原核表達的詳細步驟

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原核表達詳細步驟原核表達的詳細步驟最新文檔(可以直接使用，可編輯最新文檔，歡迎下載）PartⅠ選擇表達的目的基因一、基因序列

1.得到靶基因DNA（cDNA）序列，有幾種方式尋找正確的讀碼順序:

①

利用生物信息學在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正確的讀碼。

②

實驗方法，即得到蛋白，進行測序，然后在DNA上找到正確的讀碼。

③

利用mRNA的特征，找到啟動子，編碼區(qū)，終止子。在編碼區(qū)中找到翻譯起始密碼子與終止密碼子（cDNA）。

2.注意事項：

①區(qū)別ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定義，尋找原則是翻譯起始密碼子和終止密碼子；CDS可以是DNA上的定義，也可以是mRNA上的定義，分為completeCDS和partialCDS,是從第一個核酸開始讀，連續(xù)讀下去，completeCDS讀碼是“M、、、、、、、、、＊”，partialCDS的讀碼是相應的AA

②在進行試驗設計時，充分利用生物信息學的信息后，在進行試驗設計。

二、抗原決定簇的預測1、

原理：

蛋白質(zhì)表面部分可以使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的區(qū)域叫抗原決定簇。一般抗原決定簇是由6－12氨基酸或碳水基團組成，它可以是由連續(xù)序列（蛋白質(zhì)一級結構）組成或由不連續(xù)的蛋白質(zhì)三維結構組成。變性蛋白只是天然蛋白伸直的了產(chǎn)物，用來免疫動物具有更強的抗原性。只是天然蛋白中被包在內(nèi)部的抗原決定簇也會暴露出來，如果用該變性抗原制備的抗體來檢測變性抗原是可以的，如果用來檢測天然蛋白，可能會有假陽性。做單抗也可以，同樣道理，篩選出的單抗可能對抗的抗原決定簇處于天然抗原的內(nèi)部，是否能用還要看將來該單抗用來干什么。

2、

選擇原則：

（1）、親水性：大部分抗原決定簇是親水性的。

（2）、處于結構表面：大部分抗體只與蛋白質(zhì)表面部分結合。

（3）、有彈性：許多已知的抗原決定簇是在自由活動區(qū)域。所以一般來說蛋白質(zhì)的N端及C端是很好的抗原決定簇區(qū)域。

3、選定抗原決定簇的步驟：（1）預測：如軟件預測DNAstar（Protean）預測，Dnaman。在線網(wǎng)站預測（and

）

（2）選定：接近N、C端；選取在此區(qū)間內(nèi)，（AntigenicIndex）Jameson-wolf抗原決定簇選正分高處；（Hydrophilicityplot）Kyte-Doolittle預測親水性強的區(qū)域。同時符合以上3點的區(qū)域較好（命名為多肽片斷A）。

注：如果設計的多肽是跨膜蛋白，請盡量回避選擇蛋白的跨膜區(qū)，即頭端信號肽所在的區(qū)域

（3）NCBI（BlastP）比對：將多肽片斷A放入blastp進行同源性比對。如果制備某一動物種屬的抗體，該區(qū)必須與該動物的氨基酸序列沒有較高的同源性。

注：這一步往往容易漏掉，所以學會應用生物信息學，可以減少走彎路?。?！

（4）抗原合成：

①原核表達：

②化學合成：需要做化學偶聯(lián)增強多肽穩(wěn)定性。多肽的純度越純越好，一般>80%就完全可以了。合成5-10mg就可以了。PartⅡ選擇表達系統(tǒng)一、選擇表達載體

1、選擇表達載體的原則

（1）蛋白質(zhì)大?。簺Q定在胞質(zhì)中表達還是以包涵體的形式表達，是否加標簽或以融合蛋白的形式表達。

（2）蛋白需求量：根據(jù)實驗方案確定蛋白需求量，選擇合適的載體。

（3）蛋白質(zhì)是否需要保留活性：有活性的可溶性蛋白表達（胞質(zhì)蛋白），無活性的不溶的蛋白（包涵體蛋白）

2、原核表達載體通常為質(zhì)粒，典型的表達載體應具有以下幾種元件：

（1）選擇標志的編碼序列：用于篩選重組子，有抗生素抗性基因、報告基因（GFP等）

（2）可控轉錄的啟動子：

啟動子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結合并起始RNA合成的序列，它是基因表達不可缺少的重要調(diào)控序列。啟動子的強弱是對表達量有決定影響的因素之一。沒有啟動子，基因就不能轉錄。由于細菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子，因此原核表達載體所用的啟動子必須是原核啟動。

原核啟動子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成，對mRNA的合成極為重要。在轉錄起始點上游5～10bp處，有一段由6～8個堿基組成，富含A和T的區(qū)域，稱為Pribnow盒，又名TATA盒或－10區(qū)。來源不同的啟動子，Pribnow盒的堿基順序稍有變化。在距轉錄起始位點上游35bp處，有一段由10bp組成的區(qū)域，稱為-35區(qū)。轉錄時大腸桿菌RNA聚合酶識別并結合啟動子。-35區(qū)與RNA聚合酶s亞基結合，-10區(qū)與RNA聚合酶的核心酶結合，在轉錄起始位點附近DNA被解旋形成單鏈，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯鍵，以后在RNA聚合酶作用下向前推進，形成新生的RNA鏈。

原核表達系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的啟動子有Lac(乳糖啟動子)、Trp(色氨酸啟動子)、Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動子)、lPL(l噬菌體的左向啟動子)、T7噬菌體啟動子等。

（3）轉錄終止子：

在一個基因的3¢末端或是一個操縱子的3¢末端往往有特定的核苷酸序列，且具有終止轉錄功能，這一序列稱之為轉錄終止子，簡稱終止子(terminator)。轉錄終止過程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前進，RNA的延伸也停止在終止信號上，完成轉錄的RNA從RNA聚合酶上釋放出來。對RNA聚合酶起強終止作用的終止子在結構上有一些共同的特點，即有一段富含A/T的區(qū)域和一段富含G/C的區(qū)域，G/C富含區(qū)域又具有回文對稱結構。這段終止子轉錄后形成的RNA具有莖環(huán)結構，并且有與A/T富含區(qū)對應的一串U。轉錄終止的機制較為復雜，并且結論尚不統(tǒng)一。但在構建表達載體時，為了穩(wěn)定載體系統(tǒng)，防止克隆的外源基因表達干擾載體的穩(wěn)定性，一般都在多克隆位點的下游插入一段很強的rrB核糖體RNA的轉錄終止子。

（4）核糖體結合位點（SD序列）：

1974年Shine和Dalgarno首先發(fā)現(xiàn)，在mRNA上有核糖體的結合位點，它們是起始密碼子AUG和一段位于AUG上游3～10bp處的由3～9bp組成的序列。這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16SrRNA3¢末端的富含嘧啶的序列互補，是核糖體RNA的識別與結合位點。以后將此序列命名為Shine-Dalgarno序列，簡稱SD序列。它與起始密碼子AUG之間的距離是影響mRNA轉錄、翻譯成蛋白的重要因素之一，某些蛋白質(zhì)與SD序列結合也會影響mRNA與核糖體的結合，從而影響蛋白質(zhì)的翻譯。另外，真核基因的第二個密碼子必須緊接在ATG之后，才能產(chǎn)生一個完整的蛋白質(zhì)。

