dmap催化制備造影劑dexxxran-dpa-gd

dmap催化制備造影劑dexxxran-dpa-gd

1分子抑制劑的應(yīng)用1973年，美國(guó)科學(xué)家勞倫首次發(fā)表了磁共振成像（mri）技術(shù)。從那時(shí)起，該技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到了迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，磁共振成像（mri）技術(shù)已成為一種非常常見(jiàn)的醫(yī)療設(shè)備，并且越來(lái)越多的人性化和低毒性能的造影劑也被誕生。位于元素周期表64位的稀土元素釓(Gd),有7個(gè)未成對(duì)電子,易形成水溶性順磁絡(luò)合物,是磁共振造影劑常用的金屬離子,如目前上市的釓噴酸葡胺注射液(Magnevist)、釓貝葡胺注射液(Multihance)及釓雙胺注射液(Omniscan)等,它們均為小分子螯合物,臨床應(yīng)用廣泛;然而使用時(shí)需要反復(fù)注射以延長(zhǎng)有效時(shí)間,而且它們易迅速擴(kuò)散到細(xì)胞外或組織間隙,腎臟代謝快,選擇性(靶向性)較低.為了克服以上缺點(diǎn),近十年來(lái),人們開(kāi)始嘗試將小分子螯合劑連接到天然或合成的高分子材料上,如多糖、蛋白質(zhì)、聚氨基酸和聚乙二醇等,以延長(zhǎng)其旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間,增加弛豫效率,并提高其靶向性和穩(wěn)定性.代表性的化合物有阿拉伯半乳聚糖-DTPA-Gd,沙棗膠多糖-DTPA-Gd,PEG-DTPA-Gd,HMD-DTPA-Gd及CHD-DTPA-Gd.以上藥物分子量從五萬(wàn)到三十萬(wàn)不等,均不同程度地表現(xiàn)出對(duì)組織器官如肝臟、腎臟、肺和脾臟等的選擇性,同時(shí)能相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)在血管中保持一定的濃度,有利于血管造影.由此可見(jiàn),具有更強(qiáng)的靶向性、溶解性、安全性及體內(nèi)穩(wěn)定性這些特點(diǎn)將是未來(lái)造影劑的發(fā)展趨勢(shì).靶向淋巴系統(tǒng)造影具有重要的醫(yī)療意義,在臨床實(shí)踐中,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤復(fù)發(fā)和致死的主要原因,靶向淋巴造影技術(shù)可以作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期鑒定手段,對(duì)腫瘤的及時(shí)治療起到了關(guān)鍵作用現(xiàn)階段已實(shí)驗(yàn)于淋巴系統(tǒng)的磁共振造影劑如HSA-DTPA-Gd,脂質(zhì)體包裹的釓布醇等,HSA-DTPA-Gd是通過(guò)賴氨酸上的氨基與DTPA-Gd縮合,但是HAS(人血清白蛋白)分子量過(guò)大不易控制,且難以保存.脂質(zhì)體包裹的釓布醇可顯示三級(jí)連續(xù)淋巴組織,但是由于其穩(wěn)定性較好,體內(nèi)不易代謝.作為順磁性標(biāo)記物的常用大分子載體,右旋糖酐(Dextran)具有較好的生物適應(yīng)性和溶解性,而且其分子粒徑分布范圍窄,可以很好地控制分子的大小.以右旋糖酐為載體,前人也完成了許多工作,Duarte等通過(guò)乙二胺將DTPA與Dextran連接,Rebizak等在合成過(guò)程中活化了Dextran,再用二元胺連接DTPA,并研究了不同長(zhǎng)度的線型二元胺(NH2(CH2)nNH2,2≤n≤6)對(duì)于弛豫度、代謝速率及毒性的影響,以上的合成過(guò)程均較為復(fù)雜;Wang等使用Dextran-DTPA-Gd于小鼠尾部靜脈注射,觀測(cè)小鼠器官如脾臟、肝臟及腎臟的顯影信號(hào),同比DTPA-Gd具有更長(zhǎng)時(shí)間的信號(hào)強(qiáng)度;Yan等用DTPA的活性酯與Dextran合成了Dextran-DTPA-Gd,對(duì)比了不同取代度的Dextran衍生物的弛豫性能,并測(cè)定了對(duì)于海拉細(xì)胞的抑制活性,證明了Dextran-DTPA-Gd對(duì)于動(dòng)物正常淋巴結(jié)及反應(yīng)性增生淋巴結(jié)都具有比DTPA-Gd更高的信號(hào)增強(qiáng)率.