祛瘀解毒消湯對(duì)em模型大鼠腹腔液il-6、il-8的影響

祛瘀解毒消湯對(duì)em模型大鼠腹腔液il-6、il-8的影響

子宮內(nèi)膜綜合征（pmt）不僅是一種常見(jiàn)的婦科疾病，也是一種難治性疾病。因此，近年來(lái)已成為婦科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),腹腔微環(huán)境中巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子,而EMT患者腹腔液中許多細(xì)胞因子的水平高于正常婦女,提示細(xì)胞因子參與改變腹腔環(huán)境的免疫動(dòng)態(tài)平衡,在EMT的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本研究旨在觀察祛瘀解毒消癥湯對(duì)EMT模型大鼠腹腔液中細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)水平的影響,為臨床以祛瘀通絡(luò)、解毒化濁、消癥止痛為法組成的中藥復(fù)方制劑治療本病的有效性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。選取SPF級(jí)9周齡的健康性成熟未交配SD大鼠60只,體重180±20ɡ/只,動(dòng)物合格證:SCXK(陜)2007-001號(hào),由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境:室溫25±5℃,濕度55±5%,空氣清新,通風(fēng)良好,自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料、自來(lái)水。祛瘀解毒消癥湯:由陜西中醫(yī)學(xué)院制劑室,將中藥煎煮濃縮成含生藥2.0g/mL的湯劑。丹莪婦康煎膏:由昆明滇虹藥業(yè)有限公司生產(chǎn)提供,批號(hào):091208,以1%的甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶解成含生藥0.2g/mL的溶液。IL-6、IL-8酶免試劑盒:購(gòu)自西安永屹生物技術(shù)有限公司。10%水合氯醛250g/瓶:西安楊森制藥廠生產(chǎn),批號(hào):0911635。0.9%氯化鈉500mL/瓶:西安康華制藥廠生產(chǎn),批號(hào):0912089。75%酒精500mL/瓶:西安康華制藥廠生產(chǎn),批號(hào):1001920。注射用青霉素鈉80萬(wàn)單位/支:哈藥集團(tuán)制藥總廠,批號(hào):A090801910。苯甲酸雌二醇注射液:2mg/mL,由上海通用藥業(yè)股份有限公司提供,批號(hào):100103。根據(jù)施氏法以每千克體重折算系數(shù)計(jì)算出給藥劑量,配備好的試驗(yàn)組及對(duì)照組藥物均置冰箱4℃?zhèn)溆?。電子分析天平、全自?dòng)酶標(biāo)儀由上海恒平科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9075)由上海一恒科技有限公司生產(chǎn);高速旋轉(zhuǎn)離心機(jī)由北京東訊天地儀器有限公司生產(chǎn);快速混勻器(sk-1型)由常州國(guó)華電器有限公司生產(chǎn);手提式壓力蒸汽消毒器(YX-280B型)由江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn);NR-B17CC型冰箱由日本松下公司生產(chǎn)。EMT模型制備:采用經(jīng)典的造模法。建模成功的標(biāo)志為異位病灶呈米粒大小之結(jié)節(jié),切面可見(jiàn)線形閉合水孔,異位內(nèi)膜組織均形成囊狀,囊內(nèi)為無(wú)色透明液體,有的囊形成多個(gè)串珠狀,周圍可見(jiàn)豐富血管形。在造模成功的大鼠中隨機(jī)選出40只,隨機(jī)分為5組,加空白組共6組,具體分組情況如下:A組為空白組,B組為模型組,C組為丹莪婦康煎膏組,D組為祛瘀解毒消癥湯低劑量組,E組為祛瘀解毒消癥湯中劑量組,F組為祛瘀解毒消癥湯高劑量組。每日清晨對(duì)大鼠稱重后,采取同一時(shí)間灌胃給藥,具體給藥方法如下。A組:生理鹽水灌胃,10mL/kg·d,連續(xù)28d;B組:生理鹽水灌胃,10mL/kg·d,連續(xù)28d;C組:丹莪婦康煎膏溶液,2g/kg·d,連續(xù)28d;D組:祛瘀解毒消癥湯10g/kg·d,連續(xù)28d;E組:祛瘀解毒消癥湯20g/kg·d,連續(xù)28d;F組:祛瘀解毒消癥湯40g/kg·d,連續(xù)28d。