肉類成熟嫩化過程中的蛋白酶系及其作用

肉類成熟嫩化過程中的蛋白酶系及其作用李永鵬;余群力【摘要】闡述了幾種與肉類成熟嫩化有關的主要蛋白酶系即鈣蛋白酶系、組織蛋白酶系、蛋白酶體、絲氨酸肽酶系,細胞凋亡酶系,及其參與成熟嫩化的實驗證據(jù),并提出在該研究領域中引入多種酶系復合研究模型的建議.期刊名稱】《肉類研究》年(卷),期】2010(000)005【總頁數(shù)】5頁(P8-12)【關鍵詞】蛋白酶;肉類嫩化;成熟;肌原纖維蛋白【作者】李永鵬;余群力【作者單位】甘肅農(nóng)業(yè)大學,食品科學與工程學院,甘肅,蘭州,730070;甘肅農(nóng)業(yè)大學,食品科學與工程學院,甘肅,蘭州,730070【正文語種】中文【中圖分類】TS251.1嫩度是肉產(chǎn)品最重要的食用品質(zhì)，這也是消費者最在意的感官指標之一。我國的肉類產(chǎn)品在國際市場上缺乏競爭力，其較差的嫩度也是主要原因之一。早在1907年，Lehmen就發(fā)現(xiàn)鮮肉在冷藏條件下貯藏時嫩度明顯提高了，這一現(xiàn)象被認為是成本最低的嫩度改善工藝。這一過程就是成熟。目前的成熟機理還不完善。研究者們普遍認為肌纖維中骨架蛋白的水解是嫩化發(fā)生的決定性因素［1］。因此能夠參與宰后蛋白水解的因素，都能影響肉品的最終嫩度。蛋白酶系就是該領域的主要研究對象。1與肉類成熟嫩化有關的蛋白酶系與嫩化過程有關的蛋白酶，是與肌纖維骨架蛋白降解有關的。Hopkins等人(2002)指出肌肉結(jié)構變化與相關肌原纖維蛋白變性的程度決定了肉的最終嫩度。這包括主要肌原纖維蛋白的裂解，如肌動蛋白和肌球蛋白，而一些特定的肌原纖維蛋白、肌原纖維細胞骨架蛋白、肋狀體蛋白也會發(fā)生分解，如肌聯(lián)蛋白、肌間線蛋白、粘著斑蛋白等［2］。而并不是所有蛋白酶都可以水解肌原纖維蛋白，它必須符合一定的條件。Koohmaraie(1988)給出了判斷某種蛋白酶是否參與了宰后蛋白水解和肌肉嫩化過程的公認標準：1)這種蛋白酶必須在骨骼肌細胞內(nèi)被表達，也就是說對于肌肉而言這種酶必須是內(nèi)源性的；2)在體外的肌原纖維降解模擬實驗中，這種酶必須可以模擬出肌肉自然成熟過程中肌原纖維蛋白的降解模式，即兩者都是相同的幾種肌原纖維蛋白發(fā)生降解，同樣的肌原纖維蛋白產(chǎn)生相同的碎片模式；3)該酶在肌肉組織中必須有接近肌原纖維的途徑，即有和底物接觸的可能性［3］。根據(jù)這一標準，可以列出蛋白酶系的候選名單。這包括依鈣蛋白酶系、組織蛋白酶系、蛋白酶體、絲氨酸肽酶系、細胞凋亡酶系等。2依鈣蛋白酶系(calpain)與肉類成熟嫩化依鈣蛋白酶系是目前最被研究者們所認可的酶系。這是一個由細胞內(nèi)源性的半胱氨酸蛋白酶組成的大家族。迄今為止已經(jīng)有14個成員被鑒定出來。在骨骼肌細胞中，依鈣蛋白酶系有3種同工酶被表達，它們是p型、m型、p94(或calpain3)。依鈣蛋白酶也就是鈣激活蛋白酶，這是指他們需要一定濃度的鈣離子來激活，其中p型酶需要的鈣離子濃度是微克級的，m型則是毫克級。依鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)是這類酶的特異性內(nèi)源抑制劑，有大量的實驗證據(jù)表明該抑制劑與最終嫩度的相關性甚至高過了酶活力。很多研究者只認同這一種酶系的作用，甚至完全忽略其他酶系，這樣的研究者被調(diào)侃為“依鈣蛋白酶人”（calpaino-men）。因為，近20年來已有大量實驗證據(jù)證明依鈣蛋白酶與成熟關系密切。首先，依鈣蛋白酶在宰后肌肉的生理環(huán)境中具有可觀的活力。PilarCena（1991）等人就發(fā)現(xiàn)在與宰后肌肉相近的pH條件下（pH5.5-6.5）小型和m型依鈣蛋白酶仍然保有其最大活力（最大活力出現(xiàn)在pH為7.5時）的40%以上［4］。