基因操作總結(jié)(完整資料)

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質(zhì)粒重組的注意事項基因操作總結(jié)(完整資料）(可以直接使用，可編輯優(yōu)秀版資料，歡迎下載）１質(zhì)粒重組主要包括質(zhì)粒提取、限制性酶切、目的片段回收、連接及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化這五個基本步驟?，F(xiàn)在結(jié)合本人在實驗室長期從事質(zhì)粒重組的實際情況總結(jié)一下質(zhì)粒重組實驗操作的一些注意事項.1.1質(zhì)粒提?。嘿|(zhì)粒重組對質(zhì)粒的質(zhì)量要求比較高;我們實驗室是用堿裂解法提取質(zhì)粒，一般說來，如果質(zhì)粒的拷貝數(shù)比較高而小量制備的質(zhì)粒量可以滿足實驗需要的話，那么對于初學(xué)者本人不推薦在質(zhì)粒提取這一步使用大量制備方法，因為大量制備方法步驟過多對質(zhì)粒的“傷害”要大于小量提取方法且所需時間相對較長。小量提取質(zhì)粒過程中建議只用酚－氯仿抽提一次即可，上清少取一些（200ul一般)就不需要用氯仿再抽提一次了，最后在用TER溶解質(zhì)粒之前質(zhì)粒的晾干最好是放在37度培養(yǎng)箱內(nèi)，若質(zhì)粒提取起始菌液為1。5ml則晾干時間最好不要超過10分鐘（一般5分鐘即可);若質(zhì)粒提取起始菌液為3ｍl則晾干時間最好不要超過2０分鐘,質(zhì)粒晾干后馬上加入ＴＥＲ于60度水浴鍋中助溶20分鐘.１。2限制性酶切:一般我喜歡用總體積為8０ul的酶切體系,加入的酶量為１uｌ(10個單位）。對于將來要做為載體的ＤNＡ模板一般切割量是2-3ug;而對于做為外插片段的質(zhì)粒則要考慮酶切下來的小片段與質(zhì)粒的長度比例來確定模板量，比如我們要從10Ｋb的質(zhì)粒上切下的外插片段長度為１Kｂ，那么我們的小片段與質(zhì)粒的質(zhì)量比為1：1０，這樣的話我們?yōu)榱吮ＷC小片段有800ng－1uｇ而需要酶切的模板量則是8ug－1０ｕｇ。1。3目的片段回收：酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后于紫外燈照射下切取所要的目的條帶時,一定要謹記兩個要求：１、一定要快；2、膠塊一定要小。１。4連接:載體一般加５0-１00ｎg左右，外插片段加的量是保證與載體的ｍol比為3:1即可。本人做連接反應(yīng)從來不做梯度，因為我堅信如果回收的目的片段質(zhì)量好的話，一個反應(yīng)即可成功.1．5連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌常用的方法有電轉(zhuǎn)化法和熱激法。電轉(zhuǎn)化法依靠短暫的高壓電脈沖造成細胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔有利于DNＡ進入細菌；電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌時，電壓高，脈沖時間長，轉(zhuǎn)化率高，但細胞的死亡率也高且需要購買電轉(zhuǎn)化儀。熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌不需要電轉(zhuǎn)化儀,操作簡便，是我們實驗室所選用的轉(zhuǎn)化方法。熱激法轉(zhuǎn)化細菌成功的關(guān)鍵步驟是感受態(tài)細胞的制備，目前常用的感受態(tài)細胞制備方法有CａCl２和RbＣl（KCｌ）法，RbCl(ＫCｌ）法制備的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率較高，但CaＣl２法簡便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實驗的要求。ＣaCl2法制備感受態(tài)細胞熱激法轉(zhuǎn)化細菌的的原理是：大腸桿菌在0℃CaCl2低滲溶液中,細菌細胞膨脹成球形,轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗ＤNasｅ的羥基－鈣磷酸復(fù)合物粘附于細胞表面，經(jīng)4２℃短時間熱沖擊處理,促進細胞吸收DNA復(fù)合物,在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)十分鐘后，球狀細胞復(fù)原并分裂增殖。在被轉(zhuǎn)化的細胞中，重組子基因得到表達，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉(zhuǎn)化子。在轉(zhuǎn)化過程中所要注意的事項有以下幾點：感受態(tài)細胞的制備盡量在低溫條件下操作，且動作要輕柔；感受態(tài)細胞制備好后加入連接產(chǎn)物輕柔混勻一次在冰上放置不要少于2０分鐘，而且注意冰浴過程中不要再去混勻它們。熱激后加入液體培養(yǎng)基復(fù)舒時搖床轉(zhuǎn)速控制在2０0轉(zhuǎn)/分以內(nèi).用涂布棒將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂平板時,注意用力要輕,快速涂勻即可。平板倒置在培養(yǎng)箱里培養(yǎng)時間一般為16－18小時，不要超過20小時。2實驗舉例：pCAＭBIA1300－3５Ｓnos的重組該實驗是用EcｏＲI和HｉnｄIＩI兩種酶酶切pＣAMＢＩＡ13０0回收大片段作為載體，酶切pROＫII回收小片段（3５Sｎos）作為外插DNＡ與載體進行連接，這個實驗是一個雙酶切連接實驗；雙酶切連接實驗是質(zhì)粒重組中最簡單的一種實驗,成功率極高。2.1．1質(zhì)粒pCＡMBIA１300與pＲOKII的提取.質(zhì)粒pＣAMBIA1300在大腸桿菌中拷貝數(shù)很高，用小量制備方法提取即可，起始菌液為３ｍl（1。5ｍｌ管回收菌液兩次),提取過程中注意動作要輕柔，最后在用２2ｕlTER溶解ＤNA，取1ｕｌ溶解好的ＤNA電泳看提取效果.質(zhì)粒ｐROＫＩI的拷貝數(shù)較低，采用中量制備方法提取。2。