細(xì)菌生物被膜的培養(yǎng)、觀測(cè)和耐藥性評(píng)測(cè)技術(shù)指南

細(xì)菌生物被膜的培養(yǎng)、觀測(cè)和耐藥性評(píng)測(cè)技術(shù)指南TechnicalGuidelinesonBiofilmCultivation,ExaminationandResistanceEvaluation1適用范圍

本指南規(guī)定了細(xì)菌生物被膜培養(yǎng)、觀測(cè)和耐藥性評(píng)測(cè)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)條件要求、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施與驗(yàn)證等技術(shù)要求。本指南可作為實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌生物被膜培養(yǎng)與構(gòu)建、觀測(cè)與定量、以及耐藥性評(píng)估等工作的技術(shù)依據(jù)。根據(jù)《中華人民共和國(guó)專利法》，對(duì)于本指南中所涉及專利技術(shù)（US9988380B2，US10416153B2，ZL201711231930.8，CN110974838A）的使用，需獲得專利權(quán)所有人書面許可。2術(shù)語(yǔ)和定義2.1

生物被膜：指細(xì)菌粘附于生物或非生物基質(zhì)表面，分泌胞外多糖、蛋白質(zhì)、胞外DNA等，將細(xì)菌細(xì)胞保護(hù)于其中而形成的膜狀細(xì)菌群落。2.2交叉感染：細(xì)菌或其他微生物從一種物質(zhì)或物體轉(zhuǎn)移到另一種物質(zhì)或物體并產(chǎn)生有害影響的過(guò)程。2.3ColonyFormingUnit(CFU):菌落形成單位，是一種活細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量的測(cè)量方法，以CFU/mL為單位。2.4群體感應(yīng)：指一種細(xì)菌細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，群體感應(yīng)在多種致病菌中控制毒力因子的合成。3細(xì)菌生物被膜培養(yǎng)方法與技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)以下生物被膜培養(yǎng)方法與技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)均以銅綠假單胞菌為模式菌株撰寫，其他菌種培養(yǎng)以及實(shí)驗(yàn)條件可按需求適當(dāng)調(diào)整。3.1體外生物被膜培養(yǎng)(invitrostaticbiofilm)3.1.1體外靜態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法-孔板培養(yǎng)法準(zhǔn)備以下材料：無(wú)菌96孔板（或24孔板,Nest/Corning）；無(wú)菌儲(chǔ)液器；100uL排槍移液器（或1mL移液器）；15mL無(wú)菌搖菌管；100uL（或1mL）移液器槍頭；LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）；所需菌株；廢液桶；75%酒精；無(wú)菌ddH2O；無(wú)菌生理鹽水；培養(yǎng)步驟如下：首先將LB培養(yǎng)基和移液器槍頭在121℃高溫高壓滅菌15-30分鐘，取出并將槍頭干燥備用。將目標(biāo)菌株接種至適當(dāng)體積的LB培養(yǎng)基（例：如所需菌量不多，可接種2mL；所需菌量須以最終所需菌液體積計(jì)算）中，按所需溫度（例：銅綠假單胞菌需37℃或丁香假單胞菌需30℃等）200rpm搖晃培養(yǎng)過(guò)夜。在無(wú)菌操作臺(tái)中，用新鮮培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600nm=0.01-0.05，將稀釋好的菌液傾倒入無(wú)菌儲(chǔ)液器，用排槍移液器將100uL稀釋菌液加入96孔板孔洞中（或1mL移液器將1mL稀釋菌液加入24孔板孔洞中），每株菌至少三個(gè)重復(fù)。將加入菌液的孔板在所需溫度下靜置培養(yǎng)至少16小時(shí)，以形成生物被膜。生物被膜形成后，移除孔洞中所有菌液，用150μLddH2O（結(jié)晶紫染色）或無(wú)菌生理鹽水（死活菌熒光染色）洗兩次，移除所有液體，生物被膜生長(zhǎng)于孔壁上?？