其次，研究者們還發(fā)現(xiàn)了依鈣蛋白酶的表達量和嫩化程度有直接聯(lián)系，Koohmaraie等（1991）發(fā)現(xiàn)嫩化的程度與calpastatin:calpain表達量之比存在著負相關性，成熟過程中物種之間的嫩化程度差異是牛v羊v豬，而其calpastatin:calpain表達量之比差異則是牛〉羊＞豬［5］。第三，在肌原纖維蛋白體外模擬降解實驗中，依鈣蛋白酶“孵化”所得到的降解模式與天然模式最為接近，這是最為符合Koohmaraie第二條判斷標準的，因此被認為是具有決定性意義的實驗證據(jù)。Huff-Lonergan等（1996）發(fā)現(xiàn)體外模擬實驗與天然肌肉中具有相似的肌原纖維蛋白降解模式，其中伴肌動蛋白、肌聯(lián)蛋白、肌鈣蛋白T以及肌間線蛋白等肌原纖維骨架蛋白均有降解［6］。黃明等（2004）發(fā)現(xiàn)黃牛肉中p型依鈣蛋白酶在體外實驗中對肌間線蛋白和肌鈣蛋白T有明顯的降解作用，這與肌肉天然成熟時的情況相似［7］。另外，還有來自相關研究領域的佐證。在對雙肌臀基因型羊的專門研究中，Delgad。等人（2001）證明，雙肌臀羊的嫩度和成熟嫩化程度直接與依鈣蛋白酶抑制蛋白的表達量有關，這種羊?qū)录〉囊种频鞍妆磉_量與正常羊差不多，因此這塊肌肉的嫩度和成熟嫩化程度與正常羊沒有明顯區(qū)別［8］。在美國肉品商業(yè)成熟的相關研究中意外發(fā)現(xiàn)，肉品成熟開始時依鈣蛋白酶抑制蛋白水平越高，成熟結(jié)束后出現(xiàn)硬肉產(chǎn)品的概率越大。盡管多數(shù)實驗證據(jù)都是支持依鈣蛋白酶系的，但仍有一些研究指出了依鈣蛋白酶系理論的缺陷。Boehm等（1998）發(fā)現(xiàn)宰后肌肉中的鈣離子濃度不足以激活m型依鈣蛋白酶［9］°p型依鈣蛋白酶很不穩(wěn)定，大約在宰后的3-4天就幾乎沒有活力了，而宰后蛋白水解和肉的成熟嫩化是會持續(xù)到宰后8天甚至2周以后的。Geesink等人（2005）的實驗證據(jù)直接證明p94與宰后蛋白水解無關［10］。這些缺陷暗示著除了依鈣蛋白酶系這支主力酶系以外，應該還存在著別的替補酶系。3組織蛋白酶系（cathepsin）與肉類成熟嫩化組織蛋白酶是指位于溶酶體內(nèi)、大部分在酸性pH值下具有活力的蛋白酶，是多種酶的混合體。該酶系有三大家族，半胱氨酸家族包括組織蛋白酶B、H、L、X、S、K等，天冬氨酸家族包括組織蛋白酶D和E，絲氨酸家族包括組織蛋白酶G。目前已知的即在肌肉中被表達又與肉類嫩化有關的組織蛋白酶包括6種半胱氨酸家族成員（即B、L、H、S、F、K）和1種天冬氨酸家族成員（即組織蛋白酶D）。半胱氨酸家族成員與木瓜蛋白酶是同源的，它們有著相似的氨基酸序列和折疊方式；半胱氨酸家族成員仍有免疫學上的區(qū)別，可以用特定抗體來標記。相關研究證明組織蛋白酶和成熟有一定關系。首先，組織蛋白酶在細胞中含量很高，總濃度甚至可以超過1mM，因而具有極高的蛋白水解潛力。其次，部分實驗證據(jù)顯示組織蛋白酶活力與嫩度有關°O'Halloran等（1997）發(fā)現(xiàn)牛肉中組織蛋白酶B、L宰后8小時的活力與嫩度呈現(xiàn)出正相關性［11］。第三，對肌原纖維降解碎片的分析表明該酶系參與了宰后蛋白水解。Mikami等（1987）發(fā)現(xiàn)在兔肉、牛肉和雞肉成熟過程中，組織蛋白酶L所水解肌原纖維蛋白的數(shù)量最大，這包括肌鈣蛋白T、I、C、伴肌動蛋白、肌聯(lián)蛋白、原肌球蛋白，而它們都是在成熟后期發(fā)生降解的，這彌補了依鈣蛋白酶系的不足之處［12］。多數(shù)研究者并不認為組織蛋白酶系對成熟有貢獻。這主要是基于以下兩個原因：1）組織蛋白酶解釋不了不同肉樣（不同物種、品種、部位等）之間的嫩度差異；2）組織蛋白酶抑制劑不能抑制宰后蛋白水解。