細(xì)菌鑒定方法

細(xì)菌鑒定方法作為科研生產(chǎn)中最重要的基礎(chǔ)性資源一菌毒種，其收集、保藏及相關(guān)的研究工作在我國(guó)正處于整理、整合以及全方面逐步正規(guī)化階段。2003年7月23日，科技部在北京召開(kāi)了“國(guó)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)建設(shè)”部際聯(lián)席會(huì)和專(zhuān)家顧問(wèn)組成立大會(huì)，正式啟動(dòng)了國(guó)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)建設(shè)工作。國(guó)家自然科技資源共享平臺(tái)建設(shè)作為其中的一個(gè)重要組成部分同步啟動(dòng)。作為該項(xiàng)8的一個(gè)重要組成部分，微生物菌種資源整理、整合工作同期啟動(dòng)，在此項(xiàng)工作中，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所承擔(dān)了獸醫(yī)微生物資源整理、整合工作。本所在行業(yè)內(nèi)發(fā)展了數(shù)家加盟單位，在整理、整合菌種資源的過(guò)程中遇到了一些實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌鑒定結(jié)果出現(xiàn)偏差的問(wèn)題。經(jīng)分析調(diào)查，多是由于實(shí)驗(yàn)室人員結(jié)構(gòu)以及實(shí)驗(yàn)室的硬件水平差別較大等原因，造成實(shí)驗(yàn)室間鑒定能力的參差不齊，致使鑒定項(xiàng)目完成情況不盡相同，細(xì)菌鑒定結(jié)果出現(xiàn)偏差。細(xì)菌鑒定是指將分離培養(yǎng)獲得的病原菌，通過(guò)純化培養(yǎng)使其達(dá)到不含有其他微生物的純培養(yǎng)程度，繼而進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。而菌種保藏機(jī)構(gòu)在收集一些已經(jīng)凍干的菌種時(shí)，應(yīng)在開(kāi)啟后經(jīng)過(guò)兩代的適應(yīng)性培養(yǎng)方可進(jìn)行復(fù)核性的系統(tǒng)鑒定。系統(tǒng)鑒定是通過(guò)細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)特性、抗原性、病原性以及目前流行的核酸測(cè)定方法等檢測(cè)，并用已知標(biāo)準(zhǔn)免疫血清確定分離細(xì)菌的屬、種和型（群）。目前菌種保藏機(jī)構(gòu)通常使用的細(xì)菌鑒定方法大致有以下幾種：1、傳統(tǒng)方法常規(guī)宏觀菌落形態(tài)學(xué)觀察，主要觀察菌落在其適合的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況：細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)、大孝顏色是否均勻一致，菌落個(gè)體表面及邊緣的生長(zhǎng)狀況;在液體培養(yǎng)基上的渾濁狀況、沉淀狀況、液面菌膜狀況；半固體上穿刺接種后，觀察細(xì)菌是否沿著接種線生長(zhǎng)以及其生長(zhǎng)狀態(tài)是呈毛刷樣生長(zhǎng)還是均勻生長(zhǎng)，上下生長(zhǎng)是否一致。在鑒別培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察結(jié)果是否跟預(yù)期結(jié)果相同。細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)學(xué)觀察，即通過(guò)顯微鏡觀察。觀察前細(xì)菌需要著色，要根據(jù)預(yù)先確定的觀察項(xiàng)目選擇與之相對(duì)應(yīng)的染色方法，目前常用的染色方法包括革蘭氏染色法、美藍(lán)染色法、Ziehl—Neelsen染色法、姬姆薩染色法、鞭毛染色法、芽胞染色法等。盡量挑選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌進(jìn)行染色觀察，此時(shí)的細(xì)菌生長(zhǎng)處于幼期，利于觀察，因?yàn)橐恍╆惻f細(xì)菌的染色結(jié)果會(huì)有變化，如本為革蘭氏陽(yáng)性菌經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期擱置后染色結(jié)果可能為革蘭氏陰性。同時(shí)細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)要注意培養(yǎng)基的挑選，一些細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)如莢膜、鞭毛、菌毛、芽胞等，其表達(dá)是需要在特定的培養(yǎng)基上才能正常發(fā)育，有的細(xì)菌如炭疽在一般的培養(yǎng)基上不形成莢膜，只在動(dòng)物體內(nèi)形成明顯的莢膜，所以需先接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后用病料進(jìn)行涂片鏡檢。