装迮囵B(yǎng)法技術(shù)要點(diǎn)：所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過(guò)程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染；在將菌液加入孔板前，輕輕搖晃儲(chǔ)液器將菌液混合均勻，并用排槍反復(fù)輕輕吹打菌液，以減小實(shí)驗(yàn)誤差；孔板培養(yǎng)生物被膜需保證培養(yǎng)后孔洞內(nèi)剩余菌液體積基本一致，培養(yǎng)時(shí)需用透氣封口膜密封孔板防止液體蒸發(fā)；移除廢液以及清洗生物被膜時(shí)須注意不可用槍頭觸碰生物被膜，以保證生物被膜完整性。3.1.2體外動(dòng)態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法-玻璃珠培養(yǎng)法準(zhǔn)備以下材料：無(wú)菌24孔板；無(wú)菌儲(chǔ)液器；1mL移液器15mL無(wú)菌搖菌管；1mL移液器槍頭；LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）；無(wú)菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）；所需菌株；廢液桶；75%酒精；鑷子；3-5mm玻璃珠；培養(yǎng)步驟如下：首先將LB培養(yǎng)基、移液器槍頭、鑷子和玻璃珠在121℃高溫高壓滅菌15分鐘，取出并將槍頭、鑷子與玻璃珠干燥備用。將目標(biāo)菌株接種至適當(dāng)體積的LB培養(yǎng)基中，在所需溫度下200rpm震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。在無(wú)菌操作臺(tái)中，用新鮮LB培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600nm=0.01-0.05。用無(wú)菌鑷子將兩枚玻璃珠轉(zhuǎn)移至同一個(gè)24孔板孔洞內(nèi)，將菌液傾倒入儲(chǔ)液器內(nèi)，在每個(gè)孔洞中加入1mL稀釋菌液，每株菌至少三個(gè)重復(fù)。將加入菌液與玻璃珠的孔板在所需溫度下，100rpm轉(zhuǎn)速搖晃培養(yǎng)至少16小時(shí)，以形成生物被膜。生物被膜在玻璃珠表面形成后，準(zhǔn)備新的24孔板，在孔洞內(nèi)加入1mLddH2O，用無(wú)菌鑷子小心將玻璃珠移入備有ddH2O的24孔板孔洞內(nèi)，慢搖一分鐘清洗，重復(fù)此清洗步驟兩次，將玻璃珠取出置入新的24孔板中，生物被膜附著于玻璃珠表面。玻璃珠培養(yǎng)法技術(shù)要點(diǎn)：所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過(guò)程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染；在將菌液加入孔板前，輕輕搖晃儲(chǔ)液器將菌液混合均勻，并用移液器反復(fù)輕輕吹打菌液，以減小實(shí)驗(yàn)誤差；孔洞內(nèi)菌液不可過(guò)多，以免搖晃培養(yǎng)時(shí)菌液濺出造成交叉污染；用無(wú)菌鑷子轉(zhuǎn)移玻璃珠時(shí)，需盡量減少鑷子與玻璃珠接觸面，以保證生物被膜完整性；孔板培養(yǎng)生物被膜需保證培養(yǎng)后孔洞內(nèi)剩余菌液體積基本一致，培養(yǎng)時(shí)需用透氣封口膜密封孔板防止液體蒸發(fā)；3.1.3體外靜態(tài)/動(dòng)態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法-玻片培養(yǎng)法準(zhǔn)備以下材料：無(wú)菌培養(yǎng)皿（靜置培養(yǎng)需準(zhǔn)備6孔板）；15mL無(wú)菌搖菌管；LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）；無(wú)菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）所需菌株；廢液桶；75%酒精；鑷子；載玻片；培養(yǎng)步驟如下：首先將LB培養(yǎng)基、移液器槍頭、鑷子和載玻片在121℃高溫高壓滅菌15分鐘，取出并將槍頭、鑷子與載玻片干燥備用。將目標(biāo)菌株接種至適當(dāng)體積的LB培養(yǎng)基中，在所需溫度下200rpm搖晃培養(yǎng)過(guò)夜。