為了簡(jiǎn)化Dextran-DTPA-Gd的合成過(guò)程,本實(shí)驗(yàn)采用兩種Dextran-DTPA-Gd的合成方法,通過(guò)改變反應(yīng)條件確定了最佳方案,最終獲得具有較高釓含量和良好水溶性的Dextran-DTPA-Gd造影劑;通過(guò)粒度分析確定Dextran-DTPA-Gd的粒徑范圍;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與釓噴酸葡胺注射液(Magnevist)相比較,該顯影劑可以選擇性的進(jìn)入家兔下肢淋巴管及腘窩淋巴結(jié),且信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)明顯,具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值.2實(shí)驗(yàn)部分2.1材料和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物二乙烯三胺五乙酸酸酐(cDTPAa)根據(jù)文獻(xiàn)合成,1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)(阿拉丁試劑公司),4-二甲氨基吡啶(DMAP)(阿拉丁試劑公司)二乙烯三胺五乙酸(DTPA)(阿拉丁試劑公司),右旋糖酐40(Dextran40,Mw=32000~42000Da,青島首和金海制藥有限公司)均為分析純?cè)噭?其中DMSO使用前經(jīng)過(guò)分子篩干燥處理.釓噴酸葡胺注射液(Magnevist)由拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn).GdCl3溶液(0.347mol/L)由Gd2O3加入濃HCl加熱攪拌至溶液澄清,稀釋定容以備用.英國(guó)Malvern公司的3000HS型電位粒度分析儀用于測(cè)試樣品的分子粒徑分布范圍.7500a型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)(美國(guó)Agilent公司)測(cè)定目標(biāo)產(chǎn)物Dextran-DTPA-Gd中釓含量,紅外圖譜由美國(guó)ThermoNicolet公司的Nexus470型傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用美國(guó)GE公司的超導(dǎo)型核磁共振掃描儀(3.0TSignaHDx)掃描完成動(dòng)物的MR圖.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用健康的成年雌性新西蘭家兔(NewZealandwhiterabbit,2.7~3.7kg).2.2高效液相法dtpa的制備方法一:取右旋糖酐(Dextran)(1.01g,6.2mmol),二乙烯三胺五乙酸酸酐(cDTPAa)(3.00g,8.4mmol),DMAP(0.15g,1.3mmol)于250mL茄形瓶中,注入DMSO(50mL),超聲助溶至溶液呈無(wú)色透明,50℃攪拌反應(yīng)48h.滴入GdCl3溶液(20.6mL,0.35mol/L),室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h,再向反應(yīng)液中加入去離子水(150mL),產(chǎn)生大量淡黃色絮狀物,用NaOH溶液(1.0mol/L)調(diào)節(jié)溶液pH至溶液澄清,使用DM27型透析袋(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)承裝樣品溶液,用去離子水透析3d,期間每天換水4~6次.