在鏡檢時(shí)觀察細(xì)菌基本形態(tài)結(jié)構(gòu)和大小及其排列狀態(tài)、菌端形狀、有無(wú)兩極染色、有無(wú)形成芽胞和莢胞等。形態(tài)學(xué)鑒定輔以生化試驗(yàn)在細(xì)菌鑒定中具有重要的意義，生化試驗(yàn)是根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中不同菌種所產(chǎn)生的新陳代謝產(chǎn)物各異，表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)特性。通過(guò)生物化學(xué)的方法來(lái)檢測(cè)這些物質(zhì)的存在與否，從而能夠得到細(xì)菌的鑒定結(jié)果。如糖（醇）類(lèi)代謝試驗(yàn)、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)、有機(jī)酸鹽和胺鹽利用試驗(yàn)、呼吸酶類(lèi)試驗(yàn)、毒性酶類(lèi)試驗(yàn)等。血清型鑒定是根據(jù)細(xì)菌具有相對(duì)特異性的抗原結(jié)構(gòu)這個(gè)特點(diǎn)進(jìn)行微生物鑒定的特異方法?？乖奶禺愋猿潭扔执嬖谟趯匍g細(xì)菌所共有的共同抗原，這種抗原的存在，能表明其屬性。另一類(lèi)特異性抗原只存在于特定的種、型，是確定細(xì)菌種、型的重要依據(jù)。通過(guò)專(zhuān)門(mén)的分型血清即可對(duì)這些細(xì)菌的血清型進(jìn)行鑒定。細(xì)菌毒力的測(cè)定，病原菌侵入機(jī)體能否引起疾病與其本身的毒力、侵入機(jī)體的數(shù)量和侵入部位有關(guān)。不同的病原菌或同種細(xì)菌不同的型或株，毒力常不一致。常用LD50或ID50表示毒力，即在一定時(shí)間內(nèi)，能使一定條件的某種動(dòng)物半數(shù)死亡或感染需要的最小細(xì)菌數(shù)或毒素量。毒力測(cè)定在菌種鑒定過(guò)程中可用于鑒別一些有代表性的菌株。LD50可用Reed—Muench公式進(jìn)行計(jì)算。2、 儀器自動(dòng)化鑒定隨著儀器分析技術(shù)的進(jìn)步和計(jì)算機(jī)的廣泛應(yīng)用，微生物菌種鑒定逐漸由傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察和人工生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定發(fā)展進(jìn)入了基于儀器自動(dòng)化分析的鑒定系統(tǒng)階段。近20年來(lái)，一系列商品化自動(dòng)鑒定系統(tǒng)相繼推出，并在應(yīng)用中取得理想效果，如VITEK系統(tǒng)、MIDI系統(tǒng)、BIOLOG系統(tǒng)、SENSITl.TRE系統(tǒng)、AUTOSCEPTOR系統(tǒng)以及MICROSCAN系統(tǒng)等。下面以BIOLOG微生物鑒定系統(tǒng)為例，簡(jiǎn)述微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)的工作原理：BIOLOG微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)是美國(guó)Biolog公司從1989年開(kāi)始推出的一套微生物鑒定系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要根據(jù)細(xì)菌對(duì)糖、醇、酸、醋、胺和大分子聚合物等95種碳源的利用情況進(jìn)行鑒定。細(xì)菌利用碳源進(jìn)行呼吸時(shí)，會(huì)將四哇類(lèi)氧化還原染色劑(TV)從無(wú)色還原成紫色，從而在鑒定微平板(96孔板)上形成該菌株特征性的反應(yīng)模式或“指紋圖譜”，通過(guò)纖維光學(xué)讀取設(shè)備一讀數(shù)儀來(lái)讀取顏色變化(分為“自動(dòng)”和“人工”兩種讀取方式)，由計(jì)算機(jī)通過(guò)概率最大模擬法將該反應(yīng)模式或“指紋圖譜”與數(shù)據(jù)庫(kù)相比較，可以在瞬間得到鑒定結(jié)果，確定所分析的菌株的屬名或種名。以BIOLOG系統(tǒng)6.01版數(shù)據(jù)庫(kù)為例，包含了革蘭氏陰性好氧菌524種、革蘭氏陽(yáng)性好氣菌341種、厭氧菌361種、酵母菌267種、絲狀真菌(含部分酵母菌)619種以及幾種特殊的致病菌，目前這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)已進(jìn)行更新。利用微生物快速系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定，能節(jié)省時(shí)間，但由于其在數(shù)據(jù)比對(duì)過(guò)程中記入一些非特異性的陽(yáng)性反應(yīng)孔，會(huì)造成偶然誤差，從而引起個(gè)別鑒定結(jié)果不穩(wěn)定，另外此類(lèi)儀器本身及其耗材價(jià)格均較高。