靈芝多糖純化過(guò)程中的去蛋白方法研究

靈芝多糖純化過(guò)程中的去蛋白方法研究

靈芝，又名紅芝、丹芝、紅芝、紫芝和黑芝，是多孔植物科的一個(gè)子實(shí)體。我國(guó)利用靈芝已有上千年的歷史,在很多古代醫(yī)學(xué)典籍中都有對(duì)靈芝性質(zhì)及藥效的記載,如《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》等都極為肯定和詳細(xì)地記載了靈芝的功用?，F(xiàn)代科學(xué)研究證實(shí),靈芝中富含多糖、三帖類物質(zhì)等,它們?cè)陟`芝的功能中發(fā)揮著很重要的作用。近年來(lái),關(guān)于靈芝多糖在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、清除自由基和抗衰老等方面的功效及機(jī)理倍受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,自由基是細(xì)胞衰老的主要誘因,進(jìn)而對(duì)人體的健康造成影響。研究已經(jīng)證實(shí)靈芝多糖作為一種生物活性分子在清除超氧陰離子和羥基自由基方面具有一定的作用。本研究以不同靈芝多糖在體外化學(xué)體系中對(duì)羥基自由基和超氧陰離子的清除率為研究對(duì)象,探索不同來(lái)源靈芝多糖的抗氧化性及多糖濃度與清除羥基自由基和超氧陰離子能力的相關(guān)性,旨在為開(kāi)發(fā)靈芝類系列功能食品提供依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面靈芝子實(shí)體來(lái)源于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所靈芝生產(chǎn)基地;所用試劑均為分析純。1.2方法1.2.1乙醇的提取(1)靈芝子實(shí)體處理。將一定顆粒細(xì)度的適量靈芝粉末放在高體積分?jǐn)?shù)乙醇中浸泡過(guò)夜,待用,以去除部分脂類和色素。用20L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇,醇提后的殘?jiān)糜陉帥鐾L(fēng)處風(fēng)干;(2)子實(shí)體多糖的粗提取。精確稱量經(jīng)干燥的靈芝粉,按料液比1∶30(W/V,g∶mL,下同),提取3h,經(jīng)過(guò)抽濾后,在廢渣中再加入1∶20的溶劑提取2h,合并兩次提取液,真空濃縮至原體積的20%左右。1.2.2測(cè)定茶多酚含量1.2.3變性蛋白質(zhì)提取(1)Sevag法。按三分之一體積加入Sevag試劑(V氯仿∶V正丁醇=4∶1),混合振蕩20min,靜置15min,除去水層與溶劑交界處的變性蛋白質(zhì),重復(fù)多次,直至無(wú)變性蛋白質(zhì)出現(xiàn)為止;(2)HCl法。往濃縮液中加入鹽酸,用pH計(jì)調(diào)濃縮液pH值至3.0,靜置過(guò)夜,3500r/min離心15min,去除底部沉淀。得脫蛋白液。1.2.4gl1,gl2的離心表達(dá)取去蛋白之后的靈芝多糖濃縮液,加入一定量的95%乙醇,使其體積分?jǐn)?shù)為40%,醇沉過(guò)夜,3500r/min離心15min,收集沉淀,冷凍干燥,得到的多糖記為GL1,上清液記為V1;取前次離心上清液V1,加入一定量的95%乙醇,使其體積分?jǐn)?shù)為65%,醇沉過(guò)夜,3500r/min離心15min,收集沉淀,冷凍干燥,得65%醇沉量,得到的多糖記為GL2,上清液記為V2;吸取經(jīng)過(guò)處理的上清液V2,加入一定量的95%乙醇,使最終體積分?jǐn)?shù)為80%,醇沉過(guò)夜,3500r/min離心15min,收集沉淀,冷凍干燥,得到的多糖記為GL3。1.2.5不同濃度感官質(zhì)中鄰苯三酚的清除1)羥基自由基清除率。取1.0mL0.75mol/L鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液于試管中,依次加人2.0mL0.20mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.4)和1.0mL蒸餾水,充分混勻,加入1.0mL新配制的0.75mmol/L硫酸亞鐵溶液(FeSO4),混勻后,再加入1.0mL新配制的0.01%H2O2,于37℃水浴中加熱60min后于510nm處測(cè)其吸光值,所測(cè)得數(shù)據(jù)為損傷管的吸光值A(chǔ)2。未損傷管以1.0mL蒸餾水代替損傷管中1.0mL新配制的0.01%H2O2,操作方法同損傷管,可測(cè)得510nm處未損傷管的吸光值A(chǔ)1。樣品管以1.0mL樣品代替損傷管中的1.0mL蒸餾水,操作方法同損傷管,可測(cè)得510nm樣品管的吸光值A(chǔ)3。計(jì)算清除率,根據(jù)結(jié)果繪制靈芝多糖濃度-清除率曲線。清除率=(A3-A2)/(A1-A2)×100%2)超氧陰離子清除率。取3.0mL50.00mmol/LTris-HCl緩沖溶液(pH=8.2)于試管中,25℃水浴中預(yù)熱20min,取出后立即加入2.0mL不同濃度的待測(cè)樣品和0.4mL5.00mmol/L鄰苯三酚,混勻后25℃水浴保溫4min,立即加入8.00mol/LHCl溶液0.1mL終止反應(yīng),在420nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)樣品,對(duì)照組用蒸餾水2.0mL代替樣品。