取透析袋內(nèi)溶液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10mL,以備動(dòng)物實(shí)驗(yàn),并通過(guò)ICP-MS測(cè)定其Gd含量.方法二:將DTPA(0.37g,9.3mmol)溶于25mLDMSO中,加熱超聲約1.5h,待溶液澄清后,再加入DMAP(0.01g,0.1mmol),EDC·HCl(0.20g,1.0mmol),30℃攪拌使其完全溶解,在50℃條件下,將以上反應(yīng)液向溶解右旋糖酐(Dextran)(0.10g,0.6mmol)的DMSO(6mL)中逐滴加入,繼續(xù)攪拌反應(yīng)48h.在冰浴條件下,向以上反應(yīng)液中加入氯仿與乙醚的混合溶液(v/v7:8),直到產(chǎn)生白色絮狀沉淀,并繼續(xù)攪拌2h直至沉淀不再增加,抽濾后用氯仿乙醚混合溶液洗滌濾餅,迅速將濾餅重新溶于20mL蒸餾水,CHCl3洗滌1次.在30℃條件下滴入GdCl3溶液(5mL,0.342mol/L),攪拌反應(yīng)24h,之后轉(zhuǎn)移入DM27型透析袋,用去離子水透析3d,期間每天換水4~6次.取透析袋內(nèi)溶液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10mL,以備動(dòng)物實(shí)驗(yàn),并通過(guò)ICP-MS測(cè)定其Gd含量.2.3d增強(qiáng)掃描將用鹽酸氯銨酮溶液(50mg/kg)麻醉后的新西蘭家兔仰臥位固定,進(jìn)行MRI平掃:3DFastTOF-SPGRCE-MRA序列掃描,FlipAngle30°,TE1.6ms,TR4.5ms,視野280×280mm,矩陣360×224,層厚1.0mm,slah70,NEX2.平掃后于右腳第一、二、三趾蹼處皮內(nèi)分別穿刺注射合成的高分子造影劑Dextran-DTPA-Gd(0.4mL,3.96mmol/L),按摩30s后進(jìn)行3D增強(qiáng)掃描.30min后同樣方法于左腳第一、二、三趾蹼皮內(nèi)穿刺分別注入對(duì)照試劑釓噴酸葡胺注射液(0.4mL,0.50mol/L),按摩30s后行3D增強(qiáng)掃描,以獲得三維圖像.增強(qiáng)掃描從注射后10min開(kāi)始,掃描間隔為10、15、20、25、30、40、50、60min以及24h,掃描序列的相關(guān)參數(shù)與平掃時(shí)一致.3結(jié)果與討論3.1dex-pcr反應(yīng)其他靶向淋巴造影劑的制備工藝制備Dextran-DTPA-Gd的反應(yīng)式如圖1所示,方法一中DTPA脫水形成DTPA酸酐(cDTPAa),再與右旋糖酐在DMAP的作用下縮合,生成右旋糖酐的衍生物后,加入Gd3+形成螯合物;方法二中,用DTPA代替DTPA酸酐(cDTPAa),使用DMAP和EDC·HCl為聯(lián)合縮合劑,與右旋糖酐反應(yīng),生成右旋糖酐衍生物后,再與Gd3+形成螯合物.兩種方法均通過(guò)透析去除過(guò)量的小分子化合物,包括未接合的DTPA、過(guò)量的催化劑以及Gd3+、Cl–等離子,以純化產(chǎn)品.透析結(jié)束后,取透析袋內(nèi)的溶液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,并通過(guò)ICP-MS測(cè)定產(chǎn)物中的Gd%含量,還可根據(jù)此值由公式Gd%=157.25/(162n+550.6)×100%初步計(jì)算出平均每n個(gè)糖單元接入一個(gè)DTPA-Gd.由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,當(dāng)合成的樣品其Gd%過(guò)小(約小于10%)時(shí),淋巴系統(tǒng)顯影信號(hào)強(qiáng)度過(guò)低,不足以分辨.所以理想的產(chǎn)物的Gd%應(yīng)足夠高且水中溶解性良好.