復(fù)合膜管法提取米粉草多糖工藝研究

復(fù)合膜管法提取米粉草多糖工藝研究

杏仁草又名仙草、仙草、縣域凍、工資草，是唇科一年生草本植物。目前中國有3種,分別為M.chinensisBenth,M.paruifsota(Benth)Brea,M.procumbensHemsl,分布于我國的廣東、福建、廣西、江西、海南、浙江、臺(tái)灣和云南等地。其他國家如印度、印度尼西亞、馬來西亞也有分布。涼粉草多糖(MesonaBlumePolysaccharide,MBP)是涼粉草中含有的一種具有凝膠性的多糖。將涼粉草用水煎熬數(shù)小時(shí),過濾,取它們的膠質(zhì),加入適量的淀粉再煮熟,待冷卻之后,則結(jié)成黑褐色半透明的糕狀,這就是人們俗稱的涼粉,深受廣東、廣西、福建、臺(tái)灣等地區(qū)人們的喜愛。有研究表明:MBP具有顯著的抗脂質(zhì)過氧化作用,同VE和BHT相比,MBP清除超氧陰離子自由基和螯合Fe2+的能力都要好些,而清除DPPH自由基和還原力都要差些。試驗(yàn)通過單因素和正交試驗(yàn)確定MBP的最佳提取工藝,并利用H2O2對(duì)MBP溶液的脫色工藝進(jìn)行初步研究,在此基礎(chǔ)上,選擇中空纖維膜組件進(jìn)行超濾純化,以確定截留分子量最適合MBP純化的中空纖維膜管。1材料和方法1.1碳酸鈉的合成涼粉草:福建省武平縣下壩鄉(xiāng)種植基地,食用級(jí);無水碳酸鈉:山海虹光化工廠,化學(xué)純;30%H2O2、無水乙醇、苯酚、硫酸、無水葡萄糖、酒石酸鉀鈉和3,5-二硝基水楊酸:國藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純。1.2精密檢測(cè)儀器HHS型電熱恒溫水浴鍋:上海醫(yī)療器械五廠;AnkeTDL-5型離心分離機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;722S型可見分光光度計(jì)、UV757型紫外可見分光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司;LGS-4型真空冷凍干燥機(jī):江蘇海門輕工機(jī)械四廠;10K、50K型中空纖維超濾膜管及簡(jiǎn)易型超濾裝置:華東理工大學(xué)膜工程研究所;Waters600高效凝膠色譜儀:美國Waters公司。1.3制備兩組制備工藝原料預(yù)處理(干燥、粉碎)→加入Na2CO3溶液→95℃水浴提取MBP→冷卻→紗布過濾去除涼粉草渣→濾液中加入H2O2脫色(50℃)→冷卻→超濾→乙醇沉淀→離心分離→取其沉淀凍干→成品。1.4杏仁草糖提取條件的優(yōu)化1.4.1料液比對(duì)碳酸鈉水浴鍋中水浴時(shí)間的影響分別配制濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的碳酸鈉溶液。其他兩個(gè)因素定為:料液比=10/250(M/V);在95℃水浴鍋中水浴時(shí)間為1h?？疾焯妓徕c溶液因素對(duì)多糖提取率的影響。1.4.2浴時(shí)間的確定由1.4.1確定碳酸鈉溶液濃度為1.5%,水浴時(shí)間仍暫定為1h。分別選擇5∶250,10∶250,15∶250,20∶250,25∶250(M/V)考察其對(duì)多糖提取率的影響。1.4.3料液比和料液配比由1.4.1和1.4.2確定碳酸鈉溶液濃度為1.5%,料液比為10/250(M/V)。水浴時(shí)間分別取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h考察其對(duì)多糖提取率的影響。