植物多糖提取液的脫蛋白方法研究

植物多糖提取液的脫蛋白方法研究

糖又名碳?xì)浠衔?，是植物光合作用的初始產(chǎn)物，是最豐富的自然產(chǎn)物。除了作為植物的儲(chǔ)存和加工材料和骨架外，它還可以合成植物的許多成分。多糖在植物體內(nèi)廣泛存在,并且含量較高。20世紀(jì)50年代末對(duì)真菌多糖的抗癌效果的發(fā)現(xiàn)使人們開(kāi)始了多糖系列的化學(xué)研究。日本從20世紀(jì)60年代開(kāi)始研究擔(dān)子菌多糖的藥物活性,并開(kāi)發(fā)了一些有名的藥物;中國(guó)對(duì)多糖的研究始于20世紀(jì)70年代,且發(fā)展很快。到目前為止,人們發(fā)現(xiàn)多糖對(duì)腫瘤、病毒、心血管、抗衰老等方面有獨(dú)特的生物活性[3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15],并且已有300多種多糖類(lèi)化合物從天然產(chǎn)物中被提取出來(lái),其中從中藥中獲得的水溶性多糖最為重要。由于多糖多種多樣的生物活性功能以及在功能食品和臨床上廣泛使用,使多糖生物資源的開(kāi)發(fā)利用和研究日益活躍,成為天然藥物、生物化學(xué)、生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)。在多糖提取液中,蛋白質(zhì)卻占了很大的比例。因此,如何盡量多的去除蛋白質(zhì)而保留多糖的有效成分成為了一個(gè)很有意義的研究課題。但就目前筆者所查的資料中,研究脫蛋白方法及比較各種脫蛋白方法的文獻(xiàn)甚少,且脫蛋白的方法比較單一。因此,筆者旨在以脫蛋白率及多糖損失率為指標(biāo),通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較,優(yōu)化出多糖提取液的脫蛋白方法。1實(shí)驗(yàn)試劑和試劑某種天然植物(重慶生長(zhǎng));葡萄糖(重慶北碚化學(xué)試劑廠生產(chǎn));牛血清白蛋白(中國(guó)醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司生產(chǎn));考馬斯亮蘭G-250(中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn));濃硫酸(重慶無(wú)機(jī)化學(xué)試劑廠生產(chǎn));苯酚(重慶北碚化學(xué)試劑廠生產(chǎn))2方法和結(jié)果2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備2.1.1苯酚分光光度法2.2方法稱(chēng)取干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖10mg,置100mL容量瓶中,加水溶解后稀釋至刻度制成貯備液,分別吸取貯備液0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0mL,加水稀釋至2mL,向各管中加入5%苯酚試劑1mL,混勻。沿管壁加入濃硫酸5mL,靜置5min,振搖,置沸水浴中加熱15min,立即轉(zhuǎn)入冷水浴中冷卻置室溫。以蒸餾水為空白,在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度?；貧w方程為:Y=0.003+0.062X,相關(guān)系數(shù):r=0.995,呈良好的線性關(guān)系。2.1.2線性關(guān)系的測(cè)定稱(chēng)取牛血清白蛋白22mg,置10mL容量瓶中,加水溶解后稀釋至刻度制成貯備液。分別吸取貯備液0.2,0.3,0.4,0.5,0.6mL,加水稀釋至1mL,向各管中加入5mL考馬斯亮蘭G-250溶液,混合均勻后,在30℃下水浴加熱5min,以蒸餾水為空白,在595nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,得回歸方程為:Y=0.129+1.487X,相關(guān)系數(shù):r=0.976,呈良好的線性關(guān)系。2.2濾渣的提取將60g干燥原料在100℃下回流提取3~4h,抽濾后,濾渣在同樣條件下回流提取3~4h,合并兩次所得的濾液即得提取液。將提取液在60℃條件下進(jìn)行減壓濃縮,得濃縮液。2.3在濃縮液中測(cè)定總糖、糖和蛋白質(zhì)含量1總糖和總糖含量的測(cè)定用硫酸-苯酚法測(cè)得濃縮液中總糖含量為2.4mg/mL,多糖含量為2.1mg/mL,多糖占總糖百分率為87.5%。22測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)得濃縮液中蛋白質(zhì)含量為0.284mg/mL。2.4脫離失所2.4.1脫蛋白液的制備取50mL濃縮液,用10%三氯乙酸調(diào)節(jié)其pH值至3,放置過(guò)夜,在3000r/min條件下離心5min,棄去沉淀,得脫蛋白液1。2.4.2脫蛋白液的制備取50mL濃縮液,用2mol/L鹽酸調(diào)節(jié)其pH值至3,放置過(guò)夜,在3000r/min條件下離心5min,棄去沉淀,得脫蛋白液2。2.4.3變性蛋白質(zhì)的提取取50mL濃縮液,將氯仿按濃縮液1/5體積加入,隨之再加入氯仿體積1/5的丁醇、混合物劇烈振搖20min離心,分去水層和溶液層交界處的變性蛋白質(zhì)。將上述方法再重復(fù)4次后,得脫蛋白液3。2.5種方法對(duì)植物多糖提取液多糖含量的影響分別測(cè)定脫蛋白液1,2,3的總糖、多糖和蛋白質(zhì)含量,方法同上,結(jié)果如表1。按下列公式計(jì)算多糖損失率及脫蛋白率,結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1中可以看出,植物多糖提取液通過(guò)3種方法處理后,三氯乙酸法的多糖損失率最低,為6.1%,分別為鹽酸法的40.4%,Sevag法的42.7%;鹽酸法和Sevag法則相差不大;鹽酸脫蛋白率最高,為72.5%,分別為三氯乙酸法的1.57倍,Sevag法的1.73倍,三氯乙酸法和Sevag法則相差不大。3自動(dòng)化方法較少或脫蛋白率較低經(jīng)比較,三氯乙酸法、鹽酸法和Sevag法這3種脫蛋白方法中,鹽酸法具有最好的脫蛋白效果,三氯乙酸法次之,Sevag法效果最差。葉姜瑜、談鋒曾對(duì)紫芝多糖進(jìn)行純化。在除蛋白的過(guò)程中也采用Sevag法和三氯乙酸法,并且結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相同,即三氯乙酸法的脫蛋白率高于Sevag法而多糖損失率較低。而就筆者目前所查的資料中,未曾有對(duì)鹽酸法脫蛋白的報(bào)道。雖然Sevag法脫蛋白的效果較差,但其存在進(jìn)一步的改進(jìn)空間,因?yàn)楸驹囼?yàn)并未采用自動(dòng)化手段,因此可能存在振蕩的劇烈程度不夠等問(wèn)題。若采用機(jī)械攪拌的方法,由于有機(jī)溶劑與水溶液不互溶,會(huì)存在分層現(xiàn)象,引起混合不勻。因此,Sevag法作為一種較難控制的方法,如果要對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的評(píng)價(jià)還需依賴(lài)于適當(dāng)?shù)淖詣?dòng)化方法。此外,隨著Sevag法次數(shù)的增加,脫蛋白率必然增大,因此合理選擇Sevag法脫蛋白次數(shù)還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析。三氯乙酸法和鹽酸法除了都具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)外,還具有各自的優(yōu)