在無(wú)菌操作臺(tái)中，用新鮮LB培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600nm=0.01，將無(wú)菌載玻片置入培養(yǎng)皿底部，將稀釋菌液傾倒入培養(yǎng)皿，將載玻片于所需溫度下，100rmp搖晃培養(yǎng)至少16小時(shí)，以形成生物被膜（如需靜置培養(yǎng)，可將玻片斜插入孔板中，靜置培養(yǎng)16小時(shí)以上，形成生物被膜）。生物被膜形成后，用無(wú)菌鑷子小心將載玻片轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，用1mLddH2O沖洗載玻片至少3次，移除所有廢液，重復(fù)清洗步驟兩次。將載玻片轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，生物被膜附著于載玻片表面。玻片培養(yǎng)法技術(shù)標(biāo)準(zhǔn):所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過(guò)程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染；培養(yǎng)皿內(nèi)菌液不可過(guò)多，以免搖晃培養(yǎng)時(shí)菌液濺出造成污染；用無(wú)菌鑷子轉(zhuǎn)移載玻片時(shí)，需盡量減少鑷子與玻璃珠接觸面，以保證生物被膜完整性；搖晃培養(yǎng)時(shí)需用透氣封口膜密封培養(yǎng)皿防止液體蒸發(fā)。3.1.4體外動(dòng)態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法-Peglid培養(yǎng)法準(zhǔn)備以下材料：96孔板；Peglid蓋子（見附錄圖三）;無(wú)菌儲(chǔ)液器；100uL排槍移液器；15mL無(wú)菌搖菌管；100uL（或1mL）移液器槍頭；LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）；所需菌株；廢液桶；75%酒精；無(wú)菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）；無(wú)菌生理鹽水；培養(yǎng)步驟如下：首先將LB培養(yǎng)基和移液器槍頭在121℃高溫高壓滅菌15-30分鐘，取出并將槍頭干燥備用。將目標(biāo)菌株接種至適當(dāng)體積的LB培養(yǎng)基（例：如所需菌量不多，可接種2mL；所需菌量須以最終所需菌液體積計(jì)算）中，按所需溫度（例：銅綠假單胞菌需37℃或丁香假單胞菌需30℃等）200rpm搖晃培養(yǎng)過(guò)夜。在無(wú)菌操作臺(tái)中，用新鮮培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600nm=0.01-0.05，將稀釋好的菌液傾倒入無(wú)菌儲(chǔ)液器，用排槍移液器將100uL稀釋菌液加入96孔板孔洞中，每株菌至少三個(gè)重復(fù)，將peglid小心蓋入菌液中，將孔板在所需溫度下100rpm震蕩培養(yǎng)至少16小時(shí)，以形成生物被膜。生物被膜形成后，移除孔洞中所有菌液，用150uLddH2O洗兩次，移除所有液體，生物被膜生長(zhǎng)于peglid中下端。Peglid培養(yǎng)法技術(shù)標(biāo)準(zhǔn):所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過(guò)程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染；在將菌液加入孔板前，輕輕搖晃儲(chǔ)液器將菌液混合均勻，并用排槍反復(fù)輕輕吹打菌液，以減小實(shí)驗(yàn)誤差；孔洞內(nèi)菌液不可過(guò)多，以免置入peglid或震蕩培養(yǎng)時(shí)菌液濺出造成污染；需保證培養(yǎng)后孔洞內(nèi)剩余菌液體積基本一致，培養(yǎng)時(shí)需用透氣封口膜密封孔板防止液體蒸發(fā)；移除廢液以及清洗生物被膜時(shí)須注意不可觸碰生物被膜，以保證生物被膜完整性。