（5）多克隆位點（MCS）：選擇的酶切位點在靶基因上沒有相應的酶切序列，否則在構建重組子進行酶切時會把靶基因給切開。在惠贈或交換的質(zhì)粒中確定MCS的正確性，否則會造成錯讀密碼子。

（6）復制子：通常表達載體都會選用高拷貝的復制子。pSC101類質(zhì)粒是嚴謹方式復制，拷貝數(shù)低，pCoE1，pMBI(pUC)類的復制子（復制起始部位）的拷貝數(shù)高達500以上，是表達載體常用的。通常情況下質(zhì)?？截悢?shù)和表達量是非線性的正相關，當然也不是越多越好，超過細胞的承受范圍反而會損害細胞的生長。如果碰巧需要2個質(zhì)粒共轉化，就要考慮復制元（？）是否相容的問題。

（7）融合Tag：基因融合是將兩個或多個開放閱讀框按一定順序連接起來，并且正確讀碼。在表達靶蛋白是加上融合標簽的好處，（a保護靶蛋白免受原核宿主蛋白酶的降解；b提供親和純化的配基結合位點；c改善靶蛋白的溶解性，使其正確折疊；d與已知酶或抗原結構域連接，可以進行標記和分離；e與信號肽連接，可將融合蛋白分泌到特定細胞區(qū)域。）

注：選擇融合蛋白表達載體時，融合標簽與靶蛋白的連接處如果有酶切位點，且想除去標簽，則載體的酶切序列在靶蛋白中不能出現(xiàn)。

二、選擇表達宿主

首先要看靶基因中有沒有細菌不常用的密碼子——如果有，需要考慮換表達菌株。每種菌株都有自己獨特的設計，或者是蛋白酶缺陷，或者是重組酶缺陷，改造的目的都是為了讓質(zhì)粒在細菌中存在更穩(wěn)定，表達的產(chǎn)物不易被降解。不同的載體要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7RNA聚合酶片段整合在細菌中的菌株才可用于表達。采用不同調(diào)控機制會使用不同的表達菌株，所以換菌株一定要仔細看過載體的調(diào)控方式再換。以Novagen為例，如果使用BL21(DE3)表達不成功的話可以換Rosetta系列菌株，它能夠由一種氯霉素抗性的、與pET相容的質(zhì)粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA的tRNA。所以這類菌株能夠明顯改善大腸桿菌中由于稀有密碼子造成的表達限制。有時不明原因的表達蛋白截短（比預期的分子量要小很多）也可能是由于稀有密碼子造成的。另外一種可能是不嚴謹?shù)谋镜妆磉_產(chǎn)物抑制。1.

原核表達系統(tǒng)（大腸桿菌）

優(yōu)點：①遺傳圖譜明確②容易培養(yǎng)且費用低③對許多外源蛋白耐受能力強④能高水平表達這些蛋白

缺點：①蛋白質(zhì)不能進行翻譯后修飾（在真核高爾基復合體中的糖基化修飾，特點位點的切割等產(chǎn)生具有活性的蛋白）②具有密碼子的偏好（？）

2.

真核表達系統(tǒng)

優(yōu)點：可以產(chǎn)生修飾的蛋白

缺點：①真核表達系統(tǒng)復雜②費用高

注：不同的表達宿主有相應的表達載體，二者應是最佳表達組合。PartⅢ構建重組子一、重組子的構建

1.設計引物：a保證引物序列擴出的靶基因插入到表達載體MCS上，能夠正確讀碼；b引物兩端加入酶切位點；c遵循引物設計原則（一般性引物自動搜索可采用“PremierPrimer5”軟件，而引物的評價分析則可采用“Oligo6”軟件）。

2.

擴增靶基因：

（1）通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環(huán)

獲得所需基因片段。

（2）通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉錄形成cDNA第一鏈，以逆轉錄產(chǎn)物為模板進行

PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

注：但在PCR過程中，需要減少突變的發(fā)生，可采用高保真酶，盡量減少PCR循環(huán)次數(shù)，增加模板和引物的濃度。尤其注意不要引入終止

密碼子。

3.

限制性內(nèi)切核酸酶消化載體DNA和目的基因：

（1）載體雙酶切后回收：將表達質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點）進行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。（減少假陽性的重組質(zhì)粒連接，去除切下的小片段多克隆位點）

（2）PCR產(chǎn)物雙酶切后回收：限制性消化和膠純化是制備插入片段的常規(guī)方法。一般先用PCR擴增帶酶切位點的目標基因，克隆進T－載體，然后用與消化載體相同的內(nèi)切酶進行消化和膠回收。

注：雙酶切后，進行回收純化，可以提高陽性克隆的幾率。

4.連接目的基因和載體

二、重組子的驗證

1.將連接產(chǎn)物轉化到相應的宿主菌（感受肽的制備，轉化）

2.鑒定帶有重組質(zhì)?？寺。撼Ｓ梅椒ǖ挠笑?互補、小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進行酶切分析、PCR以及雜交篩選。如果亞克隆成功，陽性菌落數(shù)遠大于陰性菌落（甚至全部為重組子）。

3.篩選出含重組子的轉化菌落，DNA序列測定。（正確測序）

測序結果出來后，首先，看看載體的多克隆位點和片斷插入的序列，是否有因為酶切連接而意外引入了轉錄終止信號，讀碼是否正確，這是最有說服力的鑒定結果。有時載體幾經(jīng)多個實驗人員的周轉，反復插入片斷，或者是粘端相同的不同酶切片斷之間的連接，會意外在啟動子后面帶入終止位點，特別是用到XbaI之類的酶要小心。

然后要對測序結果進行確定，確定插入的每個堿基都是正確的，沒有意外終止的情況。

注：長期保存的重組子在高濃度甘油（19％）中會導致質(zhì)粒不穩(wěn)定，即脫質(zhì)粒?？梢詫⑤d體和宿主分別保存。PartⅣ誘導表達一、誘導表達1.