3、 分子生物學(xué)鑒定分子生物學(xué)鑒定目前比較流行的主要是核酸檢測(cè)技術(shù)，包括基因測(cè)序、指紋圖譜技術(shù)、基因探針技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、GC含量測(cè)定等。PCR和核酸雜交單獨(dú)或結(jié)合在儀器已經(jīng)形成比較經(jīng)典的核酸檢測(cè)技術(shù)，目前這兩者已經(jīng)得到了較大范圍的推廣和應(yīng)用。下面將簡(jiǎn)單介紹幾種核酸檢測(cè)技術(shù)的原理：DNA的G+C含量測(cè)定法。此法是根據(jù)細(xì)菌的DNA中G+C含量的特異性來(lái)進(jìn)行細(xì)菌鑒定，通過(guò)熔解溫度(Tm)法或浮力密度法測(cè)定細(xì)菌DNA中G+C的含量，通過(guò)對(duì)比來(lái)鑒定細(xì)菌。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)分析。此法是一種測(cè)定基因組限制性片段的DNA指紋技術(shù)，通過(guò)PCR選擇性地?cái)U(kuò)增整個(gè)基因組DNA的內(nèi)切酶片段，在分辨率高的聚丙烯酰氨凝膠上電泳，產(chǎn)生一組特異的DNA限制性片段的指紋圖譜。與其他DNA指紋技術(shù)相比有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：可用于各種大小不同的基因組的指紋分析，為研究細(xì)菌屬乃至株間的親緣關(guān)系提供一個(gè)有效手段;具有一定的靈活性，可通過(guò)特異性PCR引物的設(shè)計(jì)和內(nèi)切酶組合的選擇，調(diào)整AFLP圖譜中限制性片段的適宜數(shù)目;由于適用了嚴(yán)格的PCR條件和高分辨率的聚丙烯酰氨凝膠電泳，因而重復(fù)性好，分辨率高；AFLP不僅僅是簡(jiǎn)單的指紋技術(shù)，而且可作為連接遺傳圖譜與物理圖譜間的橋梁而用于基因組的研究。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析。其原理是用限制性內(nèi)切酶將細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行切割，之后在瓊脂糖凝膠上電泳分離，以顯示不同種群基因組DNA的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。RFLP產(chǎn)生的指紋圖譜更適用于細(xì)菌種間及種內(nèi)株間的分型鑒定。隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(RAPD)分析，又稱(chēng)為隨意引物PCR(AP—PCR)。它是一種DNA指紋多態(tài)性分析技術(shù)，其理論依據(jù)是不同的基因組中與隨意引物匹配的堿基序列的位點(diǎn)和數(shù)目可能不同，因而用一組人為設(shè)計(jì)的核苷酸作為引物，通過(guò)PCR隨機(jī)擴(kuò)增可產(chǎn)生物種特異性的DNA帶譜。16SrRNA鑒定。細(xì)菌的核糖體RNA(rRNA)基因高度保守且進(jìn)化速度緩慢，在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中保留了rRNA基因結(jié)構(gòu)和功能的同源性，在微生物染色體上可存在多個(gè)拷貝，以rRNA基因片段為探針可檢出含有rRNA基因的DNA片段。分析雜交后得到的rRNA指紋圖，為菌種定型和近緣菌株的鑒定提供了一種新技術(shù)。針對(duì)rRNA基因的核糖體分型可成功地區(qū)分多個(gè)菌種的相關(guān)菌株，因此該技術(shù)也被廣泛稱(chēng)作核糖體分型技術(shù)。原核生物含有23S、16S和5S三種rRNA，其大小分別約為3000、1500和120個(gè)堿基。其中作為小亞單位核糖體RNA的16SrRNA的大小最適合于核糖體分型。一般完成l6SrRNA序列測(cè)定后，在GenBank中與已知的序列進(jìn)行BLAST分析，從而得出鑒定結(jié)果。4、小結(jié)一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于微生物的檢測(cè)或鑒定應(yīng)當(dāng)至少使用三種指標(biāo)同時(shí)進(jìn)行驗(yàn)證。傳統(tǒng)的分類(lèi)鑒定需要測(cè)定的項(xiàng)目眾多，工作程序繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)。在某些時(shí)候可以配合分子生物學(xué)的方法進(jìn)行鑒定，如在進(jìn)行菌株的血清型鑒定時(shí)，對(duì)于某些國(guó)內(nèi)資源稀缺的菌株定型血清，而進(jìn)口定型血清價(jià)格昂貴，國(guó)內(nèi)可以開(kāi)發(fā)分子生物學(xué)分型方法完成菌株的血清分型工作。而在利用分子生物學(xué)方法鑒定菌株血清型時(shí)，經(jīng)常會(huì)遇到有一些菌株的血清型種類(lèi)繁多，目前還無(wú)法通過(guò)簡(jiǎn)單的核酸測(cè)定完成血清定型工作，如大腸桿菌，僅O抗原就有上百種血清