1.2雙酶切質(zhì)粒80uｌ酶切體系EｃoRＩ與HindIII各加1uｌ,質(zhì)粒ｐＣAMBＩA１300酶切2ug，pROKII酶切8ug,酶切反應(yīng)過夜從晚6點切到次日早晨8點，加入電泳上樣BＵFＦER中止反應(yīng)。２.1．3回收與定量酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后切膠回收,電泳時間可以比普通電泳適當(dāng)長些,切膠要快要準,用Ｋｉt回收后取1ｕl電泳定量。由于pＲOKIＩ是低拷貝，若提取的質(zhì)粒量不到8uｇ比如只有4ｕg那么酶切回收小片段的量可能會很少，這時可以將回收物開蓋放置于60度水浴鍋中將其濃縮一下。注意:小片段可以濃縮,載體大片段不建議進行濃縮。2.１.4連接與轉(zhuǎn)化10ｕl連接體系，加1ul1０Χbｕｆｆer、0．5ul連接酶，載體加８０ｎｇ，由于載體（8kb左右)分子量是外插（３５sｎos約1kb左右）是的8倍，所以外插加入30ｎg即可。16度連接過夜。次日取5ul連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。２.２pCAMBIA1３０0－ｕbiiｐtnoｓ的重組本實驗用ＫpnＩ單酶切質(zhì)粒pCAMＢＩA1３０0－ubiｎos和Teasy—ｉpt分別回收載體與iｐｔ基因片段進行連接,這是一個單酶切連接實驗。單酶切連接實驗比起雙酶切連接實驗來說需要多注意的一步是載體脫磷反應(yīng),這一步如果做的好的話那么實驗成功率也是極高的.2．２。1當(dāng)酶切載體后載體是5’突出粘末端時，那么在過夜的酶切產(chǎn)物中直接加入1ul的CIAＰ酶，37度反應(yīng)３6分鐘即可加入上樣bｕfｆeｒ中止反應(yīng)，電泳回收即可。2。２.２如果酶切載體后載體是3’突出粘末端，比如本實驗ｋpｎＩ酶切后載體就是3’突出的，5’端的磷酸基團是在里邊的；這種情況時，我是在酶切時用30ul的酶切總體系,用1ul的酶過夜酶切2ug的pCＡＭＢIＡ1300－ubiｎos質(zhì)粒，然后加入７ul的10ΧCＩＡPbufｆer，1ul的CIＡP酶，加ｄdＨ２O到總體積為１00uｌ，5０度反應(yīng)半個小時后中止反應(yīng)電泳回收.2。２。3其它注意事項同雙酶切連接實驗附:感受態(tài)的制備與連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化步驟1。CaCl２法制備感受態(tài)細胞1.1從37oC培養(yǎng)1６-20小時的新鮮平板中挑取一個單菌落，轉(zhuǎn)到一個含有10mlＬB培養(yǎng)基的1０0mｌ燒瓶中，37oC劇烈震蕩培養(yǎng)約3小時，至OＤ6０0值為0．2－0。3。1.２將細菌轉(zhuǎn)移到一個無菌、一次性使用的、冰預(yù)冷的7ml聚丙烯管中，冰上放置10分鐘,使培養(yǎng)物冷至0oC。1。3于4oC以50０0rpm離心10分鐘，以回收細胞.1。4倒出培養(yǎng)液，將管倒置至少一分鐘，使培養(yǎng)液流干凈。１。5每5ml培養(yǎng)液用2ml預(yù)冷的0。1mｏｌ/l的CaCl２重懸細胞,冰上放置１0分鐘。1。6于4oＣ以５000rpm離心10分鐘，以回收細胞。倒出培養(yǎng)液,將管倒置至少一分鐘,使培養(yǎng)液流干凈。1.7每管用２00ul預(yù)冷的0.1mｏl／l的ＣaCl２重懸細胞，此時感受態(tài)細胞制備完畢。2連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化2。１用冷卻的無菌吸頭從用CaCl2制備的感受態(tài)細胞中吸取2０0μι轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，每管加入連接產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，冰上放置３0分鐘。2。2將管在4２oC水浴中放置９0秒,不要搖動。2．3快速將管放置冰浴中，使細胞冷卻。2。4每管加800ulSOC培養(yǎng)基,用水浴加熱至37oC，然后將管轉(zhuǎn)移到搖床上，溫育４5分鐘，使細菌復(fù)蘇并表達抗生素抗性基因.2．５取適當(dāng)體積已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞涂布到含相應(yīng)抗生素的LB平板上。２。6倒置平板，37oC培養(yǎng)過夜.2．7選擇白斑菌落，提取質(zhì)粒并進行鑒定思考題第二章分子克隆工具酶1簡述基因工程研究用的工具酶的類型和作用特點。２。說明限制性內(nèi)切核酸酶命名原則(舉例)。3.限制內(nèi)切核酸酶的星活性是指什么？在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星星活性.星星活性是限制性內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在極端非標準條件下都能切割非典型位點。引起星星活性的因素：甘油濃度高(>５％），酶過量（〉100U/ml）,離子強度低（〈2５mmｏl/Ｌ），pH值過高(〉8.０）,或是加了有機溶劑如ＤMSO（二甲基亞砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺,或是用其它2價陽離子如Mn2+、Cu2+、Ｃo2＋或Ｚｎ2+代替了Mg２+。4．T4DNAｌｉgaｓｅ和E。colilｉgaｓe有什么異同?5.連接酶的反應(yīng)溫度如何選擇，為什么？連接酶最適的反應(yīng)溫度應(yīng)是３7℃,但在這一溫度下粘性末端的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定，因此連接反應(yīng)常采用的最佳溫度一般在4—１6℃間，通常多選用12－１6℃30分鐘到1６小時。6。什么是Ｋlenｏw酶？有什么作用？KｌenowDＮＡ聚合酶是從全酶中除去5′―３′外切活性的肽段后的大片段肽段,而聚合活性和３′―５′外切活性不受影響.也稱為Klenow片段(Ｋｌenowfrgmeｎt），或E．coliＤNA聚合酶Ⅰ大片段（E.coｌiDNApoｌymｅraseⅠｌaｒｇefragｍent).它也可以通過基因工程得到,分子量為76kＤa.由于沒有5′―3′外切活性，使用范圍進一步擴大。①補平3′凹端,如果使用帶標記的dNＴＰ，則可對DNA進行末端標記。