肉眼觀察模型組及藥物干預(yù)后各組大鼠異位內(nèi)膜液體積聚、血管形成及與盆腔腹膜、大網(wǎng)膜粘連等情況。末次給藥后,禁食不禁水12h,10%水合氯醛腹腔麻醉后,注入生理鹽水5mL/只,取腹腔液2mL,2000rpm,10min離心,取上清液-20℃凍存。用酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA法)檢測(cè)腹腔液IL-6、IL-8含量,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)所示方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。各組數(shù)據(jù)均用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)”表示,采用t檢驗(yàn),P﹥0.05表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05表示有顯著性差異,P<0.01表示有非常顯著性差異。種植在腹壁上的子宮內(nèi)膜呈透明的囊泡形狀,可見(jiàn)液體積聚,與盆腔腹膜、大網(wǎng)膜廣泛粘連,異位內(nèi)膜表面有血管形成。祛瘀解毒消癥湯低劑量組:囊泡樣的異位內(nèi)膜較模型組有所縮小,與周圍組織粘連明顯,囊內(nèi)可見(jiàn)液體積聚。祛瘀解毒消癥湯中劑量組:異位內(nèi)膜囊泡縮小的程度較低劑量組明顯,與周圍組織粘連較低劑量組減輕,但囊內(nèi)仍有少量的無(wú)色透明液體。祛瘀解毒消癥湯高劑量組:異位內(nèi)膜囊泡較模型組明顯縮小,甚至消失,僅呈痕跡,個(gè)別異位內(nèi)膜與周圍組織有少量粘連,囊內(nèi)未見(jiàn)液體。丹莪婦康煎膏組:異位內(nèi)膜縮小的程度與祛瘀解毒消癥湯中劑量組大體相似,但與周圍組織粘連較為明顯。2.2氧合物對(duì)氧漂消湯高劑量對(duì)丹不同婦康側(cè)膏的影響由上表可見(jiàn),空白組大鼠腹腔液中IL-6含量的低表達(dá),與模型組比較有非常顯著性差異(P<0.01);祛瘀解毒消癥湯高劑量組與模型組比較有非常顯著性差異(P<0.01);祛瘀解毒消癥湯低、中劑量組及丹莪婦康煎膏組,與模型組比較均有顯著性差異(P<0.05);祛瘀解毒消癥湯各劑量組與丹莪婦康煎膏組比較均無(wú)顯著性差異(P﹥0.05)。2.3emt的細(xì)胞因子及免疫反應(yīng)由上表可見(jiàn),空白組腹腔液中IL-8水平的低表達(dá),與模型組比較有非常顯著性差異(P<0.01);祛瘀解毒消癥湯各劑量組及丹莪婦康煎膏組IL-8均低表達(dá),與模型組比較均有非常顯著性差異(P<0.01);祛瘀解毒消癥湯各劑量組與丹莪婦康煎膏組比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠建立EMT模型,予中藥?kù)铕鼋舛鞠Y湯干預(yù)后,用肉眼大致觀察到各試驗(yàn)組大鼠異位內(nèi)膜體積較模型組明顯縮小,與周圍組織粘連的程度有所減輕。初步顯示祛瘀解毒消癥湯有抑制異位內(nèi)膜生長(zhǎng)和炎癥反應(yīng)、阻止新生血管的作用。自從1860年VonRokitansky等首先描述EMT至今,其確切的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全明了,但普遍認(rèn)為是遺傳、免疫、內(nèi)分泌等多種因素綜合作用的結(jié)果。而免疫因素在EMT的發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)理,則是目前最為引人注目的研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外研究已經(jīng)證實(shí),細(xì)胞因子參與改變腹腔環(huán)境的免疫動(dòng)態(tài)平衡,在本病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。細(xì)胞因子種類繁多,而許多研究表明,由單核和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1、IL-2、IL-6、IL-8均屬于促炎細(xì)胞因子,參與細(xì)胞免疫反應(yīng)。近年研究發(fā)現(xiàn),IL-6、IL-8與EMT關(guān)系尤為密切。