1.4.4正交試驗(yàn)由1.4.1、1.4.2和1.4.3確定的最佳單因素條件,選擇三因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn),對(duì)正交試驗(yàn)確定的最佳條件再進(jìn)行驗(yàn)證。1.5杏仁草茶多酚的脫屑處理1.5.1%雙氧水對(duì)糯米粉草多糖脫色率和多糖損失率的影響雙氧水濃度先初定為15%,涼粉草多糖溶液置于50℃左右的水浴鍋中慢慢加入分別為0、10、20、30、40mL的15%雙氧水(30%的雙氧水會(huì)導(dǎo)致加熱反應(yīng)過程中產(chǎn)生大量的氣泡從而致使涼粉草多糖有效成分的損失增大),待到反應(yīng)完全,即料液中再無氣體產(chǎn)生,即可對(duì)其進(jìn)行脫色率和多糖損失率的計(jì)算。1.5.2加入雙氧水、無雙氧水、無雙氧水液由1.5.1確定雙氧水的加入量為20mL,然后在五份相同體積的料液中加入0%、5%、10%、15%、20%的雙氧水進(jìn)行脫色處理,其他操作步驟與注意事項(xiàng)同“1.5.1”。1.6中空纖維膜的超濾操作將經(jīng)過脫色處理的多糖溶液(共約1600mL)分成兩分,分別在截留分子量為10K和50K的中空纖維膜管下進(jìn)行超濾操作。儀器通電穩(wěn)定5min后在壓強(qiáng)為0.1MPa的條件下超濾2h左右,取截流液部分進(jìn)行多糖含量、多糖分子量分布以及單糖組成的測(cè)定。1.7測(cè)量1.7.1計(jì)算差分提取率的性能式中:m1—經(jīng)過恒溫干燥恒重的小燒杯和粗多糖的總質(zhì)量,g;m2—經(jīng)過恒溫干燥恒重的小燒杯的質(zhì)量,g;m3—稱取涼粉草原料的質(zhì)量,g。1.7.2多酚測(cè)定多糖含量=總糖含量-還原糖含量?？偺呛?苯酚-硫酸法;還原糖含量:3,5-二硝基水楊酸法。1.7.3吸光值a的測(cè)定干燥所得到的固體MBP復(fù)水使其濃度為0.01g/mL,再在420nm對(duì)0.01g/mL的MBP溶液進(jìn)行吸光值A(chǔ)的測(cè)定,所選比色皿長(zhǎng)度為光程長(zhǎng),則該MBP溶液的ICUMSA色值可由如下公式計(jì)算:IU=[A420/比色皿長(zhǎng)度×糖液濃度(g/mL)]×1000(2)脫色率計(jì)算公式如下:式中:IU——經(jīng)過脫色處理的多糖溶液的色值;IU0——未經(jīng)過脫色處理的多糖溶液的色值。1.7.4脫屑后多孔損失率的計(jì)算式中:m0——未經(jīng)脫色處理的多糖量;m1——經(jīng)脫色處理的多糖量。1.7.5流動(dòng)相、柱溫、折光器采用Waters600高效凝膠過濾色譜(HPGPC)測(cè)定MBP的相對(duì)分子量。具體操作條件為:色譜柱Ultrahydrogel?Linear300mm×7.8mmid×2;流動(dòng)相:0.1mol/Lsodiumnitrate;流速:0.9mL/min;柱溫:45℃;檢測(cè)器:2410差式折光檢測(cè)器。分別選用DextranT-2000(Mw2000000),DextranT-190(Mw188000),DextranT-10(Mw10000),DextranT-3(Mw2800),DextranT-0.3(Mw280)(PharmacosmosCo.Ltd.,Denmark)作為標(biāo)準(zhǔn)分子量。1.7.6高效液相色譜法分別稱取經(jīng)截留分子量10K與50K的中空纖維素膜超濾的MBP23mg和24.6mg,加4mL2mol/L的三氟乙酸于121℃,0.1MPa下水解1h,將水解液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后,加入10mL色譜純的甲醇溶解,最后將此甲醇溶液置于真空度為0.1MPa,40℃的真空干燥箱內(nèi)蒸干。