誘導表達類型組成型表達：表達載體的啟動子為組成型啟動子，也就是一直努力不停表達目的蛋白的啟動子，如pMAL系統(tǒng)。持續(xù)性表達通常表達量比較高，成本低，但是不適合表達一些對宿主細菌生長有害的蛋白。因為過量或者有害的表達產(chǎn)物會影響細菌的生長，反過來影響表達量的積累。

誘導調(diào)控型表達：表達載體采用誘導型啟動子，只有在誘導劑存在的條件下才能表達目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長前期高表達對菌體生長的影響，又可減少菌體蛋白酶對目標產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達。另外也有啟動子是組成型的，但是啟動子所依賴的轉錄酶是誘導表達的，也屬于誘導表達系統(tǒng)。

融合表達：表達載體的多克隆位點上有一段融合表達標簽（Tag），表達產(chǎn)物為融合蛋白（有分N端或者C端融合表達），方便后繼的純化步驟或者檢測。對于特別小的分子建議用較大的Tag（如GST）以獲得穩(wěn)定表達；而一般的基因多選擇小Tag以減少對目的蛋白的影響。His-Tag是最廣泛采用的Tag。

分泌表達：在起始密碼和目的基因之間加入信號肽，可以引導目的蛋白穿越細胞膜，避免表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的過度累積而影響細胞生長，或者形成包含體，而且表達產(chǎn)物是可溶的活性狀態(tài)不需要復性。通常這種分泌只是分泌到細胞膜和細胞壁之間的周質(zhì)空間。

可溶性表達：大腸桿菌表達效率很高，特別是強啟動子，目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包含體顆粒，包涵體容易純化但是復性效率不高（非常股復雜）。分泌表達可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性，比如Thio，pMAL系統(tǒng)。

2.誘導表達（1）挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2mlLB（含Amp50μg/ml）中37℃過夜培養(yǎng)。

（2）按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大約需3h。

（3）取部分液體作為未誘導的對照組,余下的加入100mMIPTG至終濃度為0.4mM（T7啟動子）或1mM（T7lac啟動子），作為實驗組,兩組繼續(xù)

37℃震蕩培養(yǎng)3h。

（4）分別取菌體1ml,離心12000g×30s收獲沉淀，用PBS重懸、洗滌、離心。

（5）對細菌沉淀進行處理，做SDS等分析。

3.注意事項：

（1）關于表達不出來的原因有很多

a如果測序都是正確的話，設計一個postiveexpressioncontrol，驗證整個表達系統(tǒng)沒問題。

b檢測是否有毒性。涂一個IPTG的板子看菌落生長情況如何。

c看看稀有密碼子情況，是不是存在成簇的N端的稀有密碼子。

d看看穩(wěn)定性，上swissprot看看在大腸桿菌中的穩(wěn)定時間是多少。

e如果表達的是真核蛋白，可能問題更復雜，可能涉及到伴侶蛋白等問題？

f有人會檢測mRNA的穩(wěn)定性。

g可以用親和層析等辦法富集你的目的蛋白，然后再跑膠。因為有時你的目的蛋白表達豐度過低，SDS檢測不到。

（1）提高外源基因表達水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長與外源基因的表達分成兩個階段，以減輕宿主菌的負荷。

（2）IPTG：IPTG濃度0.2-0.5mMIPTG足夠了，不會降低表達量，反而會增加蛋白的可溶性。IPTG濃度過高，易使蛋白表達速度增大，來不及正確折疊而產(chǎn)生不溶性蛋白（包涵體）。T7lac啟動子是嚴謹啟動子，IPTG誘導時可以優(yōu)化最佳濃度（25uM-1mM之間）使目的蛋白達到最佳的活性和溶解性。

（3）溫度：一般37℃誘導3-4小時，30℃誘導6小時是蛋白表達的最大產(chǎn)量期。22℃、18℃、16℃等低溫誘導時間在12h-48h。低溫誘導可使蛋白緩慢合成，利于蛋白正確折疊形成可溶性蛋白。為了得到更多的可溶性蛋白，可以考慮將溫度再降（但表達總量會有所降低），可以考慮25°，誘導8-10個小時；20°誘導14-18個小時；甚至15°24-36小時誘導。

二、檢測誘導表達1.細菌的裂解裂

常用方法有：①高溫珠磨法；②高壓勻漿；③超聲破碎法；④酶溶法；⑤化學滲透等。前三種方法屬機械破碎法，并且方法①、②已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應用，后三種方法在實驗室研究中應用較為廣泛。

下面介紹酶溶法和超聲破碎法結合使用的實驗步驟。

（1）常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3-葡聚糖酶；β-1,6-葡聚糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要對細菌類有作用，而其他幾種酶對酵母作用顯著。4℃，5000rpm離心，15min，收集誘導表達的細菌培養(yǎng)液（30mL）。棄上清，1mL裂解緩沖液，懸浮沉淀，30℃作用1h。

（2）超聲破碎細菌，40w,10s,10s,50次；12000rpm,4℃離心，15min，分別收集上清液和沉淀。分別取少量上清和沉淀，加入等體積的2×凝膠電泳加樣緩沖液，待檢測。

注意事項：超聲破碎與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度、菌種類型等因素有關，應根據(jù)具體情況掌握；超聲波破菌前，標本經(jīng)3-4次凍溶后更容易破碎。

2．進行SDS–PAGE檢測

（1）表達結果：

a細胞質(zhì)中表達；b包涵體形式表達。

（2）包涵體的純化

a包涵體的洗滌；b包涵體的溶解；c包涵體的檢測

從基因角度改造一下，如果能夠去掉一些疏水區(qū)段會很大程度上改善蛋白的可溶性

（4）注意事項

a所有操作盡量在冰上操作，以避免蛋白質(zhì)發(fā)生變性；

b根據(jù)自己的需要選擇不同的表達載體，并注意不同的表達載體上的融合標簽和攜帶的抗性基因，其中有些標簽是可以去除的。具體的序列和說明

都可以從中下載。

c包涵體蛋白溶液保存在四度里，避免反復凍融，否則體系不穩(wěn)定，蛋白以沉淀析出；胞質(zhì)蛋白不能在四度放置很久，因為上清中含有很多蛋白酶，會把靶蛋白降解掉。1.了解實驗課題對目的蛋白的要求包括：目的蛋白分子量有多大，表達目的（是蛋白結晶、藥劑結合還是制備抗體，不同目的對蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞內(nèi)表達還是分泌表達，是組成型表達還是誘導型表達；另外，還要了解蛋白表達后需要采用什么樣的方式進行純化，純化標簽有多大，蛋白純化后是否需要將標簽去除（即標簽的存在是否會影響蛋白的活性）。還要對目的蛋白進行稀有密碼子（僅限于真核生物基因通過原核表達系統(tǒng)表達時參考，注意稀有密碼子的多少，位置5位或3位，稀有密碼子是否成串出現(xiàn)等）和可溶性網(wǎng)上預測等。稀有密碼子預測:///~mmaduro/codonusage/usage.htm:///~sumchan/caltor.html原核表達蛋白可溶性預測綜合以上，選取合適的表達載體及宿主菌。注意：不是所有的標簽都是用來純化蛋白的，有的標簽有促進蛋白溶解的作用，有的則是二硫鍵形成或利于表達后蛋白的檢測。一般我們最常用的是胞內(nèi)誘導型表達（即蛋白翻譯后是存在于細胞內(nèi)，通過加誘導物的方法來控制表達水平）。2.搜索要表達的目的基因的序列，根據(jù)其編碼區(qū)序列來設計引物；注意：要注意在引物上加入限制性內(nèi)切酶識別位點（首先應分析蛋白編碼區(qū)內(nèi)是否含有相同的內(nèi)切酶識別位點），并通過查閱資料看兩種酶（上下游引物分別加入酶切位點）是否可以在同一反應體系中起作用，并注意標簽序列是在N端還是在C端，若要在C端保留標簽，則需要將下游引物的終止密碼子替換掉；若要在引物上引入標簽序列，則引物上應加入標簽序列堿基（即在上游引物或下游引物處引入His的密碼子）；另外，還要注意引物不能造成蛋白的編碼框發(fā)生改變；1，2步的分析至關重要，只有在完成前兩步的工作后才可以進行后續(xù)的實驗操作。3.搖菌，進行RNA抽提（注意選取不同表現(xiàn)型的菌株），搖菌的時間一定不要太長，太長的話RNA活性不高；4.mRNA反轉成cDNA（此步應在第三步完成后立即操作，RNA存放時間長易降解）；5.以cDNA為模板，利于設計好的引物進行PCR擴增；6.通過膠回收試劑盒回收目的DNA片段。真核基因組DNA的克隆