另外，肌動蛋白和肌球蛋白都對組織蛋白酶高度敏感。如果組織蛋白酶酶確實參與了成熟嫩化，兩種肌原纖維蛋白必然會有強烈降解。而事實上，肉類成熟并沒有引起這兩種結(jié)構性蛋白的大量降解。組織蛋白酶位于溶酶體內(nèi)，缺乏與肌原纖維接觸的途徑。因此，很久以來，肉品科學家忽略了這種酶的作用。后來組織化學的相關研究證實，隨著成熟的進行，肉品的pH會下降，肌質(zhì)網(wǎng)上離子泵會失效，因此溶酶體會逐漸裂解。Zeece等人(1992)發(fā)現(xiàn)宰后14天溶酶體完全解體。但組織蛋白酶“破殼而出”通常是在宰后2周之后，有時更長，這已遠遠超出一般概念上7-8天的商業(yè)成熟期。不過對于肉品深加工而言，如火腿、熏肉、魚靡等產(chǎn)品的生產(chǎn)，組織蛋白酶的蛋白水解作用就是很重要的了，也是這些產(chǎn)品相關研究的重點。值得一提的是，組織蛋白酶系中半胱氨酸家族的內(nèi)源性抑制劑cystatin對宰后蛋白水解及嫩化是有重要影響的。這是因為該抑制劑可以抑制依鈣蛋白酶(EC7)，有文獻稱它可以成為肉類經(jīng)過成熟后的最終嫩度的預測因子。Zamora等人(2005)在研究牛肉嫩度預測模型時發(fā)現(xiàn)，cystatin成熟初始時的抑制活力與最終嫩度有一定的相關性，只是在構建預測的回歸方程時被排除在外(Pv0.05)［13］。依鈣蛋白酶系有缺陷，組織蛋白酶又不是主要因素。因此，有研究者建議，探討依鈣蛋白酶系和組織蛋白酶系的協(xié)同作用，也可以嘗試引入新的酶系。4蛋白酶體(proteasome)與肉類成熟嫩化蛋白酶體，即多酶復合體，它可以降解胞液及細胞核中的蛋白質(zhì)，從而調(diào)節(jié)細胞的基礎代謝。蛋白酶體于機體內(nèi)普遍存在，尤其是在骨骼肌中含量豐富。蛋白酶體(26S)包括一個19S的調(diào)控亞基和20S的復合催化結(jié)構，這個20S結(jié)構就是真正的多酶復合體(MCP),也是整個蛋白酶體的催化中心。在初步的研究中，沒有發(fā)現(xiàn)蛋白酶體參與宰后成熟的有力證據(jù)。一些研究表明蛋白酶體可能對肉類嫩化有貢獻。首先，在成熟過程中，蛋白酶體有能力參與肌原纖維的降解。Lamare等(2002)研究了牛肉中蛋白酶體的蛋白水解活力在宰后成熟過程中的變化，發(fā)現(xiàn)即使是在宰后7天，蛋白酶體仍具有一定的活力［14］。Robert等人（1999）發(fā)現(xiàn)蛋白酶體具有水解牛肉肌原纖維蛋白的能力［15］。其次，有實驗證據(jù)表明蛋白酶體可以改變肌肉的微觀結(jié)構和部分肌原纖維蛋白的降解程度。Dutaud等人（2006）發(fā)現(xiàn)蛋白酶體會引起肌原纖維的微觀結(jié)構變化，如Z盤延伸到明帶（I帶）中等［16］。Houbak等人（2008）還發(fā)現(xiàn)當?shù)鞍酌阁w被抑制后，肌鈣蛋白T與伴肌動蛋白等肌原纖維蛋白的降解程度不如抑制之前高，這些蛋白在自然成熟過程中都是會大量水解的［17］。肉品成熟嫩化研究領域的專家Koohmaraie（2006）曾經(jīng)特別指出蛋白酶體在體外成熟模擬實驗中得出的肌原纖維蛋白降解模式與天然狀態(tài)不同［18］，因此還不能將其列為宰后蛋白水解的主要因素。此外，蛋白酶體水解蛋白質(zhì)是必須通過泛素來標記底物蛋白的，這也是必須依賴ATP的。不過有研究證實，當體內(nèi)ATP耗竭時，蛋白酶體會分裂成19S和20S的兩個亞基，這樣的話，即使沒有ATP和泛素也能水解蛋白質(zhì)。從目前的實驗證據(jù)來看，蛋白酶體對宰后蛋白水解的貢獻不能被輕易排除。法國農(nóng)科院肌肉生化研究小組負責人AOuali特別指出：蛋白酶體應該是該領域中下一個引起廣大研究者注意的目標［19］。