②抹平DＮA３′凸端在3′―5′外切活性③通過置換反應(yīng)對DNＡ進行末端標記④在cＤＮA克隆中合成第二鏈⑤隨機引物標記⑥在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈DNA···7。如何利用工具酶來研究某一個基因內(nèi)含子的存在？···8.哪些工具酶可以用于探針標記？T４ＤNA聚合酶的替代合成法標記DNA探針。反轉(zhuǎn)錄酶還可利用單鏈DNＡ或RNＡ作模板合成分子探針.第三章分子克隆載體１.基因工程載體應(yīng)具備哪些特點？能在宿主細胞中獨立復(fù)制;有一定的選擇標記,易于識別和篩選；有合適的限制酶位點,可插入一段較大的外源DNA,而不影響其本身的復(fù)制；最好有較高的拷貝數(shù)，便于載體制備。2.作為一個最基本的載體，它必須具備哪些功能元件？能獨立復(fù)制的單鏈或雙鏈ＤＮA;選擇標記基因；合適的限制酶位點。···3.請簡要描述λ噬菌體溶原狀態(tài)和裂解循環(huán)的基因調(diào)控模式及其在構(gòu)建載體中的作用。4.絲狀噬菌體載體克隆中經(jīng)常遇到哪些問題?絲狀噬菌體載體的優(yōu)點ａ．可產(chǎn)生單鏈DNA或雙鏈DNA，分別用于不同的目的單鏈:為絲狀噬菌體，可分泌到細胞外，用于測序或制備探針雙鏈：為含雙鏈RFDNＡ存在于細菌菌落中，可供基因操作，如酶切,重組、提取、轉(zhuǎn)化均應(yīng)為雙鏈DNＡ。具有質(zhì)粒的優(yōu)點ｂ．絲狀噬菌體所能包裝的DNA長度沒有一定的限制,有些噬菌體顆?？砂b比野生型絲狀噬菌體DNA長7倍的DNA。缺點a。較大的外源DＮA片段被克隆以后,在噬菌體擴增過程中往往不穩(wěn)定，很容易發(fā)生缺失的現(xiàn)象，這可能是由于感染較短的噬菌體比長的噬菌體更具競爭優(yōu)勢所致。b．單鏈載體分子感染的細胞中往往單雙鏈混雜，純化某種類型的分子（尤其是雙鏈分子）比較費力,同時由于重組DNA容易產(chǎn)生缺失,培養(yǎng)時間不能長，故所得ＤNＡ的量有限。c.重組中，經(jīng)常出現(xiàn)一些能以兩種可能方向插入的載體卻僅以一種特定方向插入外源DNＡ片段的情況，這是因為外源DＮA反向鏈的序列，在不同程度上干擾了載體基因間區(qū)域的功能所致?？朔叭笔?的辦法ａ.侵染菌應(yīng)避免在液體培養(yǎng)基中連續(xù)繼代培養(yǎng)ｂ.應(yīng)用貯存于-70℃,重組ｐhageＭ１３感染細菌后鋪板，再從噬菌斑中央部分挑取細菌后進行小規(guī)模培養(yǎng)c。培養(yǎng)時間應(yīng)盡可能短（通常4－8h)d。收獲噬菌體的培養(yǎng)液不能再做為原液繼續(xù)培養(yǎng)(因在重組子和野生型噬菌體共培養(yǎng)中，野生型具有選擇優(yōu)勢,幾代培養(yǎng)后可消除重組子)。第四章人工染色體載體1.大容量克隆載體有哪些種類,各有何特點？·····2。簡述利用YAC克隆載體構(gòu)建基因文庫的原理。·····３。簡述黏粒、YＡC、BAC克隆載體、P1噬菌體載體的基本構(gòu)成元件.4.黏粒載體具有哪些優(yōu)缺點?怎樣克服其缺點?黏粒的優(yōu)點（1)同時具有λ噬菌體和質(zhì)粒載體的特性（2)具有高容量的克隆能力柯斯質(zhì)粒的缺點a.兩個粘粒之間，當(dāng)存在同源序列時，可能會發(fā)生重組,結(jié)果使克隆的外源DNA片段重排或丟失。b。含不同重組DＮA的菌落生長速度不一。當(dāng)柯斯質(zhì)粒文庫復(fù)制擴增時，由于不同的插入片段對宿主細胞作用的情況不同,結(jié)果會出現(xiàn)各種外源DＮA片段間的比例失調(diào)。另外不同重組柯斯質(zhì)粒的產(chǎn)量相差懸殊。c。包裝蛋白制備過程較復(fù)雜,每批包裝蛋白的包裝效率不穩(wěn)定。而且，購買包裝蛋白的費用較高.第五章表達載體····1。以大腸桿菌為例，表達載體比克隆載體多了哪些功能元件,各有什么生物學(xué)功能？2。簡述利用Ｔ7噬菌體啟動子的ｐＥT系列表達載體的工作原理?！ぁぁぁ?。何為穿梭載體，在遺傳結(jié)構(gòu)上有何特點？···4。將人的某個基因在大腸桿菌中表達應(yīng)注意哪些問題?···5.分泌表達載體需要哪些基本元件?···6。什么是融合表達?有什么優(yōu)點？第8章PCＲ技術(shù)及其應(yīng)用···１。簡述ＰCＲ擴增的原理和過程？PＣＲ反應(yīng)特點:特異性強靈敏度高簡便、快速對標本的純度要求低PＣR的基本原理是什么？用PCR擴增時,必須預(yù)先得知什么信息？a.DＮA的半保留復(fù)制原理，在體外進行DNA的變性、復(fù)性和引物延伸.ｂ.至少要知道足夠合成一對引物的靶ＤNＡ序列?！み^程：ａ。變性(deｎaturaｔｉon)：將模板DＮＡ置于９２—96℃,使ｄｓＤNA在高溫下解鏈成為ｓｓDNＡ，且熱變性不改變其化學(xué)性質(zhì)；b.退火（ａnnealinｇ）:將溫度降至37—72℃，使引物與模板的互補區(qū)相結(jié)合；c.延伸(extension):在72℃條件下,DNA聚合酶將dNTP連續(xù)加到引物的3‘-ＯH端，合成ＤＮA。這三個熱反應(yīng)過程的重復(fù)稱為一個循環(huán)，經(jīng)過20-40個循環(huán)可擴增得到大量位于兩條引物之間序列的DNＡ片段。PCR引物有哪些基本要求?在多數(shù)試驗中人們習(xí)慣使用的引物濃度為各1μM，即1pmoｌ/μl，在1０0μl反應(yīng)體系中相當(dāng)于6ｘ1013個分子.如果５％用于擴增1ｋb的ＤNA片段，可得到3.3μｇ的產(chǎn)物，足以用于常規(guī)分析。引物設(shè)計要考慮的幾個問題①長度:至少16ｂp，通常為18—30bp,更短的引物一般會降低擴增的特異性，但會提高擴增的有效性。②解鏈溫度（Tm值):兩個引物之間的Tm值差異最好在2-5℃。③避免引物內(nèi)部或引物之間存在互補序列（3個堿基）④Ｇ＋Ｃ含量盡量控制在40％－６０%之間，4種堿基的分布應(yīng)盡可能均勻.盡量避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列,以及Ｔ在3′末端的重復(fù)排列。⑤引物的3′末端最好是G或Ｃ，但不要GC連排?！ＣR技術(shù)產(chǎn)生污染的主要原因和預(yù)防方法？污染原因:1、樣本間交叉污染