cDNA的克隆化技術的成熟，很多染色體的mRNA互補的序列已弄清楚，為豐富人體遺傳信息庫做出了貢獻。除此以外，真核細胞染色體DNA消化后的片段，合適的載體進行克隆，也是得到目的基因的重要方法。染色體DNA序列大部分含有插入序列，即內(nèi)含子（intron)．內(nèi)含子的數(shù)量不等。而cDNA則僅代表了外顯子(exon）的序列。大腸桿菌等原核細胞不能識別真核細胞染色體DNA的內(nèi)含子，因此其表達研究，僅可應用cDNA，而不能應用真核基因組帶有內(nèi)含子的DNA，基因治療中的目的基因，既可選擇。DNA，也可選擇染色體DNA。

一、染色體DNA克隆的載體

構建染色體DNA文庫并進行克隆的載體有兩大類：入噬菌體載體和粘粒載體。質(zhì)粒載體其容量有限，而染色體DNA由于帶有內(nèi)含子序列而較長；單鏈絲狀噬菌體載體僅用于克隆單鏈DNA,因此質(zhì)粒載體和單鏈絲狀噬菌體載體都不適用干染色體DNA的克隆。

由于粘?？山蛹{近45kb的外源DNA，幾乎是入噬菌體載體載量的2倍，因此，在一個哺乳動物基因組DNA文庫中，僅需350000個重組枯粒，則可望某一特定的單拷貝序列存在于其中的概率達99％。然而，在粘粒中構建和貯存文庫要比在入噬菌體中更困難得多，因而只有當靶基因過大，而不能為單個入噬菌體所包容，或者要分離一系列跨過染色體DNA特大區(qū)段的重疊克隆時，才采用粘粒。染色體DNA克隆最為常用的載體還是入噬菌體載體。

以入噬菌體為基礎構建的載體盡管已是分離眾多真核cDNA及基因組DNA的有力工具，但它們也只能接納大小在一定范圍內(nèi)的插入片段。許多基因由于過于龐大，而不能作為單一片段克隆于這些載體之中，如人凝血因子訊基因長達180kb，肌營養(yǎng)不良基因至少長1800kb，因此需要建立容量更大的克隆載體。

酵母人工染色體（YAC）方法的建立，使克隆DNA大區(qū)段的工作至少有了可循之經(jīng)。使用YAC載體進行克隆時，基因組DNA須在剪切力較小的條件下從實驗組織中小心制備，以便得到平均數(shù)百萬堿基對大小的片段。隨后應用一限制酶（如EcoRD部分消化DNA，以產(chǎn)生平均大小為20。一500kb的大片段‘這些片段再連接到經(jīng)過適當處理以防止自身環(huán)化的YAC載體兩臂上。除EooRI以外，也可用Notl和Mlul一類切點稀少的限制酶進行完全消化。

二、從哺乳動物細胞中分離

高分子量DNA

哺乳功物DNA的分離通常是在有EDTA和SDS一類的去污劑存在！、一l!l蛋白酶K，消化細胞，隨后用酚抽提而實現(xiàn)的。低分子量的雜質(zhì)以透析法加以去除。這一方法獲得的DNA，其大小為100一150kb．適用于以入噬菌體載體構建基因組DNA文庫。然而，若要用粘粒建立基因組DNA文庫，則要求用更大的DNA。

從哺乳動物細胞中分離高分子量的DNA有如下三種辦法。

1．單層貼壁生長或懸浮生長的細胞，組織標本及血液標本中的細胞，利用蛋白酶K,SDS和酚等，可分離純化1。。一1sokb大小的DN段，適用于入噬菌體載體構建DNA文庫。

2．將細胞、組織碎片或血液細胞標本，以蛋白酶K進行消化，應用高濃度甲酞胺使DNA從DNA一蛋白質(zhì)復合物中解離，再通過火棉膠袋透析，去除殘存的蛋白酶K，因而省去酚等有機溶劑抽提等步驟。由于DNA未經(jīng)機械振搖，不通過移液管的操作和酒精沉淀，故其分子量特別大，缺點是收獲率小，DNA濃度低。

3．以鹽酸服裂解細胞，所生成的DNA較短（約SOkb.)，但此法簡便快速，并可用來同時處理不同的細胞或組織中抽提DNA,這一方法制備的DNA盡管不應用于構建基因組DNA文庫，但用于Southem雜交則效果極佳。

三、染色體DNA文庫的建立

不論DNA的堿基組成及序列，而以真正隨機的方式將DNA打斷成片段的唯一方法就是機械剪切。但由此方法制備的染色體DN段的末端，并非用于克隆的粘性末端，需要進一步處理。包括末端的修復、甲基化、與接頭連接并以合適的內(nèi)切酶進行消化以便產(chǎn)生合適的粘性末端。

經(jīng)過機械剪切或限制性內(nèi)切酶的消化，產(chǎn)生的片段長度也不一致，必須通過密度梯度離心純化，才能得到所需的大小的片段。

按照。DNA克隆化中程序的方法，將入噬菌體載體用合適的限制性內(nèi)切酶消化，然后再與處理過的染色體DNA在T4DNA連接酶的作用下進行連接，進行大規(guī)模地包裝反應，并建立預期大·小的基因組DNA文庫。

基因組DNA文庫建立以后，還必須對此文庫進行擴增。

四、染色體DNA文庫的篩選一’

