可以將酒糟中的纖維素、淀粉類物質(zhì)降解,有利于酵母對(duì)酒糟中難以自行利用的營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用,有利于酵母的快速生長繁殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。從圖2中可以看出,在酒糟中添加復(fù)合酶制劑的效果非常明顯,添加復(fù)合酶制劑與不添加的對(duì)照組差異很大,但當(dāng)添加量為4%~5%時(shí),變化不大。為節(jié)約成本,選用最適添加量4%。2.1.3酒糟含水量對(duì)酵母菌生長的影響培養(yǎng)基含水量是影響固態(tài)發(fā)酵結(jié)果的主要因素之一?；|(zhì)水分含量過低,會(huì)減緩和妨礙菌體生長繁殖;基質(zhì)水分含量過高,會(huì)造成供氧不足,同樣影響菌體生長,只有基質(zhì)含水量適中時(shí),酵母生長才比較旺盛。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出,當(dāng)酒糟含水量從40%~60%變化時(shí),酵母數(shù)量先增加后減少,當(dāng)含水量在45%~50%時(shí),酵母菌數(shù)約為17億/g干糟。因此選擇最適含水量45%~50%。2.1.4接種量對(duì)酵母菌多樣性的影響接種量與培養(yǎng)基的利用率直接相關(guān),接種量大會(huì)加速營養(yǎng)物質(zhì)的利用,縮短生長周期;接種量太少,不能充分利用營養(yǎng)物質(zhì),而且會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵周期延長,從而提高染菌的概率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示,當(dāng)接種量為0.7億/g干酒糟時(shí),酵母總數(shù)約18.9億/g干糟。因此選擇最適接種量為0.7億/g干酒糟。2.1.5初始ph值對(duì)酵母菌生長的影響pH值是決定微生物生長狀況的重要因素之一。酵母菌能在pH值為3~8.5的范圍內(nèi)生長,最適pH值為4.5~5.0。pH值可影響酵母細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞內(nèi)酶活、營養(yǎng)物質(zhì)的存在狀態(tài)以及酵母對(duì)其吸收等,對(duì)酵母生長的影響較大。適宜的酸堿度有利于酵母生長,酵母的代謝活動(dòng)也會(huì)影響環(huán)境pH值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。從圖5中看出,自然pH值下酵母總數(shù)為19.1億/g干糟,經(jīng)測定,該酒糟自然pH值為3.6。隨著pH值的增高,酵母數(shù)量在減少。酵母之所以會(huì)在初始pH值低于4.5的培養(yǎng)基中生長良好,是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中,培養(yǎng)基的pH值會(huì)增高(經(jīng)測定發(fā)酵終點(diǎn)的pH值為6.5左右),所以初始pH值適當(dāng)?shù)鸵恍┯欣诮湍傅母呙芏劝l(fā)酵培養(yǎng)。因市場上大部分酒糟初始pH值均偏酸,選擇自然pH值,也有利于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。2.1.6發(fā)酵溫度和發(fā)酵周期溫度的高低直接影響酵母的生長。溫度過低,酵母只在基質(zhì)中下層生長,溫度過高只在基質(zhì)表面生長且會(huì)殺死菌種,同時(shí),培養(yǎng)溫度和時(shí)間具有相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6,從圖6中可以看出,在溫度為30℃時(shí),酵母在各個(gè)時(shí)間段的生長都最好,據(jù)此酵母培養(yǎng)溫度選用30℃。同時(shí)可以看出,在48h之前酵母增加比較快,48h之后雖然也在增加,但是趨勢變緩,72h達(dá)到最高峰,此后酵母數(shù)量開始下降。因此初步確定發(fā)酵溫度30℃,發(fā)酵周期為72h。從以上實(shí)驗(yàn)得到釀酒酵母高密度發(fā)酵白酒糟的最適發(fā)酵條件為:250ml三角瓶裝入干白酒糟10g,加入干糟質(zhì)量4%的復(fù)合酶制劑,按0.7億/g干糟的量接入活化后的酵母,調(diào)整酒糟的含水量為45%~50%,自然pH值,封口膜封口后于30℃恒溫箱中發(fā)酵培養(yǎng)至72h結(jié)束。