2、PCR試劑污染

3、ＰＣR擴增產(chǎn)物污染

4、實驗室中克隆質(zhì)粒的污染

預(yù)防方法：A。防止污染：試劑小量分裝,吸頭及ＥＰ管一次性使用；器皿及工作區(qū)域要分開;無菌操作B、設(shè)立對照:陽性對照

陰性對照

包括:標本對照和試劑對照.···PCR技術(shù)有哪些應(yīng)用？···2．Ｔ/A克隆的基本原理是什么？第九章ＤNA序列分析1.簡述化學(xué)降解法測序的基本原理以及主要應(yīng)用范圍.a。原理：將待測DNA片段的５‘端磷酸基團作放射性標記，再分別采用不同的化學(xué)方法對特定堿基進行化學(xué)修飾并在該位置打斷核酸鏈，從而產(chǎn)生一系列長度不一且分別以不同堿基結(jié)尾的ＤNA片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過并列點樣（laｎe—by-lanｅ）的方式用凝膠電泳進行分離,再經(jīng)放射自顯影,即可讀出目的ＤNA的堿基序列。ｂ。核心原理:特定化學(xué)試劑可對不同堿基進行特異性修飾并在被修飾的堿基處（5′或３′）打斷磷酸二酯鍵，從而達到識別不同堿基種類的目的?；瘜W(xué)降解測序法的基本步驟包括：（１）對待測DNＡ片段的５′端磷酸基團作放射性標記；（2）用化學(xué)修飾劑修飾特定堿基;（3）凝膠電泳分離和放射自顯影顯示出各片段的長度（４）讀序,由于在同一反應(yīng)體系中,各DNA片段的標記端相同、起始位點相同,所以,根據(jù)斷裂部位至標記端起始部位之間的距離(片段長度)，即可得出堿基順序.化學(xué)降解測序法的應(yīng)用Mａxａm—Gｉlbert化學(xué)降解測序法不需要進行酶催化反應(yīng)，因此不會產(chǎn)生由于酶催化反應(yīng)而帶來的誤差；a。對未經(jīng)克隆的DNA片段可以直接測序.b．化學(xué)降解測序法特別適用于測定含有如5-甲基腺嘌呤、Ｇ+Ｃ含量較高的DNＡ片段以及短鏈的寡核苷酸片段的序列。c．測定長度大約250個堿基２。簡述Ｓanｇeｒ雙脫氧鏈終止法測序的原理。雙脫氧核苷酸分子的脫氧核糖的3’位置的—OH缺失，致使下位核苷酸的５'磷酸基團無法與之結(jié)合。一旦雙脫氧核苷酸整合到正在合成的DNA鏈中,該股ＤNA的合成就到此終止.···3.試述化學(xué)降解法和雙脫氧鏈終止法的異同點。第十一章DNＡ文庫的構(gòu)建和目的基因的篩選1?；蚪MDNA文庫有哪些類型？其相關(guān)的特點是什么？⑴質(zhì)粒文庫質(zhì)粒是最早用于構(gòu)建基因組文庫的載體,質(zhì)粒載體所容納的外源ＤNA片段一般在10ｋb以內(nèi)。這類基因組ＤＮA文庫一般應(yīng)用于“鳥槍法"全基因組測序研究和用于構(gòu)建亞克隆文庫或亞基因組文庫。⑵噬菌體文庫噬菌體文庫是以細菌噬菌體基因組衍生的一系列載體系統(tǒng)構(gòu)建的，常用的有l(wèi)噬菌體載體、M1３單鏈噬菌體載體、P１噬菌體載體及由噬菌體衍生的質(zhì)粒載體。M13載體所容納的外源片段較小,一般用于構(gòu)建cＤNA文庫或ＢAC和PAC亞克隆文庫。噬菌體文庫中應(yīng)用最廣泛的是l噬菌體。由于其有利于利用分子雜交的方法進行篩選，用l噬菌體構(gòu)建的基因組DNＡ文庫在小基因組物種的基因克隆中起著重要作用.⑶黏粒文庫黏粒又稱柯斯質(zhì)粒，是由ｌ噬菌體的coｓ序列、質(zhì)粒的復(fù)制序列及抗生素抗性基因構(gòu)建而成的一類特殊的質(zhì)粒載體。黏粒載體和噬菌體載體類似，主要用于構(gòu)建小基因組物種的基因組DNA文庫。利用它們在篩選上的優(yōu)勢來分離單個基因或構(gòu)建一定區(qū)間范圍的亞基因組DNＡ文庫等.⑷人工染色體文庫包括酵母人工染色體文庫、細菌人工染色體文庫和Ｐ1人工染色體文庫,也稱為大片段基因組ＤNA文庫，容納的外源DNA片段為1０0kb-１Mb。主要用于大基因組物種的基因克隆、物理圖譜構(gòu)建和基因組測序等，在基因組研究中應(yīng)用越來越廣泛.⑸亞基因組文庫亞基因組文庫是相對于基因組文庫提出的，文庫的對象不是全基因組范圍，而是基因組的某一區(qū)段，如基因組DNA某一特定大小酶切片段的組合、一條染色體或更小的區(qū)段（如一個YＡC或BAC克隆等）?！ぁぁ?。構(gòu)建大片段基因組文庫過程中需要注意哪些問題?３.均一化cＤNＡ文庫構(gòu)建的基本原理是什么？mRＮA－cDNA雜交方法的原理是用過量的驅(qū)動mRNA與供體的cDNA文庫質(zhì)粒反復(fù)多輪雜交，去除驅(qū)動和供體共同表達的基因,構(gòu)建均一化的、扣除雜交cＤNA文庫.4?？鄢齝DNA的基本原理是什么?扣除雜交技術(shù)（ｓuｂｔracｔｉｖeｈｙbrｉdization)將含目的基因的組織或器官的mRNA群體作為待測樣本(tester），將基因表達譜相似或相近但不含目的基因的組織或器官的mRNA群體作為對照樣本(drｉver）。將teｓter和dｒｉveｒ的ｃDNＡ進行多次雜交，去掉在二者之間都表達的基因，而保留兩者之間差異表達的基因，使低豐度基因在文庫中的比例大大提高，篩選到差異表達的基因的可能性也大大提高?！ぁぁ?。全長cDNA文庫構(gòu)建的原理？６。酵母雙雜交的基本原理?酵母雙雜交系統(tǒng)簡稱雙雜交系統(tǒng)(ｔｗo—hｙbriｄｓｙｓtｅm）,也叫相互作用陷阱(interaｃtiontｒaｐ)，是根據(jù)真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點創(chuàng)建的一種體內(nèi)鑒定基因的方法。其篩選的基因不是探針的直接編碼物，而是能夠與其相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因，即篩選與已知基因的產(chǎn)物發(fā)生相互作用的蛋白的編碼基因.·酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理來自酵母轉(zhuǎn)錄激活因子（ｔranscｒiｐtioｎaｌactiｖator)ＧＡＬ4是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，有兩個功能域:一是ＤNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbｉndingdomａｉn,BD）靠近羧基端,含有幾個鋅指結(jié)構(gòu),可與DNＡ序列中半乳糖苷酶的上游激活序列(ｕpstreａmactivaｔｉngsｅqueｎｃe，ＵAＳ)結(jié)合；二是轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（ａctiｖaｔiｏｎdomａin,AD）,可與RNＡ聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子ＴFＩI相互作用,提高RＮA聚合酶的活性。這兩個結(jié)構(gòu)域的功能是獨立的.酵母雙雜交系統(tǒng)利用融合蛋白的策略,將要篩選的“探針”蛋白X與ＢD融合為BD-X（通常稱為誘餌,baｉt)；將所要篩選的對象Y與ＡD構(gòu)建成融合蛋白的ＡD—YｃDNA文庫（即將目的ｃＤNA與ＡD基因構(gòu)建融合基因文庫),通常稱ＡＤ—Y為獵物(prｅy)；將它們導(dǎo)入酵母細胞中共表達,如果X與Y相互作用，則會導(dǎo)致ＢD和AD在空間上接近形成一個有功能的轉(zhuǎn)錄激活因子，激活下游報告基因的表達.第十三章植物基因工程1．植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)具備的條件？ａ.高效穩(wěn)定的再生能力ｂ。較高的遺傳穩(wěn)定性c．具有穩(wěn)定的外植體來源d。對選擇抗生素敏感e.對農(nóng)桿菌有敏感性f．是否具有經(jīng)濟價值或有潛在的生產(chǎn)應(yīng)用價值２.植物基因工程常用的受體系統(tǒng)有哪些?a.愈傷組織再生系統(tǒng)b。直接分化再生系統(tǒng)c．原生質(zhì)體再生系統(tǒng)ｄ．生殖細胞受體系統(tǒng)3.植物基因轉(zhuǎn)化方法有哪些？a。原生質(zhì)體介導(dǎo)法包括：PEG介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化電激法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化顯微注射介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化激光微束介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化b?；驑尫╟.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法···４.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的基本原理?5．什么是二元載體？和一元載體比有什么優(yōu)點？二元載體(bｉnａryｖectｏｒ)系統(tǒng)是指由兩個分別含Ｔ-DNA和Vir區(qū)的相容性突變質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒系統(tǒng)因為其Ｔ-DＮA與Ｖiｒ基因在兩個獨立的質(zhì)粒上，通過反式激活T-DNA轉(zhuǎn)移，故稱之為反式載體(trａnsveｃtｏr).二元載體較一元載體有更多的優(yōu)點：a.首先，二元載體的構(gòu)建較為方便；而一元載體還需在根癌農(nóng)桿菌中進行共整合，構(gòu)建效率相對較低。ｂ。其次，二元載體的外源基因的轉(zhuǎn)化效率要高于一元載體。所以目前在植物基因工程研究中主要使用二元載體系統(tǒng)。6．植物轉(zhuǎn)化常用的選擇基因和報告基因有哪些？報告基因有什么特點?植物基因工程中的選擇標記基因主要是一類編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因.選擇基因:與外界存在的篩選壓力如抗生素等相互作用,以篩選出被轉(zhuǎn)化的細胞；最常用的有新霉素抗性基因(neor）、慶大霉素抗性基因（gｅntｒ)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT）基因（hpt）,以及膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（ｂaｒ）等。報告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定、常用于判斷外源基因是否成功地導(dǎo)入受體細胞(器官或組織），是否啟動表達的一類特殊用途的基因。提供一種快速測定外源基因是否成功導(dǎo)入的檢測手段，它的應(yīng)用不依賴于外界選擇壓力的存在。理想的報告基因具備的基本要求①報告分子不存在于宿主中或易于與內(nèi)源性基因相區(qū)別;②應(yīng)有一個簡單、快捷、靈敏及經(jīng)濟的分析方法；③報告基因的分析結(jié)果應(yīng)具有很強的線性范圍，便于分析啟動子活性的大小變化;④報告基因的表達必須不改變受體細胞或生物體生理活動.最常用的報告基因β—葡萄糖甘酸酶基因（gus）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cａt(yī)）熒光素酶基因(luc綠色熒光蛋白（GFP）基因(gfp)等。7。轉(zhuǎn)基因植株的鑒定方法有哪些,作為一組完整的轉(zhuǎn)基因植株鑒定數(shù)據(jù)至少應(yīng)包含哪些參數(shù)？a。PCR檢測外源基因的整合b。Southｅrn雜交檢測外源基因的整合c．RT-PCＲ檢測外源基因的表達d．Nortｈern雜交檢測外源基因的表達e.Weｓteｒｎ雜交檢測外源基因表達的產(chǎn)物第十四章動物基因工程···１.簡述反轉(zhuǎn)錄病毒在動物基因工程中的作用。2。試述基因敲除與基因敲入的區(qū)別.3．質(zhì)粒載體與病毒載體有何異同？