染色體DNA文庫的篩選主要是應用Southern雜交分析方法等。

1．將可疑陽性克隆，快速小量法提取DNA，以同位素或地高辛等標記的探針進行雜交，顯影或顯色分析。

2．入噬菌體噬菌斑的原位雜交先將入噬菌體的噬菌斑在硝酸纖維素膜上或尼龍膜上進行固定，入噬菌體噬菌斑也可以原位進行擴增后再固定．然后對入噬菌體分離物

進行快速分離快速分

析．

3.DNA序列分析克隆的DN段，最后以DNA序列分析，加以證實石河子大學分子生物學實驗結課論文綠色熒光蛋白(GFP)原核表達分析學生姓名學號專業(yè)年級、班級指導教師所在學院中國·新疆·石河子2021年1月綠色熒光蛋白(GFP)原核表達分析摘要：本實驗主要探討目的蛋白（GFP）在大腸桿菌中的表達的情況以及鑒定目的蛋白形成的是包涵體還是可溶性蛋白。本實驗先對菌液進行培養(yǎng)、活化、然后采用IPTG分別對其不同時間點的誘導，用SDS來確定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP誘導不同時間的表達情況的檢測方法。關鍵詞：綠色熒光蛋白；SDS；原核表達1前言實驗目的掌握聚合酶鏈式反應(PCR)的原理和操作方法；了解重組載體的構建方法；鍛煉學生查閱文獻資料、設計與優(yōu)化實驗的能力；加強學生對化學生物學中常用研究方法的認知。實驗背景綠色熒光蛋白（greenfluorescentproteinGFP)是源于多管水母屬等海洋無脊椎動物的發(fā)光蛋白，其在藍光或紫外光下可發(fā)出明亮的綠色熒光，可以作為報告基因檢測蛋白的特異性表達或進行細胞定位研究。與以往lacZ、CAT等報告基因相比，有很多無可比擬的優(yōu)越性:GFP不具有種屬依賴性，在多種原核和真核生物細胞中都表達；熒光強度高，穩(wěn)定性高；不需要反應底物與其他輔助因子，受藍光激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光,尤其適用于體內(nèi)的即時檢測；另外GFP分子量小，易于融合，適用于多種轉化方式，對受體無毒害,安全可靠；并且通過替換一些特殊氨基酸，可以使之產(chǎn)生不同顏色的光，從而適應不同的研究需要。正是由于GFP檢測具有高靈敏度，操作簡單，無需使用同位素等優(yōu)點，近年來廣泛用于基因的表達與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉移以及相互作用、信號傳遞、轉染與轉化，以及細胞的分離與純化等研究領域。綠色熒光蛋白還在監(jiān)測目的基因表達、研究細胞內(nèi)物質(zhì)代謝及追蹤細胞系的分化等方面有著廣泛應用。采用GFP作為標記基因，可直接收集轉化細胞供實驗，縮短了篩選時間、減少對細胞活性的影響并可作為活體標記，為研究發(fā)育的基因調(diào)控和分子機制提供了一種簡潔有效的手段。同時也正因為其熒光反應不是酶反應，所以當細胞本身還存在一些可以受藍光激發(fā)和產(chǎn)生綠色熒光的物質(zhì)，或者GFP表達頻率不高的情況下，GFP的檢測可能會產(chǎn)生一些假相，不易對熒光進行定量的測定。我們利用基因工程手段在大腸桿菌中高效的表達了GFP，制備出GFP抗體，利用抗原與抗體之間的特異性，在體外對GFP進行檢測，可在一定程度上彌補上述GFP檢測中可能出現(xiàn)的問題，可以作為一種重要的輔助手段用以提高GFP檢測的靈敏度和準確度。原核表達是將克隆基因插入合適載體后導入大腸桿菌，用于表達大量蛋白質(zhì)的方法。選用原核表達系統(tǒng)的原因是易于生長和控制、用于細菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動物細胞培養(yǎng)的材料昂貴、有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)?？晒┻x擇。但是在大腸桿菌中表達的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達蛋白的生物學活性及構象。包涵體是在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內(nèi)，形成被膜包裹的結構，具有水不溶性的特點。本實驗主要是通過SDS來檢測綠色熒光的原核表達情況。流程圖：2材料與方法2.1材料2.1.1實驗材料質(zhì)粒DNA;PCR產(chǎn)物、酶切質(zhì)粒、DNAMarker;外源DNA片段：PCR擴增回收目的片段A和PGM-Tvector(Amp’,lacZ),帶限制性內(nèi)切酶末端的DNA溶液（目的片段A和載體片段pBL）;E.coliDH-5α受體菌（R-M-），自提的質(zhì)?；蛑亟M子;重組質(zhì)粒DNA的菌落、BL21;重組GFP質(zhì)粒、標準蛋白。2.1.2實驗儀器PCR儀、PCR管、移液槍、離心機、電泳儀、渦旋振蕩器、冰箱、透射儀、紫外透射儀、刀片、臺式高速離心機、恒溫水浴鍋、微量移液槍、Eppendorf管、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、制冰機、振蕩培養(yǎng)箱、移液器、搖床、酒精燈、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、酒精棉球、滅菌槍頭、分光光度計。2.1.3實驗試劑模板DNA、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、Buffer(內(nèi)含Mg2+)、ddH2O、pGM-T載體、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，其它生化試劑皆為國產(chǎn)分析純。2.2實驗方法2.2.1PCR擴增目的基因片段依次混勻下列試劑，反應體系如下：PCR反應體系各成分的量ddH2O9.5l上游引物1.0l下游引物1.0l模板DNA1.0lTaqDNA聚合酶12.5lTotal25l混勻后瞬時離心(2)將PCR管放入PCR儀中，設定PCR儀的循環(huán)參數(shù)。預變性94℃3min，變性94℃30s，退火52℃30s，延伸72℃40s30個循環(huán)?？傃由?2℃4min；溫度時間預變性94℃3min變性94℃30S退火52℃30S延伸72℃40S總延伸72℃240S(3)PCR擴增完畢后，取出PCR管放在冰盒上；(4)取5l擴增后產(chǎn)物，進行瓊脂糖電泳檢測。2.2.2目的基因片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測（1）加20ml1×TAE緩沖液于三角瓶中；（2）精確稱取0.2g瓊脂糖加到三角瓶中，于微波爐中加熱至完全熔化；（3）冷卻至60℃左右，加1μl的Goldview溶液，搖勻；（4）輕緩倒入封好兩端和加上梳子的電泳膠板中，靜置冷卻30分鐘以上；（5）輕輕拔除梳子，將膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液（TAE），使電泳緩沖液剛好沒過凝膠約1mm；（6）取5μl質(zhì)粒DNA及2μl加樣緩沖液混勻上樣；（7）110v約電泳0.5～1小時；（8）紫外透射儀觀察結果。2.2.3DNA的回收和純化回收PCR產(chǎn)物（采用天根時代DNA回收試劑盒）:（1）用干凈的刀片將需要的DNA條帶從凝膠上切下來，分別放入1.5ml離心管中；（2）以0.1g凝膠對應300μl的體積加入PN;（3）50℃水浴放置10min，期間不斷溫和上下翻動離心管至膠完全溶解；（4）將上述的得到的溶液加入到一個吸附柱中，吸附柱再放入收集管，12000rpm離心60s，棄掉廢液；（5）加入700μl漂洗液PW，12000rpm離心30s，棄掉廢液；（6）加入500μl漂洗液PW，12000rpm離心30s，棄掉廢液；（7）將離心吸附柱放回收集管，12000rpm離心2min；（8）取出吸附柱，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間位置加入適當?shù)南疵摼彌_液EB30μl，洗脫緩沖液先在65℃水浴預熱，冷卻至室溫，12000rpm離心1min，然后將離心的溶液重新加回離心吸附柱中，12000rpm離心1min；（9）電泳檢測回收產(chǎn)物，余置于-20℃下保存。透射儀觀察結果，并拍照。2.2.4重組質(zhì)粒的連接把PCR擴增的目的基因片段產(chǎn)物與pGM-T載體連接，反應體系如下：體系成分體系成分體積(μL)ddH2O3.510×T4DNA1.0目的片段（回收）4.0pGM-T載體0.5T4DNAligase1.0Total10.0大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備采用CaCl2法。（1）將實驗室保存的E.coliDH-5α菌株甘油管用無菌去離子水1:100稀釋后，平板劃線法接種在無抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜，見有菌落長出，用接種環(huán)從平板上挑取一個單菌落，接種到20ml無抗生素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm震蕩培養(yǎng)過夜，活化E.coliDH-5α菌株；（2）按照1%接種量，從上述培養(yǎng)液中吸取菌液2ml，轉瓶接入200ml新鮮的無抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃,200rpm震蕩培養(yǎng)至OD600值為0.5左右；（3）在已滅菌的10ml離心管中吸取上述培養(yǎng)液10ml，冰水浴10min后，4℃、6000rpm離心2min，收集菌體，棄上清；（4）加2ml冰冷預熱的0.1mol/LCacl2溶液，重懸菌體，冰浴10min，4℃、6000rpm離心2min，收集菌體，棄上清；（5）將每一份沉淀輕緩地懸于0.4～1ml含有20%甘油的0.1mol/LCacl2的溶液中，輕輕重懸菌體沉淀，冰上放置10分鐘；（6）分裝100μL/管（冰浴分裝），置于-70℃冰箱中保存。2.2.6連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞(1)轉化用固體LB培養(yǎng)基平板制備：向含100μg/ml氨芐青霉素（AMP）的固體LB培養(yǎng)基平板上加50mg/ml的IPTG16μl和20mg/ml的X-gal40μL，用滅菌彎頭玻璃棒涂布均勻，37℃避光倒置3h，讓溶解X-gal的二甲基甲酰胺盡量揮發(fā)干凈。加入ITPG和X-gal的轉化用平板應避光保存，以防試劑見光分解。（2）連接產(chǎn)物轉化E.coliDH-5α感受態(tài)細胞：①取5μl連接產(chǎn)物加到100μlE.coliDH-5α感受態(tài)細胞中。輕彈混勻，水浴20min。②取出離心管，42℃水浴中熱激90后，立即置冰浴中冷卻5min。③向離心管中加入800μL37℃預熱的無抗生素的LB液體培養(yǎng)基。④取出離心管，12000rpm離心2min，棄上清800μL，用剩余的約100μL上清將沉淀菌體吸打混勻后，在LB平板上涂布ITPG和X-gal。將平板倒置在37℃恒溫箱中培養(yǎng)14h～18h，直至長出菌落，觀察結果。重組質(zhì)粒的菌落鑒定本次實驗所用的pGM-Tvector含Ampr、lacZ基因，所以有重組質(zhì)粒的菌落為白色，沒有重組質(zhì)粒的菌落為藍色。