5絲氨酸肽酶系（Serinepeptidase）與肉類成熟嫩化絲氨酸肽酶是哺乳動物體內(nèi)規(guī)模最為龐大的蛋白水解酶系。其中，最所為人們熟悉的就是消化酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，和凝血酶，如凝血酵素、血漿酶。這種酶在肌肉組織中僅存在于肥大細胞內(nèi)，橫紋肌細胞中則沒有，看上去與肌肉的成熟嫩化沒有關系。肉品成熟嫩化領域中，關于這種酶的直接報道很少。但Alarcon-Rojo等（1995）在牛肉中注射了一種絲氨酸肽酶抑制劑PMSF以后，發(fā)現(xiàn)牛肉的硬度上升了，間接說明絲氨酸肽酶參與了成熟過程［20］。盡管還不清楚絲氨酸肽酶是否直接參與了宰后蛋白水解和成熟嫩化，但很多學者已經(jīng)認可了絲氨酸肽酶的內(nèi)源性抑制劑serpin對肉類成熟的重要影響。Zamora等（2005）在研究牛肉最終嫩度預測模型時發(fā)現(xiàn)，牛肉成熟初始階段serpin的抑制活力對最終嫩度有很好的預測性，是其所確立的六個預測因素中相關系數(shù)最高的（R2=0.4）［13］。serpin與嫩度之間的高度相關性也已被其他學者所證實。只是研究者還不能解釋這類酶的作用機理。6細胞凋亡酶系（caspase）與肉類成熟嫩化細胞凋亡酶，也就是半胱天冬酶，簡稱胱冬酶，這是一個半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶家族，迄今為止該家族已有14成員被鑒定出來。這類酶的特點是能夠參與細胞凋亡途徑，細胞凋亡途徑是指細胞在受到重大損傷后，機體自動放棄對受損細胞的修復，進行有組織的解體。這類酶根據(jù)其在細胞凋亡途徑中的作用，可被進一步分為啟動型（如胱冬酶8、9、10、12）和效應型（例如胱冬酶3、6、7）。近年來，隨著肉類成熟研究領域的發(fā)展，一些以前未被重視的酶系成了新的研究目標［21］。在這種背景下，有研究者提出細胞凋亡酶對成熟嫩化有貢獻。這主要是因為以下推測和實驗證據(jù)。有報道稱在局部貧血或低氧的狀況下細胞凋亡酶會被激活，同時啟動細胞凋亡途徑。現(xiàn)代屠宰的放血工藝會使肉中的肌細胞處于局部貧血狀態(tài)；而動物宰后，細胞新陳代謝尚未完全停止，會使肌細胞處于低氧狀態(tài)。這樣細胞凋亡酶就會被激活，細胞凋亡途徑會被啟動，于是細胞凋亡酶也就具備了參與宰后蛋白水解的理論可能性。有一些實驗證據(jù)顯示，細胞凋亡酶宰后早期的活力變化與肉的剪切力呈負相關性。然而另有研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡酶引起的蛋白水解卻發(fā)生在成熟后期［22］。這些相關研究采用的是相似的研究方法，但研究結(jié)果卻沒有那么好的一致性。來自轉(zhuǎn)基因領域的實驗證據(jù)表明，轉(zhuǎn)基因合成的細胞凋亡酶可以在體外水解肌原纖維，其所獲得的降解模式與天然肌肉相似，盡管它們只有3條蛋白條帶一致，但也足以說明細胞凋亡酶對成熟有作用［22］。但是Kemp等的研究（2009）發(fā)現(xiàn)，當依鈣蛋白酶被抑制后，細胞凋亡酶無法改變蛋白水解程度大幅下降的狀況，這說明依鈣蛋白酶還是壓倒一切的主導因素［23］。7結(jié)論與建議上述內(nèi)源性蛋白酶：鈣蛋白酶系、組織蛋白酶系、蛋白酶體、絲氨酸肽酶系、細胞凋亡酶系都有參與肉類宰后成熟嫩化的可能，其中依鈣蛋白酶系已被證明是影響宰后蛋白水解主要因素，其專一性抑制劑也是很好的最終嫩度預測因子。但依鈣蛋白酶在成熟后期活力下降很大，似乎不能為后期蛋白水解提供動力；此外，其活性受鈣離子濃度調(diào)控，因而會受到鈣離子濃度分布不均的限制。組織蛋白酶可作為很好的補充，為成熟后期的蛋白水解提供動力，而且不受鈣離子濃度的限制，其抑制劑cystatin也可被引入成熟最終嫩度的預測模型之中。