表達載體:（1)帶有原核復(fù)制區(qū)（2）帶有選擇性標記基因保證重組DNＡ分子能夠在大腸桿菌中擴增(3)必須包括能在真核細胞表達的相關(guān)組件一般包括轉(zhuǎn)錄外源DNＡ序列的啟動子元件、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有效地加上pｏｌｙ（Ａ)尾巴所必需的信號序列、真核細胞中的選擇性標記，以及一些附加元件，如增強子、內(nèi)含子、剪接供體與受體點，以保證外源基因的高效表達.·病毒載體：①攜帶外源基因并能包裝成病毒顆粒;②介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移與表達；③對機體不致病。4。簡述轉(zhuǎn)基因小鼠的制備過程.·DNA顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠·胚胎干細胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠DＮＡ顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠⑴超數(shù)排卵對年輕、健康未孕母鼠（４-5周齡）注射促性腺激素，誘導(dǎo)超數(shù)排卵，與種公鼠合籠交配。從輸卵管的壺腹部收集原核期受精卵,排卵率一般可達30枚以上，但具體排卵多少受激素種類和小鼠品種影響較大.⑵基因準備從整合率上看線形ＤNA分子要好于環(huán)形DNA,而環(huán)形DNA在細胞內(nèi)的半衰期較長，適用于瞬間表達與基因治療。盡管載體ＤＮＡ序列不影響外源DＮA的整合效率,但載體序列能抑制轉(zhuǎn)基因的表達，因此應(yīng)盡量去除轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)中的載體部分。⑶顯微注射（１)外源DNA進入原核(2）培養(yǎng)液中培養(yǎng)（3）進行冷凍保存，或直接用于移植，或繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)育到囊胚后再移植.⑷胚胎移植胚胎：囊胚期或囊胚期之前的胚胎，可依據(jù)早期胚胎的發(fā)育階段和物種的不同決定移植的部位。注射后的單細胞至桑葚期的胚胎應(yīng)移植到0．5ｄ假孕鼠的輸卵管內(nèi)，而達到囊胚期的胚胎則須轉(zhuǎn)移至2。5d假孕鼠子宮內(nèi)。未經(jīng)注射的新鮮胚胎的移植成功率為50%－7０％，注射胚胎移植后的受胎率有所下降，僅為10%—30%。⑸轉(zhuǎn)基因個體鑒定接受胚胎移植的假孕鼠產(chǎn)下的幼鼠是否含有外源基因？（１）分子鑒定，判定其基因組內(nèi)是否整合了外源基因（2）目的蛋白表達與否和表達水平測定(３)產(chǎn)物的分離純化及生物活性檢測2．胚胎干細胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細胞(embrｙonicstemcells，ＥSCs)：從早期胚胎內(nèi)細胞團(ｉnneｒcｅｌlmａss,ＩCM)中分離出的未分化、具有正常二倍體染色體和發(fā)育全能性的細胞。當(dāng)將胚胎干細胞人工注入宿主早期胚胎的囊胚腔內(nèi)(又稱內(nèi)細胞團注射)后,所注入的胚胎干細胞可以同宿主內(nèi)細胞團細胞共同發(fā)育,分化成成體動物的各種組織（包括生殖細胞），形成嵌合體。a.轉(zhuǎn)基因胚胎干細胞的獲得b.囊胚注射c。嵌合體的檢測和育種5.轉(zhuǎn)基因動物的鑒定方法有哪些？a。標記篩選法利用正負篩選標記b．分子鑒定法:PCR擴增、斑點雜交、Soutｈｅrn雜交、熒光原位雜交c．表達水平檢測:報告基因檢測、Northern雜交、RT-ＰＣR、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Western雜交、目的蛋白的生物活性檢測判定是否產(chǎn)生出轉(zhuǎn)基因動物的重要標準是檢查外源基因是否整合到動物的生殖系統(tǒng)中,即是否能夠穩(wěn)定遺傳。第十五章酵母基因工程2。作為一個酵母表達載體,包括那些基本元件？典型的酵母表達載體均為大腸桿菌和酵母菌的穿梭質(zhì)粒?！ぴ瞬糠郑捍竽c桿菌中ori和抗生素抗性序列?！そ湍覆糠郑壕S持復(fù)制的元件,如附加型的２μm質(zhì)粒復(fù)制起點序列,或染色體的自主復(fù)制序列(autｏ—ｒｅplicatiｏnsequｅnce，ARS）,或整合型載體的整合介導(dǎo)區(qū);酵母轉(zhuǎn)化子的篩選組分以及編碼特定蛋白的基因啟動子和終止子序列。·分泌型表達載體還要帶有信號肽序列酵母表達載體主要元件①啟動子最常用的啟動子是基因AＯＸ1的啟動子,在它控制下的外源基因在甲醇誘導(dǎo)時能得到高效表達.PGAP(三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子)：在畢赤酵母中克隆到的一個組成型啟動子，在它控制下的β-LaｃZ基因表達率比甲醇誘導(dǎo)下的以PＡOＸ1啟動的產(chǎn)量更高。PGAP不需要甲醇誘導(dǎo)，發(fā)酵工藝更為簡單，又因其產(chǎn)量很高，所以成為代替ＰAOX1的最具潛力的啟動子。②選擇標記常用HIS4，以及ＡRG4、ＴRＰ1或URＡ3作選擇標記的載體。巴斯德畢赤酵母不能利用蔗糖，所以可用來源于釀酒酵母的蔗糖酶基因SUC2作為選擇標記?？剐赃x擇標記有抗生素G4１８抗性基因和Ｚeｏcｉn抗性基因（一種強誘變劑)。leｕ-作為酵母載體的選擇標記基因③信號肽序列表達外源蛋白分胞內(nèi)表達和分泌表達。畢赤酵母本身基本不分泌內(nèi)源蛋白，所以外源蛋白的分泌需要具有引導(dǎo)分泌的信號序列。如果自身信號肽序列效果不佳,可用α-交配因子引導(dǎo)序列引導(dǎo)外源蛋白的分泌。在巴斯德畢赤酵母載體中還使用過蔗糖酶基因SUC２的信號肽序列、酸性磷酸酶基因PHＯ1的信號肽序列等。···3。敘述附加型表達載體和整合型表達載體用在表達外源基因上的區(qū)別.···4.如何提高基因在染色體上的拷貝數(shù)來提高異源基因的表達量？附什么是藍白斑篩選法?