通過(guò)不斷改變反應(yīng)條件,得到了不同Gd含量的樣品,如表1所示,當(dāng)Dextran與DTPA的反應(yīng)比例為1:1.5,反應(yīng)溫度和時(shí)間分別為50℃及48h,得到了Gd%含量高達(dá)16.1%的產(chǎn)物,平均每2.6個(gè)糖單元上接有DTPA-Gd.于前人工作相比,如Yan等用DTPA的活性酯與Dextran通過(guò)7d反應(yīng)合成了Dextran-DTPA-Gd,本實(shí)驗(yàn)節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間和成本.以上反應(yīng)在操作過(guò)程中,水分子含量的多少對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響較大,因此需要選用嚴(yán)格干燥的試劑,并且快速處理反應(yīng)的中間產(chǎn)物,防止其吸潮變粘稠.方法一在透析之前,需調(diào)節(jié)溶液pH至溶液澄清,此時(shí)溶液pH與體液pH相同(pH7.4),否則在透析過(guò)程中透析袋內(nèi)易產(chǎn)生白色沉淀,無(wú)法進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn).方法二的操作過(guò)程中,是在水溶液中滴加GdCl3溶液螯合,之后直接透析,始終為澄清溶液,且溶液pH與體液pH相同(pH7.4).在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,方法一所得樣品當(dāng)其Gd%超過(guò)10%時(shí),溶液會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀,調(diào)節(jié)溶液pH始終不退去.由反應(yīng)機(jī)理推論,DMSO與DTPA酸酐這樣的親電試劑組合,可使DMSO轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚燥雏},這種活性锍鹽易氧化右旋糖酐上的部分羥基成醛或酮,DMSO則最終轉(zhuǎn)化為二甲硫醚.由此,右旋糖酐衍生物中不能與水形成氫鍵的羥基一部分被氧化,一部分直接與DTPA形成酯鍵,另一部分又參與同Gd3+的直接吸附作用,其溶解性隨著能與水形成氫鍵的羥基的減少而減少.方法二的操作過(guò)程中使用的是DTPA,不易結(jié)合DMSO使其成為锍鹽,因此該右旋糖酐衍生物上的羥基較前者多,即使樣品中Gd%含量高于方法一所得樣品,依然保持良好的溶解性,溶液始終澄清,且pH適宜(pH7.4),是靶向淋巴造影劑的理想產(chǎn)品.3.2tran-dtpa及dexran-dtpa-3gd的相組成及對(duì)coo–對(duì)稱伸縮系數(shù)的認(rèn)定DTPA酸酐與右旋糖酐的羥基形成酯鍵,然后與過(guò)量Gd3+螯合,形成以高分子多糖為載體的DTPA-Gd配合物.圖2為DTPA(a),Dextran(b),DextranDTPA(c)和Dextran-DTPA-Gd(d)的紅外光譜圖.由圖2可見(jiàn),Dextran-DTPA(c)及Dextran-DTPA-Gd(d)具有Dextran(b)的特征峰,即1020cm–1附近C–OH伸縮振動(dòng)吸收峰,而且由于DTPA與右旋糖酐的羥基形成酯鍵,Dextran-DTPA(c)在1743及1153cm–1處分別出現(xiàn)了C=O及C–O伸縮振動(dòng)吸收峰,DextranDTPA-Gd(d)在1745cm–1及1154cm–1處分別出現(xiàn)了C=O及C–O伸縮振動(dòng)吸收峰.DTPA(a),DextranDTPA(c)及Dextran-DTA-Gd(d)均具有1600及1400cm–1附近的COO–反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰和對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰,且由于Gd3+的配位作用對(duì)COO–的共振產(chǎn)生抑制,Dextran-DTPA-Gd(d)的COO–對(duì)稱伸縮振動(dòng)移到高波數(shù)1415cm–1附近.