3.2體外流式生物被膜培養(yǎng)3.2.1體外流式生物被膜培養(yǎng)方法-管式培養(yǎng)法（tubing-biofilm）準(zhǔn)備以下材料：15mL無(wú)菌搖菌管；長(zhǎng)50cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠管（潤(rùn)澤）；長(zhǎng)25cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠泵管（潤(rùn)澤），雙端安裝等徑直通接頭；長(zhǎng)15cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠管（潤(rùn)澤）；長(zhǎng)10cm，內(nèi)直徑3.2mm硅膠管（潤(rùn)澤）；雙端安裝等徑直通接頭；長(zhǎng)30cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠泵管（潤(rùn)澤）；2個(gè)2L玻璃培養(yǎng)瓶；10%LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）；過(guò)濾器（過(guò)濾孔0.22μm）；無(wú)阻泵（aperistalticpump，MasterFlex）；所需菌株；醫(yī)用尖銳物處理容器；75%酒精；鑷子；5mL無(wú)菌針管；無(wú)菌針頭；移液器；無(wú)菌移液管；管式培養(yǎng)系統(tǒng)搭建：首先將裝有培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶、硅膠管、除泡器和鑷子在121℃高溫高壓滅菌15分鐘，取出并將硅膠管、除泡器和鑷子干燥備用。如圖一所示，在無(wú)菌操作臺(tái)中按順序用安裝雙向接頭的硅膠管b連接裝有培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶、無(wú)阻泵、過(guò)濾器、硅膠管c,d,e,f，2L廢液罐，同個(gè)裝置內(nèi)至少三個(gè)平行（圖內(nèi)展示一個(gè)平行），將整個(gè)系統(tǒng)置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。圖一.管式培養(yǎng)法示意圖。培養(yǎng)步驟如下：將目標(biāo)菌株接種至適當(dāng)體積的LB培養(yǎng)基中，在所需溫度下200rpm搖晃培養(yǎng)過(guò)夜。在無(wú)菌操作臺(tái)中，用新鮮LB培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600nm=0.1，用無(wú)菌針管吸入2mL稀釋菌液，并將稀釋菌液分別注入硅膠管b平行裝置中，用硅膠封口后靜置培養(yǎng)2小時(shí)使細(xì)菌細(xì)胞粘附于管壁,用10%LB流動(dòng)培養(yǎng)基培養(yǎng)3至7天，建立生物被膜。管式培養(yǎng)法技術(shù)要點(diǎn)：所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過(guò)程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染;使用針管與針頭吸取菌液后，針頭不可朝向操作人，不可蓋回針頭蓋子，以免誤傷操作人員；將使用過(guò)的針管與針頭丟棄入醫(yī)用尖銳物處理容器統(tǒng)一處理，避免誤傷操作人員；保證無(wú)阻泵運(yùn)行速度一致，避免液體回流造成污染；保證硅膠管管壁厚度適宜，造成管壁破裂，影響生物被膜形成；在培養(yǎng)過(guò)程中如需添加培養(yǎng)基，須用酒精消毒瓶口與鄰近裝置表面，避免污染；培養(yǎng)瓶口須用透氣封口膜密封防止培養(yǎng)基蒸發(fā)；3.2.2體外流式生物被膜培養(yǎng)方法-池式培養(yǎng)法（flow-cellbiofilm）準(zhǔn)備以下材料：15mL無(wú)菌搖菌管；三通道培養(yǎng)池（3-channelflow-cell）與樹脂蓋；長(zhǎng)50cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠管；長(zhǎng)25cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠泵管，雙端安裝等徑直通接頭；長(zhǎng)15cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠管；長(zhǎng)30cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠泵管；2個(gè)2L玻璃培養(yǎng)瓶；10%LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）；過(guò)濾器（過(guò)濾孔0.22μm）；無(wú)阻泵（aperistalticpump）；所需菌株；醫(yī)用尖銳物處理容器；75%酒精；鑷子；5mL無(wú)菌針管；無(wú)菌針頭；移液器；無(wú)菌移液管；池式培養(yǎng)系統(tǒng)搭建：首先將三通道培養(yǎng)池與蓋子緊密黏結(jié)晾干。