苜蓿離體葉接種對(duì)植株抗感病和感病的影響

苜蓿離體葉接種對(duì)植株抗感病和感病的影響

許多研究結(jié)果表明，超氧化物誘導(dǎo)酶（sod）、過(guò)氧化氫酶（pod）和多酚氧化酶（ppo）對(duì)植物疾病的治療過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。許多研究者認(rèn)為,植物體內(nèi)有一組保護(hù)酶系統(tǒng)(SOD、POD及PPO),在未受到病菌侵染前使活性氧處于低水平的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài);當(dāng)植物受到病原菌侵染后,被侵組織的活性氧突增,而該保護(hù)酶系統(tǒng)具有清除活性氧,防止植物受害的作用。以往對(duì)不同作物接種病菌后保護(hù)酶的活性作了大量的實(shí)驗(yàn)研究,以探討保護(hù)酶與寄主抗病性的關(guān)系,作為篩選抗性材料的生化指標(biāo)之一。但是,對(duì)于同一品種內(nèi),特別是同一牧草品種內(nèi)不同抗、感植株的保護(hù)酶變化的研究尚不多見。筆者和我國(guó)其他人員曾對(duì)苜蓿品種抗褐斑病的特性分別開展過(guò)室內(nèi)與田間的特性評(píng)價(jià)。在以往工作的基礎(chǔ)上,筆者通過(guò)離體葉接種,已經(jīng)從同一品種內(nèi)600個(gè)單株中篩選出抗病單株和感病單株(待刊)。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)苜蓿假盤菌的接種,對(duì)抗、感株進(jìn)行保護(hù)酶活性測(cè)定,以比較抗、感株酶活性的變化動(dòng)態(tài),對(duì)離體葉接種的有效性做進(jìn)一步檢驗(yàn),并為苜蓿抗褐斑病育種提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1數(shù)量和大小對(duì)采集目標(biāo)地區(qū)的影響選用4個(gè)苜蓿品種,即伊魯瑰斯、沙河、薩蘭斯和沙灣,它們的病指數(shù)分別為13.48、21.48、28.25和33.68。用離體葉接種方法從每個(gè)品種600株中篩選出最抗的和最感的苜蓿單株各5株,進(jìn)行無(wú)性扦插擴(kuò)繁,取擴(kuò)繁后的各品種抗感單株各30株,作為供試材料。1.1.2病原菌的接種苜蓿假盤菌(Pseudopezizamedicaginis)在V-8碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng),20℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)30d,按袁慶華等的方法接種病菌,分別于接種前1d,接種后2、7、12、17d對(duì)抗感單株逐株取相同部位的一個(gè)葉片,將同一抗病或感病單株的葉片放在一起,并用去離子水沖洗干凈后,用于制備酶液。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1離心酶粗液制備稱取0.5g去中脈的苜蓿葉片,放入研缽中,取5ml1/15mol磷酸緩沖液(pH=7.8)倒入研缽內(nèi),冰研磨成勻漿,6000r/min離心20min,傾出上清液,放入5ml試管內(nèi),剩余物加少量緩沖液沖洗后,再次離心(6000r/min,5min),取上清液,如此重復(fù)3次,直到酶粗提液補(bǔ)足5ml。將酶液放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。以上方法用于SOD、PPO酶液的提取,而POD酶液的提取使用的是0.01mol/L磷酸緩沖液(pH=7.2),其余方法同上。1.2.2透光率roSOD活性測(cè)定參照王愛國(guó)等和韓雅珊的方法。3ml反應(yīng)液中含有:0.013mol/L甲硫氨酸、63×10-6mol/L氮藍(lán)四唑、1.3×10-6mol/L核黃素、1×10-4mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)及pH=7.8的0.05mol/L磷酸緩沖液,加入稀釋30倍的酶粗提液1ml,在30℃下用4000Lux熒光照射10min,并在560nm波長(zhǎng)下測(cè)量透光率。以每克鮮重含有的酶活單位(U/gfw)表示。各樣品均重復(fù)測(cè)定2次。1.2.3酶活單位的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚做底物,用分光光度法測(cè)定生成物的含量。