取此干樣再加5mL色譜級(jí)甲醇溶解,取100μL加100μL還原胺化試劑(0.7g對(duì)氨基苯甲酸+0.1gNaCNCH3+1mLHAc),在70℃反應(yīng)30min,冷卻稀釋至1mL。最后加甲醇定容到10mL。色譜條件:柱溫30℃,流速0.8mL/min,色譜柱為AtlantisC18,柱長(zhǎng)4.6×250mm,檢測(cè)波長(zhǎng)203nm,進(jìn)樣量5μL。洗脫條件:流動(dòng)相緩沖液為0.05mol/L,流動(dòng)相采用50mmol/L四丁基硫酸氫胺溶液(A)和50%的四丁基硫酸氫胺甲醇溶液(B)在不同時(shí)間按不同體積混合后梯度洗脫,梯度條件為:0min,A/B=95/5;40min,A/B=90/10;45min,A/B=80/20;49min,A/B=50/50;60min,A/B=95/5。選取的標(biāo)準(zhǔn)單糖及其質(zhì)量濃度分別為:D-Man(4.077mg/mL),D-Gal(4.052mg/mL),D-Glc(4.096mg/mL),D-Xyl(4.041mg/mL),D-Rha(3.991mg/mL),D-Rib(3.723mg/mL),Ara(1.004mg/mL)Fuc(1.005mg/mL),GlcA(1.975mg/mL),GalA(3.935mg/mL)。2結(jié)果與分析2.1料液比對(duì)糯米粉草多糖提取率的影響在料液比為10/250(M/V),95℃水浴時(shí)間為1h的條件下,Na2CO3溶液濃度分別為0.5,1.0,1.5,2.0和2.5%(M/V)時(shí),測(cè)定出MBP的提取率分別為16.30,24.10,31.30,30.10和28.00%,由此可得Na2CO3最佳提取濃度為1.5%。在Na2CO3溶液濃度為1.5%,95℃水浴時(shí)間為1h的條件下,料液比分別為5∶250,10∶250,15∶250,20∶250,25∶250(M/V)時(shí),測(cè)定出MBP的提取率分別為43.00,52.90,38.73,35.30和12.12%,由此可得最佳料液比為10/250(M/V)。在Na2CO3溶液濃度為1.5%,料液比為10/250(M/V)的條件下,95℃水浴時(shí)間分別取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h時(shí),測(cè)定出MBP的提取率分別為35.60,42.30,40.80,28.80和27.30%,由此可得最佳水浴時(shí)間為1.5h。由上所選定的單因素提取條件,進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn),所得正交試驗(yàn)結(jié)果如表1和表2所示。由表1可得RB>RA>RC>RD的結(jié)論,這說明料液比對(duì)于涼粉草多糖提取率的影響最大,Na2CO3%次之,水浴時(shí)間的影響為最小。由表2可得,Na2CO3%和料液比對(duì)多糖提取率的影響具有顯著性,而水浴時(shí)間沒有顯著性影響。同時(shí)由各因素中K的最大值可以得出最佳因素組合為A2B2C2,在此條件下測(cè)定出MBP的提取率為39.80%(m/m),低于表1中的最佳因素組合A2B1C2條件下的提取率40.78%(M/M),所以最終確定MBP的最佳提取條件為1.5%碳酸鈉溶液,9/250(M/V)的料液比,95℃水浴1.5h。2.23m-p的分辨率確定2.2.1脫色率的變化按“1.5.1”的方法可得脫色結(jié)果如表3所示。從表3看出,隨著H2O2加入量增大色值越來越小,其脫色率越來越大,加入量為30mL時(shí)脫色率升至17.89%。雖然脫色效果明顯,但是引起的多糖損失率高達(dá)16.83%(M/M),因此30mL的加入量不適合本工藝要求。