具體操作如下：①挑取菌落：使用無菌槍頭隨即挑取5個白色菌落，放入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基的1.5mlEP管，振蕩培養(yǎng)4h以上，吸取0.5ul菌液作為PCR反應模板，其余繼續(xù)培養(yǎng)。②PCR反應體系與反應程序均與目的基因擴增條件一致。③擴增產(chǎn)物取5ul用1%瓊脂糖凝膠進行檢測。2.2.8提取重組質(zhì)粒將鑒定為陽性重組子的質(zhì)粒EP管挑取出來，按照實驗室提取質(zhì)粒的試劑盒說明書操作。提取后，取5ul用1%瓊脂糖凝膠進行檢測。2.2.9重組質(zhì)粒雙酶切用限制性內(nèi)切核酸酶BamHⅠ和SalⅠ對PCR陽性菌落提取的質(zhì)粒做雙酶切鑒定。酶切反應體系如下表。體系成分體積質(zhì)粒5.0ul去離子水11ul10×BufferT3.0ulBamHⅠ（120U/ul）0.5ulSalⅠ(100U/ul)0.5ul總體積20ul37℃酶切過夜，70℃滅活酶活性。1%瓊脂糖凝膠進行檢測。2.2.10GFP基因重組表達質(zhì)粒及誘導表達（1）將上步經(jīng)酶切鑒定得到的GFP目的片段與表達質(zhì)粒連接，并轉化至大腸桿菌BL21菌株。轉化菌涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)；（2）觀察菌落生長情況，進行菌落PCR鑒定；（3）將鑒定為陽性的菌落接種于20ml含50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖菌培養(yǎng)過夜。（4）按1:100稀釋過夜菌，接種于100ml含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖菌繼續(xù)培養(yǎng)至A600約為0.4-0.8。（5）取部分液體作為未誘導的對照組，余下的加入IPTG誘導劑至終濃度為1mmol/L，于37℃誘導表達。每隔1h分別取菌體1ml，離心12000g，30s得到沉淀，觀察蛋白表達情況。2.2.11SDS檢測誘導表達的蛋白（1）取未誘導、誘導不同時間的培養(yǎng)物500ul于微量離心管中，室溫高速離心1min。沉淀懸浮于100ul1×SDS凝膠加樣緩沖液中，100℃加熱3min，室溫高速離心1min后，冰上放置。（2）安裝電泳裝置，配制12%分離膠倒入凝膠槽，加蒸餾水密封。待凝固后再倒入5%濃縮膠，插上梳子。待凝固后，拔出梳子，放入電泳槽中，上樣，電泳。（3）電泳結束后，將凝膠浸泡在染色液中，室溫在搖床上緩慢染色4h。（4）脫染：將染液回收，凝膠先用蒸餾水漂洗一次后侵入脫染液中脫染，更換幾次脫色液，直至出現(xiàn)清晰的電泳帶。（5）脫色后，將凝膠保存在水中或是含20%甘油的水中；（6）觀察實驗結果。3結果與分析3.1PCR擴增目的基因片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測M為Marker，1-4為PCR擴增產(chǎn)物，產(chǎn)物長度約為750bp，由于實驗疏忽不嚴謹，條帶不明顯且不明確。3.2DNA回收電泳檢測由于操作不當，DNA片段分解了，沒有回收到電泳條帶。3.3連接產(chǎn)物轉化后的藍白斑篩選將目的基因片段與pMD18-T載體連接，并轉化大腸桿菌E.coliDH5α菌株感受態(tài)，37℃，培養(yǎng)16h以后得到藍白斑的菌落，白色菌落即有可能為含重組子的菌落（如下圖）。箭頭所指處為藍色菌落3.4外源基因誘導表達用IPTG誘導表達后呈現(xiàn)綠色，說明含外源基因GFP的質(zhì)粒在大腸桿菌體內(nèi)成功表達。綠色熒光的亮度增加說明隨著誘導時間的增加，GFP基因表達量增加，而沒有經(jīng)IPTG誘導的菌體則不發(fā)出綠色熒光（如下圖）。3.5GFP原核不同條件的誘導表達和檢測將誘導表達的蛋白處理后進行SDS檢測,確定其分子量大小。可以看到，誘導時間不同蛋白表達量不同，條帶顏色不一樣。由于實驗疏忽，電泳條帶不明顯到時實驗失敗。電泳帶淡有三種可能原因：（1）電泳時，點樣后等待時間過長，導致點樣液擴散。（2）目的質(zhì)粒濃度低。（3）機器曝光時間不對。在實驗過程中，等待點樣時間較長，原因1有可能。在電泳帶底部見模糊陰影，可能有雜DNA污染。我們并非在無菌的條件下做實驗，電泳口也可能有雜質(zhì)，PCR時也可能載體自連產(chǎn)生假陽性，這些情況都可能造成目的質(zhì)粒濃度低。其他組的電泳結果也不是很亮，所以還可以調(diào)整曝光時間試試。4心得體會本實驗涉及知識面廣，需要綜合利用分子生物學、化學生物學、基因工程和微生物學中的基礎理論知識和技術，有利于學生對幾個學科間知識的融會貫通。實驗中涉及步驟較多，需要1～2周時間才能完成，因此較適合作為高年級學生的綜合實驗。本實驗對實驗者的實驗技能要求較高，實驗過程中應用到一系列基本操作方法，需使用多種實驗儀器，可以綜合鍛煉學生的實驗技能。在實驗教學過程中，教師要注意加強引導，實施開放式教學，給學生創(chuàng)建一個獨立工作的環(huán)境。同時學生也可通過查閱文獻，對給定的實驗步驟進行優(yōu)化，有利于開闊學生的視野，培養(yǎng)學生解決問題、分析問題的能力。綠色熒光蛋白是現(xiàn)代化學生物學中常用的一種分子成像標記物，被廣泛應用于科學研究中。由于綠色熒光蛋白在紫外光激發(fā)下可以發(fā)出明亮的、肉眼可見的綠色熒光，有利于激發(fā)學生的實驗熱情，提高學生學習化學生物學的興趣。由于本實驗使用可進行親和純化的表達載體，因此也可以進行后續(xù)的蛋白質(zhì)純化及蛋白質(zhì)電泳實驗。參考文獻[1]薛啟漢.綠色熒光蛋白(GFP)的特性及其在分子生物學研究中的應用[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報，1999，01:54-60.[2]唐孝青，李斌，伍小兵，張亮.綠色熒光蛋白及其應用的研究進展[J].陜西農(nóng)業(yè)科學，2007，01:123-124+145.[3]KainSR，AdamsM，KondepudiA，eta.lGreenfluorescentproteinasareporterofgeneexpressionandproteinlocalization.biotechniques，1995，19(4):650[4]PhillipsGJ.Greenfluorescentproteinabrightideaforthestudyofbacterialproteinlocalization.FEMSmicrobialLet，t2001，204(1):9[5]邱金枚，趙玉平.聚丙烯酰胺凝膠電泳常見問題分析與預防措施[J].種子科技，2003，02:43-44.[6]胡曉倩，陳來同，趙健.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳染色方法[J].中國生化藥物雜志，2021，02:128-130.[7]胡承香，張玉純，李磊，顧長國.SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳技術的改良及其應用[J].第三軍醫(yī)大學學報，1996，01:68-70.[8]霍海龍，趙躍，王銳，侯慧芳，李衛(wèi)真，張永云，劉麗仙，王配，霍金龍.綠色熒光蛋白基因原核表達質(zhì)粒pET32a-AcGFP1的構建及其在大腸桿菌中的高效表達[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學)，2021，06:820-825.[9]王藝霖，趙麗偉，李昆志.擬南芥Dof1基因原核表達載體的構建及應用[J].西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版)，2021，02:195-202.[10]趙靜，丁麗華，仇瑋祎，牛暢，陳力權，甘純璣，葉棋濃.GST-His雙標簽原核表達載體的構建及應用[J].生物技術通訊，2021，04:520-522.第一步:對病人進行胸膜腔穿刺術前的準備1。了解病情及穿刺目的，核對適應癥（1)診斷：抽胸水進行實驗室檢查;（2）治療：抽液或抽氣減壓；腹腔內(nèi)注射藥物。觀看有無禁忌癥：（1）嚴重出血疾??；(2）體質(zhì)衰弱不能耐受手術者。2。向病人介紹穿刺目的及其并發(fā)癥，并請其配合,簽署胸膜腔穿刺同意書。3.消除顧慮，必要時可術前半小時服安定10mg或可待因0。03g。4。詢問有無藥物（特別是局麻藥利多卡因）過敏史。5。術前測脈搏、血壓。6。安置病人適當?shù)捏w位，對照輔助檢查再次進行簡單的物理診斷，復核相關的體征，確定穿刺點并以龍膽紫標出進針點。7。囑病人排尿。第二步:胸膜腔穿刺的檢查物品是否齊全1、消毒包和無菌鑷子（消毒日期是否在有效期內(nèi))、消毒缸(0。5％碘伏)。2、一次性胸膜腔穿刺包（消毒日期是否在有效期內(nèi)）.3、藥品:2%利多卡因注射液5ml×1支、0。1％腎上腺素注射液1ml×1支。4、無菌手套2雙、無菌口罩和帽子1付。5、注射器：5ml、20ml、50ml注射器各2具.6、其它：護創(chuàng)膏、血壓計、聽診器、盛胸水的容器及其化驗單。第三步：醫(yī)生的準備1、人文關懷：自我介紹,謝謝病人的配合。2、帶口罩和帽子。3、將病人送到經(jīng)過消毒的治療室。4、當著病人的面洗手（六部洗手法）。操作階段第一步:擺放穿刺體位病人取坐位面向椅背，兩前臂置于椅背上。不能起床者取半臥位，雙前臂上舉抱于枕部。第二步：再次確定穿刺部位1.肋間定位：上述體位下，肩胛下角對應第7～8肋.2.常規(guī)穿刺點：胸部叩診實音最名顯處，常取肩胛線或腋后線7～8肋間.3。特殊穿刺點：包裹性積液可結合X線或B超定位。4。氣胸穿刺點:鎖骨中線第二肋間，下一肋骨上緣。第三步：局部消毒1。查看消毒包和無菌鑷子消毒日期,打開無菌鑷子和消毒包中的消毒碗。2.用無菌鑷子在消毒缸中夾取適量的0。5％碘伏消毒棉球放入消毒碗中.3。左手持無菌鑷子夾起消毒碗中的碘伏消毒棉球，十字交叉?zhèn)鹘o右手中的無菌鑷子（禁止兩個鑷子相碰）.4。右手中的無菌鑷子夾著消毒棉球,按壓標記的穿刺點，以穿刺點為圓心，由內(nèi)向外無間隙劃圓形擦拭，消毒范圍直徑不小于15cm。5.把消毒后的棉球放入第二個空消毒碗中。6.進行第二次消毒：重復3)、4）、5）步驟，(注意第二次的消毒范圍應該略小于第一次，棉球應由內(nèi)向外擦拭）.7.收拾消毒包中的物品，把消毒后的棉球放入醫(yī)療垃圾袋中.第四步：局部麻醉1.術者打開穿刺包，查看消毒日期，戴無菌手套，檢查手術器械（注意注射器乳頭是否與穿刺針吻合，針頭是否銳利）。2.術者鋪洞巾，用止血鉗固定，3。助手協(xié)助術者核對麻藥的名稱及濃度，消毒安瓿，打開麻藥,術者抽取麻藥（注意針頭不能碰到安瓿瓶口）。4。第3次確定穿刺部位，用2％利多卡因在穿刺點處沿下一肋骨上緣行浸潤性局麻。5。先在皮膚局部打個皮丘，再垂直進針，分層麻醉至胸膜壁層（注意推麻藥前要回抽,了解是否在血管內(nèi),同時要掌握深度）。6。麻醉完畢后，按壓片刻,操作過程中要隨時詢問和觀察病人有無不適感覺.第五步：胸膜腔穿刺術1.檢查穿刺針是否銳利,穿刺針連接的橡皮管是否通常和密閉。2。將于穿刺針連接的橡皮管夾閉,用無菌紗布包裹穿刺針后的橡皮管，3。術者再次確定進針點,左手食、中指固定穿刺點皮膚，4。右手持穿刺針沿麻醉處緩慢刺入，當?shù)挚垢型蝗幌r，考慮穿刺成功.5。接上注射器，打開橡皮管，緩慢抽液。6。助手戴無菌手套，待術者抽滿后夾閉橡皮管，如需要,助手可用止血鉗固定針管。7.術者取下注射器，留取適量的胸水放置到檢查容器中，多余的胸水推入盛胸水的容器（注意注射器頭不能碰在容器上)，注意不要出現(xiàn)胸水污染。