按照相似的研究方法，蛋白酶體、絲氨酸肽酶、細胞凋亡酶等新的影響因素可逐步被引入到成熟機理之中。這樣在該領域中就可以建立基于多種酶系的復合研究模型，從而將研究重點由單一酶系作用逐漸過渡到多酶系協(xié)同作用上來。正如Zamora等人（2005）所研究的牛肉嫩度預測模型，他們得到了最終嫩度與多個初始因素之間的回歸方程：其中：T6為牛肉成熟第六天的硬度SPI為成熟初始時絲氨酸肽酶抑制劑水平Rp為P型成熟初始階段依鈣蛋白酶活力下降速率RpH為pH初始下降速率EpH為pH初始下降程度Eo為僵硬開始時滲透壓升高程度LDH為成熟初始乳酸脫氫酶活力［13］這里的預測因素不但引入了不同的蛋白酶系，還引入了其他理化因素。單一酶系模型在解釋成熟機理和預測最終嫩度等方面存在缺陷，因此建立這種多酶系復合模型是很必要的。隨著肉類成熟機理的逐漸完善，準確預測排酸肉(經(jīng)過成熟嫩化的肉)的最終嫩度也就成為了可能。目前在國內(nèi)市場上排酸肉逐漸被消費者所認可，隨著中國肉類工業(yè)的現(xiàn)代化，這類經(jīng)過成熟工藝的肉制品將是未來中國肉類市場的主導產(chǎn)品。因而建立一套以成熟后最終嫩度為標準的預測分級系統(tǒng)就非常必要了。目前法國、西班牙、美國等國均開始了對于嫩度預測分級系統(tǒng)的研究。因而，關于肉類成熟機理和嫩度預測的研究，將是未來中國肉類工業(yè)最重要的研究方向之一。參考文獻Koohmaraie,M.,&Geesink,G.H.Contributionofpostmortemmusclebiochemistrytothedeliveryofconsistentmeatqualitywithparticularfocusonthecalpainsystem[J].MeatScience,2006,74:3443.Hopkins,D.L.,&Taylor,R.G..Post-mortemmuscleproteolysisandmeattenderisation.InM.tePas,M.Everts,&H.Haagsman(Eds.),Muscledevelopmentoflivestockanimals(M).Cambridge,MA,USA:CABInternational,2002.Koohmaraie,M.Theroleofendoproteasesinmeattenderness(C).Proceedingsofthe41stAnnualReciprocalMeatConference.Laramie,WY,USA,1988:89100PilarCena,IsabelJaime,JoseAntonioBeltran,etal.ProteolyticactivityofisolatedlambcalpainsonmyofibrilsundertheconditionsofpH,Ca2+concentrationandtemperatureexistinginpostmortemmuscle[J].ZLebensmUntersForsch,1991,194:248-251Koohmaraie,M.,Whipple,G.,Kretchmar,etal.Postmortemproteolysisinlongissimusmusclefrombeef,lambandporkcarcasses[J].JournalofAnimalScience,1991,69:617624.Huff-Lonergan,E.,Mitsuhashi,Beekman,etal.Proteolysisofspecificmusclestructuralproteinsbymu-calpainatlowpHandtemperatureissimilartodegradationinpostmortembovinemuscle[J].JournalofAnimalScience,1996,74:993－1008.