最終確定H2O2加入量為20mL,此時(shí)多糖溶液呈淺黃褐色,其色值為201000,脫色率為4.88%,多糖損失率為11.46%(M/M)。2.2.2雙氧水配比對(duì)多糖損失率的影響按“1.5.2”的方法可得脫色結(jié)果如表3所示。如表3所示,隨H2O2百分比濃度的增大其脫色效果越來越顯著。多糖損失率的增大則說明H2O2濃度越高多糖損失越大。綜合考慮當(dāng)雙氧水百分比濃度為10%時(shí)比較適合工藝要求,此時(shí)的多糖損失率為26.16%(m/m)、IU值為186000、脫色率為5.87%。因此,100mL的料液中加入10%的雙氧水20mL時(shí)脫色效果達(dá)到工藝要求。2.3超濾純度mp按1.6的方法,可得截留液組分1(10K膜管)和截留液組分2(50K膜管)。2.4超濾后，膜合物組的分析結(jié)果2.4.1超濾純化使溶液損失部分多糖從表4來看,超濾前溶液的多糖含量大于超濾后截留液中的多糖含量,這說明超濾純化使溶液損失部分多糖。截留液組分1的多糖含量大于組分2的,這說明MBP溶液在經(jīng)過超濾純化后,截留液組分1中多糖保留率比組分2中大,即10K中空纖維膜管的超濾純化效果要更適合工藝要求。2.4.2截留液中多糖的保留率操作條件參照”1.7.5”中MBP溶液分子量分布測(cè)定,DextranT系列作為標(biāo)準(zhǔn)分子量。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:LogMolWt=13.3-0.504t,R2=0.9977,其中:MoWt為DextranT標(biāo)準(zhǔn)品的分子量,t為保留時(shí)間。截留液組分1和2的分子量分布相應(yīng)數(shù)據(jù)如表5所示。從表5可以分析,截留液組分1中多糖(Mw=77040的保留率為6.64%(M/M),截留液組分2中多糖(Mw=57571)的保留率為3.06%(M/M),說明10K膜管在對(duì)MBP溶液進(jìn)行超濾后保留多糖組分高。在分離純化中就試驗(yàn)中所提供的兩種膜管型號(hào)來講應(yīng)選擇此種型號(hào)膜組件進(jìn)行純化比較合適。至于截留液中仍有大量低于10K或50K的分子量的組分存在,其原因可能與超濾過程不充分有關(guān)。在后續(xù)研究中,應(yīng)對(duì)超濾過程進(jìn)行進(jìn)一步地優(yōu)化研究或者增加超濾循環(huán)的工作時(shí)間或次數(shù)使溶液超濾充分至穩(wěn)定。2.4.3膜組件中g(shù)ala含量的分析按”1.7.6”中單糖組成的測(cè)定方法,分別得標(biāo)準(zhǔn)單糖、截留液組分1和2的相應(yīng)數(shù)據(jù)如表6所示。在涼粉草多糖分子中,半乳糖醛酸(GalA)是其特有組成單糖,因此GalA的含量是代表MBP含量的一個(gè)重要指標(biāo)。綜合分析表7后發(fā)現(xiàn),截留液組分1中GalA的摩爾百分含量為15.17%,截留液組分2中GalA的摩爾百分含量?jī)H為15.07%,由此可見10K膜管超濾處理的多糖溶液中保留的MBP含量多,應(yīng)選擇該型號(hào)膜組件對(duì)涼粉草多糖溶液進(jìn)行超濾。綜合3.4.1,3.4.2和3.4.3可知,選擇截留分子量為10K的中空纖維膜管對(duì)脫色處理的MBP溶液進(jìn)行超濾比較合適,下一步應(yīng)專門對(duì)其超濾試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。3料液中多糖含量對(duì)脫糖率的影響經(jīng)過單因素及正交試驗(yàn)得到MBP的最佳提取條件為:1.5%碳酸鈉溶液提取液,9/250(M/V)的料液比,95℃水浴1.5h,在此條件下,測(cè)得涼粉草多糖的提取率