8。治療性穿刺：可反復重復5）、6)、7)。9。穿刺完畢后拔出穿刺針，覆蓋無菌紗布,稍用力壓迫片刻，防止出血、氣胸及滲水,針眼處以0。5％碘伏消毒,覆蓋無菌紗布，護創(chuàng)膏固定.注意事項：1.術中密切觀察,如有頭暈、出汗、心悸、劇痛、暈厥等胸膜反應或連續(xù)咳嗽、咳泡沫痰時,立即停止抽液，必要時可皮下注射0。1％腎上腺素0.3～0。5ml。2.一次抽液不可過快，診斷性抽液50～100ml即可；治療性抽液，首次不超過600ml，以后每次不超過1000ml。但若為膿胸，每次應盡量抽凈.3。標本需要做化驗時,應于抽液后立即送檢。欲找瘤細胞之標本送檢不能少于100ml.4.操作中必須嚴格無菌，防止空氣入胸腔，始終保持胸腔負壓。5.要避免在第9肋間以下穿刺，以免損傷腹腔臟器。術后處理1。術后囑病人平臥、詢問病人有無任何不適。2.再次測脈搏、血壓,復核物理體征。3。醫(yī)囑病人穿刺點三天不能沾水。4.收拾醫(yī)療用物，進行醫(yī)療垃圾分類放置。5.感謝病人的配合，護送病人回病房.6.及時送檢胸水標本進行檢查。7。及時書寫穿刺記錄：24小時內(nèi)完成。內(nèi)容包括：1)一般情況（病人信息)。2）手術時體位，皮膚消毒，鋪洞巾的方法.3)手術名稱4)麻醉方式5)手術步驟6）術中病情變化和處理7)術后醫(yī)囑8）標本送檢情況如何實施績效管理步驟