將裝有培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶、三通道培養(yǎng)池、硅膠管、除泡器和鑷子在121℃高溫高壓滅菌15分鐘，取出并將培養(yǎng)池、硅膠管、除泡器和鑷子干燥備用。如圖二所示，在無(wú)菌操作臺(tái)中按順序用安裝雙向接頭的硅膠管c連接裝有培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶、無(wú)阻泵、過(guò)濾器、培養(yǎng)池（三個(gè)平行），硅膠管c,d,e,f，2L廢液罐，將整個(gè)系統(tǒng)置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。圖二.池式培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖。培養(yǎng)步驟如下：將目標(biāo)菌株接種至LB培養(yǎng)基中，在所需溫度下200rpm搖晃培養(yǎng)過(guò)夜。在無(wú)菌操作臺(tái)中，用新鮮LB培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600nm=0.1，用無(wú)菌針管吸入1mL稀釋菌液，將600μL稀釋菌液分別從培養(yǎng)池前硅膠管約1cm處注入培養(yǎng)池三個(gè)通道內(nèi)，用硅膠封口后翻轉(zhuǎn)靜置培養(yǎng)2小時(shí)使細(xì)菌細(xì)胞粘附于樹脂池蓋,用10%LB流動(dòng)培養(yǎng)基培養(yǎng)3至7天，建立生物被膜。池式培養(yǎng)法技術(shù)要點(diǎn)：所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過(guò)程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染;使用針管與針頭吸取菌液后，針頭不可朝向操作人，不可蓋回針頭蓋子，以免誤傷操作人員；將使用過(guò)的針管與針頭丟棄入醫(yī)用尖銳物處理容器統(tǒng)一處理，避免誤傷操作人員；保證無(wú)阻泵運(yùn)行速度一致，避免液體回流造成污染；保證培養(yǎng)池翻轉(zhuǎn)狀態(tài)，以免影響生物被膜形成；黏結(jié)培養(yǎng)池與池蓋時(shí)須小心不可將池蓋壓破，并須保證培養(yǎng)池與池蓋完全密封，避免菌液與培養(yǎng)基溢出造成污染；保證培養(yǎng)池所有通道暢通，避免堵塞造成液體回流與污染；在培養(yǎng)過(guò)程中如需添加培養(yǎng)基，須用酒精消毒瓶口與鄰近裝置表面，避免污染；培養(yǎng)瓶口須用透氣封口膜密封防止培養(yǎng)基蒸發(fā)。細(xì)菌生物被膜定量與觀測(cè)技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)4.1生物被膜定量技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)4.1.1生物被膜定量技術(shù)-結(jié)晶紫染色法結(jié)晶紫染色法適用于孔板培養(yǎng)、玻璃珠培養(yǎng)、玻片培養(yǎng)和Peglid培養(yǎng)的生物被膜。準(zhǔn)備以下材料：孔板培養(yǎng)、玻璃珠培養(yǎng)或玻片的生物被膜樣本（參考3.1.1、3.1.2、3.1.3和3.1.4培養(yǎng)方法）；1%結(jié)晶紫溶液；ddH2O；30%冰醋酸；96孔板；24孔板；100μL排槍移液器（或1mL移液器）；100μL（或1mL）移液器槍頭；鑷子；廢液罐；操作流程：孔板培養(yǎng)的生物被膜：在每個(gè)附著有生物被膜的96孔板孔洞中加入125μL的1%結(jié)晶紫溶液（24孔板孔洞中加入1.25mL），室溫靜置15-30分鐘染色。染色后，移除結(jié)晶紫溶液，用ddH2O徹底沖洗多余的結(jié)晶紫溶液，室溫風(fēng)干。在每個(gè)孔洞中加入125uL的30%冰醋酸，100rpm室溫慢搖3分鐘溶解結(jié)晶紫。用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD550nm測(cè)量結(jié)晶紫染色吸光度來(lái)相對(duì)定量生物膜形成。玻璃珠培養(yǎng)的生物被膜：在每個(gè)24孔板孔洞中加入1mL的1%結(jié)晶紫溶液，將附著生物被膜的玻璃珠置入孔洞內(nèi)，室溫靜置15-30分鐘染色。染色后，移除結(jié)晶紫溶液，準(zhǔn)備新的24孔板，在每個(gè)孔洞中加入1.25mLddH2O，將染色后的玻璃珠置入新的24孔板孔洞中，慢搖清洗多余的結(jié)晶紫溶液，重復(fù)清洗步驟三次，將玻璃珠移入新的24孔板孔洞中室溫風(fēng)干。