此時(shí)酵母數(shù)量可達(dá)到19.8億/g干糟。2.2固液體發(fā)酵技術(shù)的優(yōu)化在菌體生長中后期由于營養(yǎng)不足、碳氮源不平衡、微量元素缺乏,菌體會(huì)過早衰老。因此有必要向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)入一定的營養(yǎng)物質(zhì)。2.2.1添加糖蜜、氮源、尿素對(duì)酵母菌生長的影響碳源是氮源微生物生長菌體時(shí)需要量最大的物質(zhì),在發(fā)酵前期消耗很快,到了中后期,菌體要維持活性必須外加一定量的碳氮源,以延緩菌體衰老。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7、圖8所示。從圖7中可以看出,在外加碳源中,添加糖蜜的實(shí)驗(yàn)組生長較好,分析原因可能是因?yàn)樘敲圩鳛橹铺堑闹饕碑a(chǎn)物,總糖分為50%左右,它不僅含有酵母生長可直接利用的碳源,還含有微量元素及維生素等多種成分,可促進(jìn)酵母生長;在外加氮源中,添加尿素的實(shí)驗(yàn)組生長較好,它的主要作用是調(diào)節(jié)pH值和補(bǔ)充酵母菌生長所需氮源,從而控制代謝活動(dòng)。這和姚曉紅等的研究結(jié)果一致。據(jù)此確定最適碳、氮源分別為糖蜜和尿素。2.2.2最優(yōu)發(fā)酵條件及工藝以補(bǔ)料種類中糖蜜和尿素添加量為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)了2因素4水平的正交實(shí)驗(yàn)。通過正交實(shí)驗(yàn)L16(4)2找到糖蜜和尿素的最適添加量。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。從表2看出糖蜜的補(bǔ)料量是對(duì)酵母高密度發(fā)酵影響較大的因素,其次為尿素添加量。理論上最佳添加量為A3B3,即糖蜜添加量8%(w/w干糟),尿素添加量0.5gN/kg干糟。按照優(yōu)化后的發(fā)酵條件進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,酵母總數(shù)達(dá)到30.3億/g干糟。這比只采用最佳發(fā)酵條件而未中間補(bǔ)料的工藝,酵母數(shù)量提高了53%左右。按最優(yōu)發(fā)酵條件及工藝進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn),所測得酵母總數(shù)分別為29.5、30.4、29.9億/g干糟,平均值為30億/g干糟,說明該優(yōu)化條件具有良好的重現(xiàn)性和可靠性。釀酒酵母高密度固態(tài)發(fā)酵白酒糟實(shí)驗(yàn)室最佳發(fā)酵條件及工藝為:250ml三角瓶裝入干白酒糟10g,并補(bǔ)加混合營養(yǎng)液2ml(以干糟質(zhì)量的8%添加糖蜜,以0.5gN/kg干糟的量添加尿素),搖勻分散,加入干糟質(zhì)量4%的復(fù)合酶制劑,按0.7億/g干糟的量接入活化后的酵母,調(diào)整酒糟的含水量為45%~50%,封口膜封口后于30℃恒溫箱中發(fā)酵培養(yǎng),自發(fā)酵起始每隔12h翻料一次至72h固體發(fā)酵結(jié)束。最終酵母總數(shù)可達(dá)30億/g干糟。3復(fù)合酶制劑發(fā)酵及活性物質(zhì)含量白酒用高粱、玉米、小麥、稻谷、大麥等純糧單一原料或者混合原料發(fā)酵而成。白酒發(fā)酵主要是對(duì)原料中的淀粉轉(zhuǎn)化,對(duì)原料中的蛋白質(zhì)成分轉(zhuǎn)化利用較少,它們基本保存在酒糟中。根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)的分析測定,由于發(fā)酵的濃縮作用(原料淀粉被利用),酒糟的蛋白質(zhì)含量(干基)與原料相比,可以提高一倍以上,達(dá)到15%以上,除蛋白質(zhì)含量較高外,酒糟蛋白質(zhì)的氨基酸組成比較平衡,基本上是全價(jià)的;酒糟中礦物質(zhì)含量也很豐富,其中鈣、鐵等主要微量元素含量比較高;此外,還含有多種維生素,以及菌體自溶產(chǎn)生的各種生物活性物質(zhì)(如嘌呤、嘧啶、類脂化合物、酶類),具有生物轉(zhuǎn)化為高質(zhì)量飼料的潛質(zhì),這也是本實(shí)驗(yàn)中酵母得以快速生長繁殖的基礎(chǔ)。本研究僅在發(fā)酵初始階段