人力資源體系已經(jīng)開始運作，其中最核心模塊的是績效管理，只有通過績效管理的有效實施，才能真正把企業(yè)的目標與員工的價值創(chuàng)造結合起來，把企業(yè)的發(fā)展與員工的發(fā)展結合起來，才能真正讓“選、育、用、留”四大支柱支撐起人力資源的大廈。績效管理與傳統(tǒng)意義上的考核關鍵區(qū)別在于：績效管理的主要目標是改進與提升績效；績效考核是績效管理中的一個環(huán)節(jié)，其主要目的是發(fā)現(xiàn)問題，找到改進點，形成績效的改進計劃與個人發(fā)展計劃?？冃Ч芾淼拿恳徊蕉际菄@這個目的而開展的。

要達成績效管理的目標需要上下的高度重視、全員的參與、長期的堅持，但這并不意味著績效管理是如何復雜。實際上績效管理作為有效的管理工具，從管理的角度來看，恰恰是要將復雜的工作簡單化、程序化，可以用四個字來涵蓋它：“目標+溝通”。通過目標的制定把上級的要求、希望改進提升的方面等清晰地傳遞給下級，并通過溝通達成雙向承諾；通過過程中上下級圍繞目標持續(xù)有效的溝通過程，輔導員工、解決問題、不斷糾偏、客觀評價、達成共贏。

各級管理者是績效管理的第一責任人，績效管理是管理者必須要做的工作，決不是一項“上面布置的額外任務”?？冃Ч芾淼慕Y果客觀反映了管理者管理水平。因此，對績效管理的實施而言，需要各級管理者遵循既定原則，發(fā)揮主觀能動性，把工作做的更好。所謂原則即是不變的東西，即是無論在何種情況下，無論在何種狀態(tài)下都要嚴格遵循的東西。在績效管理中，有三條原則：

1、公正、公平、公開。

2、目標制定由上而下，完成目標的過程由下而上。

3、溝通、溝通、再溝通。

為了達成這三個原則，我們規(guī)定四個環(huán)節(jié)，缺一不可：

第一步：績效計劃——設定績效目標的溝通

實踐證明，目標+溝通的績效管理方式最為有效和實用。只有目標確立了，管理者才清楚怎么去進行有效管理，員工才明白怎么做才是符合公司的要求與公司的發(fā)展相一致的。

績效管理是服務于公司戰(zhàn)略的，所以首先要明確公司的戰(zhàn)略目標與任務是什么。這是管理者和員工對話的一個重要內(nèi)容，管理者必須和員工共同分享公司的目標，然后將公司的目標分解到部門，分解到員工。在充分溝通和協(xié)商的基礎上確立員工的績效目標。具體地講，每個員工都應該擁有一份個性化的關鍵績效目標（KPI）。

確立績效目標其實只有一句話：直接管理者需要下屬部門、員工做什么、改進什么、朝那個方向努力，就將這些要求轉化為相應的指標與目標。同時要注意指標不僅要關注結果(產(chǎn)出)，也關注流程(過程)，不僅關注收益增長，也關注潛力增長。可從以下幾個方面考慮KPI：

1、來源于職位應承擔的責任

2、來源于部門總目標，體現(xiàn)出該職位對總目標的貢獻。

3、來源于業(yè)務流程最終目標，體現(xiàn)出該職位對流程終