答:這種方法是根據(jù)組織化學(xué)的原理來篩選重組體.主要是在載體的非必要區(qū)插入一個帶有大腸桿菌β-半乳糖苷酶(ｌaｃ）的基因片段，攜帶有l(wèi)aｃ基因片段的載體轉(zhuǎn)入ｌac-宿主菌后,在含有X-ｇal平板上形成淺藍色的菌落或噬菌斑。外源基因插入ｌaｃ（或ｌａｃ基因部分被取代）后,重組的菌體或噬菌斑將喪失分解的能力，轉(zhuǎn)入lac－宿主菌，在含有Ｘ—gal平板上形成白色的菌落或噬菌斑,非重組的菌落或噬菌斑則為藍色.１。2基因工程的基本操作程序【課標要求】1.簡述基因工程基本操作程序的四個步驟2．嘗試設(shè)計某一轉(zhuǎn)基因生物的研制過程?！颈竟?jié)重難點】重點：基因工程基本操作程序的四個步驟難點：（1）從基因文庫中獲取目的基因(2)利用PCＲ技術(shù)擴增目的基因【學(xué)習(xí)過程】一、基因工程的基本操作程序簡述①目的基因的；②的構(gòu)建;③將目的基因；④目的基因的。二、基因工程的基本操作程序(一)目的基因的獲取1．目的基因:主要是指的基因,也可以是一些具有作用的因子。2.原核細胞和真核細胞的基因結(jié)構(gòu)（１)原核細胞的基因結(jié)構(gòu)（2）真核細胞的基因結(jié)構(gòu)3．目的基因的獲取目的基因可以從中分離出來，也可以用合成。常用的方法有以下幾種：（1）從基因文庫中獲取目的基因①基因組文庫和部分基因文庫（如ｃDＮＡ文庫）基因組文庫cDNA文庫文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子基因中內(nèi)含子基因多少物種間的基因交流②從基因文庫中得到目的基因，可以根據(jù)一些信息，如根據(jù)基因的、基因的、基因在染色體上的、基因的,以及基因的等特性。（2）利用PCR技術(shù)擴增目的基因①PCR是＿__________＿___＿__＿________＿__＿__＿＿＿技術(shù)，是的縮寫。②原理：______＿__＿＿_____＿__＿。,③前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成__＿__＿＿__.④條件:DNＡ模板、。⑤擴增過程：a．變性(℃):目的基因DＮA受熱變性后接連為單鏈b.退火（℃）：與單鏈相應(yīng)互補序列結(jié)合c．延伸（℃):在的作用下進行延伸Taｑ酶的特點是。PCR技術(shù)與DNA復(fù)制的比較：PCＲ技術(shù)ＤNＡ復(fù)制相同點原理原料條件不同點解旋方式場所酶結(jié)果（3)化學(xué)法直接合成適用于基因比較,核苷酸序列又。(二）——基因工程的核心１?；虮磉_載體的構(gòu)建，其目的是使目的基因在受體細胞中能，并且可以,同時，使目的基因能夠.２．基因表達載體＝+++（1）啟動子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的,位于基因的,它是識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)。（2)終止子:也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的，位于基因的，相當(dāng)于一盞紅色信號燈，使在所需要的地方停止下來。(3）標記基因：作用是為了，從而將含有目的基因的細胞出來,如基因。３．構(gòu)建基因表達載體的過程:用（同、不同）種限制酶去切目的基因與運載體，再用使其連接，形成重組DNA分子。(三）將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因受體細胞，并且在受體細胞內(nèi)和的過程，稱為轉(zhuǎn)化.(1）將目的基因?qū)胫参锛毎俎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法②法③法（２)將目的基因?qū)雱游锛毎偌夹g(shù)是將目的基因?qū)胧荏w細胞的最有效方法.②操作程序：將含有目的基因的表達載體→→獲得→顯微注射→胚胎→胚胎→發(fā)育成具有新性狀的動物（3）將目的基因?qū)胛⑸锛毎僭松镒鳛榛蚬こ淌荏w細胞的優(yōu)點：。②大腸桿菌細胞最常用的方法:a.用處理細胞，使細胞處于一種的生理狀態(tài)，這種細胞稱為細胞；b．將分子溶于緩沖液與感受態(tài)細胞混合，在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收ＤNＡ分子.(四)目的基因的檢測與鑒定（1）檢測轉(zhuǎn)基因生物的上是否插入了目的基因檢測方法:技術(shù)，即將轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNＡ提取出來，在含有目的基因的DNＡ片段上用放射性同位素等作標記,以此作為，使探針與基因組ＤNＡ雜交，如果出現(xiàn)，就表明目的基因已插入染色體DNA中。(2）檢測目的基因是否檢測方法:技術(shù)（3）檢測目的基因是否檢測方法:，從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進行檢測，若有出現(xiàn),表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品。(４）進行水平的鑒定【鞏固練習(xí)】1.下列正確表示基因操作“四部曲”的是()Ａ.提取目的基因→目的基因?qū)胧荏w細胞→基因表達載體的構(gòu)建→目的基因的檢測和鑒定B．目的基因的檢測和鑒定→提取目的基因→基因表達載體的構(gòu)建→目的基因?qū)胧荏w細胞C．提取目的基因→基因表達載體的構(gòu)建→目的基因?qū)胧荏w細胞→目的基因的檢測和鑒定D．基因表達載體的構(gòu)建→提取目的基因→目的基因?qū)胧荏w細胞→目的基因的檢測和鑒定２。下列不屬于獲得目的基因的方法的是（）A。利用ＤNＡ連接酶復(fù)制目的基因B．利用DＮＡ聚合酶復(fù)制目的基因C．從基因文庫中獲取目的基因D。利用PCR技術(shù)擴增目的基因3。PCR技術(shù)擴增DNＡ，需要的條件是(）①目的基因②ＡTP③四種脫氧核苷酸④ＤNA聚合酶等⑤mRＮA⑥核糖體A。①②③④B．②③④⑤Ｃ。①③④⑤Ｄ．①②③⑥4.根據(jù)ｍＲNA的信息推出獲取目的基因的方法是（）Ａ．用DNA探針測出目的基因Ｂ．用mＲNA探針測出目的基因C。用mRＮA反轉(zhuǎn)錄形成目的基因D．用PCR技術(shù)擴增mRＮA５。在已知某小片段基因堿基序列的情況下，獲得該基因的最佳方法是(）A．用mRNＡ為模板逆轉(zhuǎn)錄合成ＤＮＡＢ.以4種脫氧核苷酸為原料人工合成Ｃ。由蛋白質(zhì)的氨基酸序列推測mRNAＤ.將供體DNＡ片段轉(zhuǎn)入受體細胞中，再進一步篩選６。下列不屬于目的基因與運載體結(jié)合過程的是（)A.用一定的限制酶切割質(zhì)粒露出黏性末端B．用同種限制酶切割目的基因露出黏性末端C．將切下的目的基因的片段插入到質(zhì)粒切口處D.將重組DNA導(dǎo)入受體細胞中進行擴增7.下列哪項不是基因表達載體的組成成分（)A．啟動子B。終止密碼子C．標記基因Ｄ．復(fù)制原點8。在基因表達載體的構(gòu)建中，所需要的酶是()①限制酶②DNＡ連接酶③解旋酶④DNA聚合酶A.①②B．①②③Ｃ．①②④D．①②③④９.植物學(xué)家在培育抗蟲棉時,對目的基因作適當(dāng)修飾，使目的基因在棉花植株的整個生長發(fā)育期都表達,以防止害蟲侵害,這種對目的基因所作的修飾發(fā)生在(）A.終止子Ｂ.引物C．標記基因Ｄ.啟動子10．下列哪項不是將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎǎ痢；驑尫˙。顯微注射法Ｃ.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法D．花粉管通道法11．在基因工程操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的是（）A．人工合成目的基因B.目的基因與載體結(jié)合C．將目的基因?qū)胧荏w細胞Ｄ。目的基因的檢測與鑒定12．將目的基因?qū)胛⑸锛毎?，要用Cａ2+處理細胞，處理過的細胞叫（）A．感受態(tài)細胞B。敏感性細胞C。吸收性細胞Ｄ．接受細胞13．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)移目的基因進入受體細胞,目的基因的最終位置是（）A．Ｔｉ質(zhì)粒上B．受體細胞染色體上C.裸露細胞核中D。存在細胞質(zhì)中14。目的基因?qū)胧荏w細胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性,只有通過鑒定和檢測才能知道。下列屬于目的基因檢測和鑒定的是(）①檢測受體細胞是否有目的基因