黃明，周光宏,徐幸蓮，王俊?牛肉宰后嫩化機制的研究J].農(nóng)業(yè)工程學報，2004,(1):198-202.Delgado.E.F,Geesink.G.H,MarchelloJ.A,etal.Thecalpainsysteminthreemusclesofnormalandcallipygesheep[J].JournalofAnimalScience,1991,79:398-412.Boehm,Kendall,Thompson,etal.Changesinthecalpainsandcalpastatinduringpostmortemstorageofbovinemuscle[J].JournalofAnimalScience,1998,76:2415－2434.Geesink,G.H.,vanderPalen,etal.Quantificationofcalpastatinusinganopticalsurfaceplasmonresonancebiosensor[J].MeatScience,2005,71:537－541.O'Halloran,G.R.,Troy,etal.Theroleofendogenousproteasesinthetenderisationoffastglycolysingmuscle[J].MeatScience,1997,47:187－210.Mikami,M.,Whiting,etal.Degradationofmyofibrilsfromrabbit,chickenandbeefbycathepsinlandlysosomallysates[J].MeatScience,1987,21:81－97.Zamora,F.,Aubry,L.,Sayd,etal.Serinepeptidaseinhibitors,thebestpredictorofbeefageingamongstalargesetofquantitativevariables[J].MeatScience,2005,71:730－742.Lamare,M.,Taylor,R.G.,etal.Changesinproteasomeactivityduringpostmortemagingofbovinemuscle[J].MeatScience,2002,61:199－204.Robert,N.,Briand,M.,etal.Theeffectofproteasomeonmyofibrillarstructuresinbovineskeletalmuscle[J].MeatScience,1999,51:149－153.Dutaud,D.,Aubry,L.,Sentandreu,etal.Bovinemuscle20Sproteasome:I.Simplepurificationprocedureandenzymaticcharacterizationinrelationwithpostmortemconditions[J].MeatScience,2006,74:327－336.Houbak,M.B.,Ertbjerg,etal.Invitrostudytoevaluatethedegradationofbovinemuscleproteinspost-mortembyproteasomeandmicrocalpain[J].MeatScience,2008,79:77－85.Koohmaraie,M.,&Geesink,G.H.Contributionofpostmortemmusclebiochemistrytothedeliveryofconsistentmeatqualitywithparti