A空白用0.4mL蒸餾水代替鄰苯三酚,另用3.0mL50.00mmol/LTris-HCl緩沖溶液加2.5mL水調(diào)零。根據(jù)所測(cè)吸光度值,計(jì)算分級(jí)醇沉的靈芝多糖及對(duì)超氧陰離子的清除率。清除率=(A對(duì)照-A樣品)/(A對(duì)照-A空白)×100%2結(jié)果與分析2.1不同失率sevag法多糖損失率及蛋白去除率結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果表明,Sevag法和HCl法都可以去除靈芝多糖提取液中的雜蛋白,但兩種方法去蛋白效果和多糖損失率不同,Sevag法多糖損失率為36.03%、蛋白去除率為82.41%;而HCl法多糖損失率為14.41%、蛋白去除率為41.60%(圖1),Sevag法去蛋白效果優(yōu)于HCl法,但多糖損失較多,從多糖損失率和蛋白去除率兩方面綜合考慮,Sevag法較好一些。Sevag法多糖損失率高和操作次數(shù)多有關(guān)。2.2沉淀多糖的量不同體積分?jǐn)?shù)乙醇分級(jí)醇沉靈芝多糖研究顯示出65%乙醇沉淀出的靈芝多糖(GL2)的量最大,占醇沉多糖總含量的41.95%;其次是40%乙醇的沉淀多糖量(GL1),為41.03%;80%乙醇沉淀多糖的量(GL3)最少,僅為17.02%(圖2)。40%和65%醇沉的多糖占醇沉多糖總含量的82.98%。這種現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)殪`芝多糖濃縮液先經(jīng)40%和65%的乙醇沉淀,然后才是80%乙醇醇沉,導(dǎo)致先醇沉的多糖量偏高,再就是與靈芝多糖的分子量有關(guān),分子量大的多糖先醇沉出來(lái),分子量小的后醇沉出來(lái)。2.3gl2和gl2對(duì)羥基自由基清除能力的比較見(jiàn)表1圖3所示的結(jié)果表明,靈芝多糖清除羥基自由基的能力是隨多糖濃度的升高而增大,反應(yīng)體系中加入0.1mLGL2溶液時(shí)清除率為12.95%,加入0.2mLGL2溶液時(shí)清除率為27.27%,加入0.3mLGL2溶液時(shí)清除率為49.17%,而在加入0.4mLGL2溶液時(shí),清除率達(dá)76.45%,是加入0.1mLGL2溶液時(shí)的6倍。進(jìn)一步分析相同濃度下(每只試管均含1.9mg多糖)反應(yīng)體系中GL1、GL2、GL3對(duì)羥基自由基清除能力的差異。由圖4可知,相同濃度醇沉的多糖清除羥基自由基能力大小順序?yàn)?GL3>GL1>GL2,其中,GL2對(duì)羥基自由基清除率最低,僅為19.17%,GL1對(duì)羥基自由基清除率為21.75%,而GL3對(duì)羥基自由基清除率達(dá)到25.31%,比GL2清除率高了6.14%,比GL1清除率高了3.56%。2.4離子的清除率圖5的結(jié)果表明,靈芝多糖的抗氧化性是跟多糖濃度正相關(guān),多糖濃度越高,抗氧化性越強(qiáng),對(duì)羥基自由基的清除率和超氧陰離子的清除率也更強(qiáng)。進(jìn)一步分析探討GL1、GL2、GL3在相同濃度(即每試管均含2.0mg多糖)的情況下對(duì)超氧陰離子清除能力的差異(圖6)可知,不同多糖在相同濃度下對(duì)超氧陰離子的清除率存在較大差異,GL3對(duì)超氧陰離子的清除率最高,達(dá)到了56.95%,GL1清除率次之,為42.87%,GL2對(duì)超氧陰離子清除率最低,僅為37.21%。3不同濃度gl3和gl2對(duì)活性的影響Sevag法和HCl法是多糖純化過(guò)程中常用的兩種方法,但這兩種去蛋白方法的原理不同,Sevag試劑可以使蛋白質(zhì)變性,進(jìn)而析出,而HCl法利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近溶解度最低的原理,從而使蛋白質(zhì)析出。Sevag法和HCl法都可以去除靈芝多糖提取液中的雜蛋白,但是蛋白去除率和多糖損失率不同,Sevag法比HCl法去蛋白效果要好,但是多糖損失較多,原因與Sevag法去蛋白過(guò)程中洗脫次數(shù)有關(guān)。綜合比較,Sevag法的效果相對(duì)較好。自由基是人體生命過(guò)程中生物化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的中間產(chǎn)物,體內(nèi)自由基過(guò)多或清除緩慢均會(huì)引起分子、細(xì)胞甚至器官損傷,導(dǎo)致病變。結(jié)果表明,靈芝多糖具有直接清除羥基自由基和超氧陰離子的能力,且清除能力與多糖的濃度呈正相關(guān),隨多糖濃度的提高清除率可達(dá)到70%以上。不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀得到的靈芝多糖清除羥基自由基的能力不同,以GL3清除率最高,具體原因需要進(jìn)一步研究。另一方面,GL3在總的靈芝多糖中的含量較低(GL1∶GL2∶GL3=0.41∶0.42∶0.17),因此總體來(lái)看靈芝中可能還是GL1和GL2在靈芝抗氧化中發(fā)揮主要作用。另一方面,本試驗(yàn)只是在化學(xué)體系中測(cè)得,因?yàn)樯矬w的復(fù)雜性,靈芝多