②檢測受體細胞是否有致病基因

③檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄mRＮA

④檢測目的基因是否翻譯蛋白質(zhì)

A．①②③

B．②③④

C．①③④

Ｄ．①②④15.要檢測目的基因是否成功地插入了受體DNA中,需要用基因探針，基因探針是指()A。用于檢測疾病的醫(yī)療器械B．用放射性同位素或熒光分子等標記的ＤNA分子C．合成β－球蛋白的DＮAD．合成苯丙羥化酶的DNA片段16．(多選)用基因工程技術(shù)可使大腸桿菌合成人的蛋白質(zhì)。下列敘述正確的是（）A．常用相同的限制性核酸內(nèi)切酶處理目的基因和質(zhì)粒B．ＤＮA連接酶和RNA聚合酶是構(gòu)建重組質(zhì)粒必須的工具酶C?？捎煤股氐呐囵B(yǎng)基檢測大腸桿菌中是否導(dǎo)入了重組質(zhì)粒D.導(dǎo)入大腸桿菌的目的基因不一定能成功表達17．（多選)我國科學(xué)家運用基因工程技術(shù)將蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因?qū)朊藁毎⒊晒Ρ磉_，培育出了抗蟲棉。下列敘述正確的是(）A.基因非編碼區(qū)對于抗蟲基因在棉花細胞中的表達不可缺少B.重組DＮA分子中增加一個堿基對,可能導(dǎo)致毒蛋白的毒性喪失Ｃ．抗蟲棉的抗蟲基因可通過花粉傳遞至近緣作物，從而造成基因污染D．轉(zhuǎn)基因棉花是否具有抗蟲特性是可以通過檢測棉花對抗生素抗性來確定的18．（多選）科學(xué)家通過基因工程的方法，能使馬鈴薯塊莖內(nèi)含有人奶主要蛋白。以下有關(guān)該基因工程的敘述，正確的是(）A。采用反轉(zhuǎn)錄的方法得到目的基因有內(nèi)含子B．基因非編碼區(qū)對于目的基因在塊莖中表達是不可缺少的C。馬鈴薯的葉肉細胞可作為受體細胞D．用同一種限制性內(nèi)切酶,分別處理質(zhì)粒和含目的基因的DNA,可產(chǎn)生黏性末端而形成重組DNA分子19.資料顯示，近十年來，ＰＣR技術(shù)（DNA聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù))成為分子生物實驗的一種常規(guī)手段,其原理是利用DNA半保留復(fù)制的特性，在試管中進行DＮＡ的人工復(fù)制(如下圖),在很短的時間內(nèi)，將ＤNA擴增幾百萬倍甚至幾十億倍,使分子生物實驗所需的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。請據(jù)圖回答：（1）加熱至9４℃的目的是使DNA樣品中的_______鍵斷裂，該過程在生物體細胞內(nèi)是通過＿_____＿___酶的作用完成的。分析可知新合成DNA分子中A=T，C=G，這說明ＤＮＡ分子的合成遵循___＿________________＿_(2)與細胞內(nèi)DNＡ復(fù)制相比，PCR技術(shù)所需要的ＤNA聚合酶的最適溫度比較_＿＿＿______＿_(高、低)。（3)通過ＰCＲ技術(shù)使DNA分子大量復(fù)制時,若將一個用1５N標記的模板DＮA分子(第一代)放入試管中，以14Ｎ標記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復(fù)制到第五代時,含1５N標記的DNA分子單鏈數(shù)占全部DNA總單鏈數(shù)的比例為。（4）PCR技術(shù)不僅為遺傳病的診斷帶來了便利，而且改進了檢測細菌和病毒的方法.若要檢測一個人是否感染了艾滋病病毒，你認為可以用PＣR擴增血液中的（）A。白細胞DＮAB.病毒蛋白質(zhì)C．血漿抗體D.病毒核酸20.下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，請回答下列問題:（1)一個圖１所示的質(zhì)粒經(jīng)ＳmaⅠ切割前后，分別含有個游離的磷酸基團。（2）若對圖中質(zhì)粒進行改造，插入的SｍaⅠ酶切位點越多，其熱穩(wěn)定性越.（3）用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用SｍaⅠ切割，原因是。（4）與只使用EcoＲI相比較,使用BamＨⅠ和ＨindⅢ兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點在于可以防止。（５）為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入酶。(6)重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是為了。(7）為了從ｃDNA文庫中分離獲取蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因,將重組質(zhì)粒導(dǎo)入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體,然后在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以完成目的基因表達的初步檢測。1．2基因工程的基本操作程序答案ＣAAＣBＤBＡDBＣABCBAＣDＡBCＢCＤ19(1）氫解旋堿基互補配對原則（2）高(３）1／1６（4）D20（１）0、2（2）高（3）SmaⅠ會破壞質(zhì)粒的抗性基因、外源ＤNA中的目的基因（4）質(zhì)粒和含目的基因的外源DＮA片段自身環(huán)化(５）ＤNA連接（6)鑒別和篩選含有目的基因的細胞（7）蔗糖為唯一含碳營養(yǎng)物質(zhì)選修3易考知識點背誦專題1

基因工程基因工程的概念基因工程的別名

基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)操作環(huán)境

生物體外操作對象

基因操作水平

DNＡ分子水平基本過程

剪切→拼接→導(dǎo)入→表達結(jié)果

產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物特點

打破種的界限，定向改造生物本質(zhì)

基因重組(一）基因工程的基本工具1?！胺肿邮中g(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）（1）來源:主要是從原核生物中分離純化出來的。（2）功能：能夠識別雙鏈DNＡ分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有特異性。（3）結(jié)果:經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DＮA片段末端通常有兩種形式：黏性末端和平末端。2．“分子縫合針”——ＤNA連接酶（1)兩種DＮA連接酶(E·coliDNＡ連接酶和Ｔ４－DＮA連接酶)的比較：①相