IL-6是一種糖蛋白,其作為一種最常見(jiàn)的前炎癥介質(zhì),具有非常廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。腹腔液中IL-6含量的增多,使得腹腔液中巨噬細(xì)胞和炎癥細(xì)胞被介導(dǎo)吸引活化,從而發(fā)生炎癥及免疫反應(yīng),導(dǎo)致盆腔粘連及免疫異常,加速了EMT的形成和發(fā)展。此外,高水平的IL-6還能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞終末分化為漿細(xì)胞,血中IgG、IgM增高,相應(yīng)在體內(nèi)產(chǎn)生多種自身抗體,發(fā)生抗原抗體反應(yīng),各種免疫復(fù)合物隨即產(chǎn)生,造成患者機(jī)體免疫的損害。本研究顯示,EMT模型大鼠腹腔液中細(xì)胞因子IL-6水平明顯高于空白組,證明細(xì)胞因子IL-6確實(shí)參與了子宮內(nèi)膜異位病灶的種植和生長(zhǎng),并且可能與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。而祛瘀解毒消癥湯干預(yù)后使IL-6水平降低,說(shuō)明該方能調(diào)節(jié)和改善EM異常免疫狀態(tài)、抑制滲出、粘附、增生等炎癥反應(yīng),從而抑制了模型大鼠異位內(nèi)膜的病理發(fā)展。IL-8是一種低分子蛋白質(zhì),來(lái)源于活化的T淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等多種細(xì)胞,具有趨化中性、嗜酸性、嗜堿性粒細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞的作用。已有研究表明,IL-8在EMT病人的腹腔液和外周血中濃度明顯高于正常婦女;IL-8通過(guò)趨化炎性細(xì)胞聚集以及促使新生血管的形成,對(duì)盆腔內(nèi)炎癥、粘連產(chǎn)生及異位病灶中新生血管的生成等均有重要作用。本研究顯示,EMT模型大鼠腹腔中IL-8含量明顯高于空白組,再次證明細(xì)胞因子IL-8促進(jìn)了子宮內(nèi)膜異位病灶的種植和生長(zhǎng),而用祛瘀解毒消癥湯干預(yù)后IL-8水平明顯降低,說(shuō)明該方通過(guò)免疫調(diào)節(jié),抑制了炎性細(xì)胞的聚集和新生血管的形成,從而阻止了模型大鼠異位內(nèi)膜的形成、發(fā)展。結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)EMT發(fā)病的基本認(rèn)識(shí),中醫(yī)認(rèn)為本病源于“離經(jīng)之血”,屬于血瘀證范疇,故而運(yùn)用活血化瘀法也就成為治療本病之根本大法,而觀察用活血化瘀類中藥對(duì)于EMT患者免疫功能的影響亦屢有報(bào)道。針對(duì)本病雖屬良性卻具有增生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及高復(fù)發(fā)等惡性行為的特征,新近有不少學(xué)者提出EMT的發(fā)病機(jī)理為瘀血、惡血壅阻于胞宮、胞脈,日久蘊(yùn)而化毒,轉(zhuǎn)化為瘀毒,主張用祛瘀解毒法治療本病。我們?cè)诮梃b這些新的觀點(diǎn)的基礎(chǔ)上,結(jié)合當(dāng)代中醫(yī)新的絡(luò)病學(xué)說(shuō)和濁、毒理論,認(rèn)為本病屬絡(luò)病,病位在胞宮、沖任之絡(luò)脈,瘀、濕、濁、毒互結(jié)損絡(luò)是其病理特征,“伏毒依時(shí)而發(fā)”是其發(fā)病特點(diǎn)。據(jù)此擬定祛瘀通絡(luò)、解毒化濁、消癥止痛治法,并擬定祛瘀解毒消癥湯。前期研究顯示,該方用于臨床不僅對(duì)EMT之痛經(jīng)、癥瘕有較好療效,還能降低其升高的血清CA125,轉(zhuǎn)陰血清抗子宮內(nèi)膜抗體。本研究顯示祛瘀解毒消癥湯對(duì)模型大鼠腹腔液中異常升高的IL-6、IL-8水平具有改善作用,說(shuō)明該方確能調(diào)節(jié)和改善EMT患者自身免疫功能的異常,此亦應(yīng)是其臨床有效性的作用機(jī)理之一。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1.1.2主要實(shí)驗(yàn)藥物和試劑1.1.3制備1.1.4主要設(shè)備和設(shè)備1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1模型準(zhǔn)