從以上分析可得出結(jié)論,該高分子配合物已形成.3.3dexran-dtpa-3g的粒徑分布圖3為樣品Dextran-DTPA-Gd分子粒徑分布圖,其分子粒徑平均為130nm,分布范圍為100~150nm.作為載體物質(zhì)的右旋糖酐40,分子量在32000~42000Da,通過(guò)控制共價(jià)結(jié)合的小分子螯合物的比例,可以使其分子量達(dá)到50000Da左右,測(cè)定其粒徑分布正好與毛細(xì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的開(kāi)放裂隙(30~120nm)相符,而遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于毛細(xì)血管孔徑(4~5nm),大部分的高分子物質(zhì)可以通過(guò)開(kāi)放裂隙選擇性地進(jìn)入毛細(xì)淋巴管,并吸收轉(zhuǎn)運(yùn)至淋巴結(jié),再被巨噬細(xì)胞吞噬及降解.由此,該高分子造影劑選擇淋巴系統(tǒng)的趨向性大幅度增強(qiáng).最終形成的Dextran-DTPA-Gd具有粒徑分布范圍窄以及親淋巴性的特性.3.4血管顯微組織使用合成的Dextran-DTPA-Gd(3.96mmol/L)及對(duì)照試劑釓噴酸葡胺注射液(Magnevist)(0.50mol/L)分別注射入同一只家兔的右腳和左腳,注射時(shí)間相隔30min,對(duì)比二者對(duì)腘窩淋巴系統(tǒng)靶向強(qiáng)化效果,結(jié)果如圖4(a)、(b)和(d)所示.在另一只家兔的左右腳同時(shí)注入合成的Dextran-DTPA-Gd(3.96mmol/L),結(jié)果如圖4(c)所示.圖4中,通過(guò)比較圖4(a)家兔左腿(右側(cè))與圖4(b)家兔右腿(左側(cè)),二者均為注射相應(yīng)的造影劑后30min的顯影效果圖,圖4(a)家兔左腿(右側(cè))血管顯影清晰,大量顯影劑進(jìn)入血管并代謝入膀胱,腘窩淋巴結(jié)顯影輕微;圖4(b)家兔右腿(左側(cè))中腘窩淋巴結(jié)及淋巴管顯影清晰,不存在血管顯影.說(shuō)明合成的造影劑Dextran-DTPA-Gd靶向性地進(jìn)入了淋巴系統(tǒng).通過(guò)比較圖4(a)與圖4(c)的家兔雙腿顯影效果可以看出圖4(c)家兔雙側(cè)的腘窩淋巴結(jié)及淋巴管走向,進(jìn)一步證明Dextran-DTPA-Gd具有淋巴系統(tǒng)選擇性,并顯示至第一級(jí)淋巴結(jié)(腘窩淋巴結(jié)),而小分子的對(duì)照試劑釓噴酸葡胺注射液(Magnevist)不僅進(jìn)入淋巴系統(tǒng),而且在血管中持續(xù)存在.最后通過(guò)圖4(d)表明,注射后經(jīng)過(guò)24h,家兔雙腿的淋巴系統(tǒng)及血管顯影均完全消失,雙側(cè)趾蹼間顯影也已消失.說(shuō)明釓噴酸葡胺注射液(Magnevist)及合成的Dextran-DTPA-Gd在24h內(nèi)均代謝完全.綜上所述,相比于釓噴酸葡胺注射液,高分子物質(zhì)Dextran-DTPA-Gd不易入血管,其體內(nèi)代謝方式還有待進(jìn)一步研究.通過(guò)不同時(shí)間段內(nèi)測(cè)算淋巴信號(hào)強(qiáng)度率評(píng)價(jià)顯影效果,結(jié)果如圖5所示.采用興趣區(qū)法測(cè)量樣品經(jīng)皮下注射后,增強(qiáng)前后不同序列圖像上雙側(cè)腘窩淋巴結(jié)的信號(hào)強(qiáng)度(SignalIntensityofLymphNode,SI)和系統(tǒng)噪聲(N).計(jì)算淋巴結(jié)的信噪比(SNR)及信號(hào)強(qiáng)度率(EnhancingRate,E%),公式為:SNR=SI/N,E%=(SNRpost-SNRpre)/SNRpre×100%上述公式中SNRpre、SNRpost分別代表平掃和增強(qiáng)掃描時(shí)腘窩淋巴結(jié)的信噪比