反應(yīng)液中含有1ml0.1mol/L磷酸緩沖液(pH=7.2)、1ml0.1mol/L愈創(chuàng)木酚、1ml0.8%H2O2,并加入適量的酶液后在30℃下反應(yīng)20min,并在470nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。以1ml去離子水代替H2O2為對(duì)照。在上述反應(yīng)條件下,以每分鐘每克鮮重OD值變化1.00所需的酶量為一個(gè)酶活單位。各樣品均重復(fù)測(cè)定2次。1.2.4鄰苯二酚反應(yīng)條件的確定在小試管中依次加入1.5ml1/15mol磷酸緩沖液(pH=6.8)、1.5ml0.02mol鄰苯二酚及適量的酶粗提液混合均勻后,放入40℃的水浴鍋中保溫30min,在525nm波長(zhǎng)下測(cè)量光密度,以磷酸緩沖液代替酶液作對(duì)照。在上述反應(yīng)條件下,以每分鐘每克鮮重OD值變化0.01所需的酶量為一個(gè)酶活單位。各樣品均重復(fù)2次。2結(jié)果與分析2.1接種前后抗感病株酶活性的變化由圖1可知,苜蓿的4個(gè)品種在未接種苜蓿假盤菌前,抗、感株間SOD活性無(wú)差異,接種后抗、感株SOD的活性比接種前高,隨著接種后時(shí)間的延長(zhǎng),抗感株酶活性均顯著下降,接種后17d抗感株SOD的活性均低于接種前。接種后抗病株SOD的活性高于感病株,伊魯瑰斯接種假盤菌后12d,抗病株SOD的活性達(dá)到最大,比感病株高55%;薩蘭斯接種后7d,抗病株酶活性達(dá)到最高,比感病株高20%;沙灣從接種后2d開始到接種后的17d,抗病株酶活性都高于感病株,平均比感病株高71%;沙河從接種后2d到12d,抗病株酶活性顯著高于感病株,3個(gè)時(shí)期酶活性平均比感病株高48%。2.2pod的活性從圖2可以看出,未接種苜蓿假盤菌前,抗病株和感病株之間POD的活性差異較小,接種后抗、感株P(guān)OD的活性都比接種前的高,但抗病株P(guān)OD的活性增加明顯高于感病株。薩蘭斯接種后12d,抗病株酶活性達(dá)到最大,比感病株高72%;沙灣接種后2d,抗病株P(guān)OD的活性比感病株高46%;沙河于接種后7d,抗病株的酶活性達(dá)到最高,比感病株高94%。酶活性達(dá)到最高峰后,除伊魯瑰斯有波動(dòng)外,其余3個(gè)品種的抗病株酶活性下降,而感病株酶活性有所增加,最終在第17d時(shí)抗、感株酶活性極為接近。2.3接種前后抗、感株酶活性比較所測(cè)試的4個(gè)品種內(nèi)抗病株和感病株之間PPO活性的變化如圖3所示,接種前,抗感株間酶活性差異不大,接種病菌后抗、感株酶活性均比接種前的高。接種后抗病株比感病株P(guān)PO活性高,從接種后2d到12d各品種抗病株酶活性分別比感病株提高6.7%～23.2%(伊魯瑰斯)、8.5%～15.7%(薩蘭斯)、12.4%～19.5%(沙灣)和9.7%～21.2%(沙河),接種后的17d抗感株酶活性都有所下降,抗、感株之間酶活性較為接近。3苜?？购职卟∮N對(duì)抗氧化酶活性的影響許多研究證實(shí),植物受到病原菌侵染時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧,多余的活性氧影響植物的正常生理活動(dòng),它通過(guò)非酶促方式催化細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸而啟動(dòng)膜脂過(guò)氧化,破壞細(xì)胞膜的完整性,引起細(xì)胞膜透性的增加及電解質(zhì)的滲漏,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡,而超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶等正是負(fù)責(zé)清除活性氧的保護(hù)酶。在不同的病害研究中SOD的活性變化差異很大,Buonario等認(rèn)為,在抗病品種中SOD活性一般呈下降趨勢(shì),而在感病品種中基本不變甚至升高,而王雅平等認(rèn)為抗感品種接種后SOD活性均升高,抗病品種比感病品種升高的幅度大,在POD的研究中,許多研究者認(rèn)為,植物受病菌侵染后,體內(nèi)POD的活性均顯著增加,抗病品種酶活性高于感病品種。本試驗(yàn)結(jié)果表明,利用離體葉接種技術(shù)從同一品種內(nèi)篩選出的抗病株及感病株之間SOD、POD活性變化存在差異,接種苜蓿假盤菌后抗感株SOD和POD活力均升高,但抗病株酶活性始終高于感病株,直到接種后17d抗、感株活性差異不明顯。這可能是由于寄主受到苜蓿假盤菌作用后活性氧的積累刺激了SOD和POD活性的提高。同時(shí)在PPO活性的測(cè)定中發(fā)現(xiàn),苜蓿葉片受苜蓿假盤菌侵染后PPO的活性在