在每個(gè)孔洞中加入1mL的30%冰醋酸，100rpm室溫慢搖3分鐘溶解結(jié)晶紫，移除玻璃珠。用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD550nm測(cè)量結(jié)晶紫染色吸光度來(lái)相對(duì)定量生物膜形成。玻片培養(yǎng)的生物被膜：將動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的玻片生物被膜置于培養(yǎng)皿底部，將1%結(jié)晶紫溶液滴在生物被膜表面，保證完全覆蓋生物被膜（靜態(tài)培養(yǎng)的玻片生物被膜可斜置于盛有1%結(jié)晶紫溶液的6孔板孔洞內(nèi)，保證結(jié)晶紫溶液完全沒(méi)過(guò)生物被膜），室溫靜置15-30分鐘染色。染色后，取出玻片，用2mLddH2O重復(fù)沖洗玻片至少步驟三次，洗除多余結(jié)晶紫溶液。將玻片室溫風(fēng)干，在6孔板每個(gè)孔洞中加入1mL的30%冰醋酸，將染色后的生物被膜浸入冰醋酸中溶解，吸取冰醋酸輕輕吹打溶解未浸入的生物被膜。用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD550nm測(cè)量結(jié)晶紫染色吸光度來(lái)相對(duì)定量生物膜形成。Peglid培養(yǎng)的生物被膜：在96孔板孔洞中加入125uL的1%結(jié)晶紫溶液，將附著有生物被膜的peglid小心置入96孔板內(nèi)，室溫靜置15-30分鐘染色。染色后，將peglid轉(zhuǎn)移至含有125uLddH2O的新96孔板內(nèi)，100rpm慢搖清洗3分鐘，重復(fù)清洗步驟三次去除多余的結(jié)晶紫溶液，將peglid室溫風(fēng)干。取新的96孔板，在每個(gè)孔洞中加入125uL的30%冰醋酸，將peglid置入孔板內(nèi)，100rpm室溫慢搖3分鐘溶解結(jié)晶紫。取出peglid，蓋好96孔板，用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD550nm測(cè)量結(jié)晶紫染色吸光度來(lái)相對(duì)定量生物膜形成。結(jié)晶紫染色法技術(shù)要點(diǎn)：所有操作須嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)操作流程，在操作醋酸過(guò)程中，需嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)操作流程，避免誤傷操作人員;染色過(guò)程中，結(jié)晶紫溶液體積須覆蓋全部生物被膜生長(zhǎng)區(qū)域，減少誤差；染色后，須徹底沖洗懸浮的結(jié)晶紫溶液，減少誤差；移液過(guò)程中，須注意不可用移液器槍頭直接觸碰生物被膜，以保持生物被膜完整性；結(jié)晶紫溶液廢液與醋酸溶液廢液須分別傾倒至指定廢液罐內(nèi)另行處理，不可隨意傾倒或按照普通液體處理；4.1.2生物被膜定量技術(shù)-死活菌細(xì)胞（Syto9/PI）染色法此方法適用于孔板培養(yǎng)、玻片培養(yǎng)和流式培養(yǎng)的生物被膜。此方法可染色定量生物被膜內(nèi)的活菌細(xì)胞和死菌細(xì)胞。準(zhǔn)備以下材料：孔板培養(yǎng)、玻片培養(yǎng)和流式培養(yǎng)的生物被膜樣本（參考3.1.1、3.1.3和3.2培養(yǎng)方法）；96孔板；培養(yǎng)皿；100uL移液器（或1mL移液器）；100uL（或1mL）移液器槍頭；注射器及注射針頭；鑷子；廢液罐；活死細(xì)胞染色試劑盒（L7012,Thermofisher,USA）或Syto9/PI染色劑（S34854,P3566,Thermofiser,USA）0.85%氯化鈉溶液操作流程：孔板培養(yǎng)的生物被膜：將每個(gè)附著有生物被膜的96孔板孔洞沖洗后，加入125μLSyto9/PI染色劑（工作濃度為3.34μM/20mM)室溫靜置避光染色15分鐘。用熒光顯微鏡觀察生物被膜形態(tài)并相對(duì)定量。玻片培養(yǎng)的生物被膜：將附著有生物被膜的玻片置于培養(yǎng)皿中，加入適量Syto9/PI染色劑（工作濃度為3.34μM/20mM)，以覆蓋住生物被膜生長(zhǎng)區(qū)域?yàn)橐?，室溫靜置15分鐘染色。用熒光顯微鏡觀察生物被膜形態(tài)并相對(duì)定量。池式培養(yǎng)的生物被膜：用燕尾夾將附著有生物被膜的培養(yǎng)池流入端和流出端的硅膠管固定后，將培養(yǎng)池從培養(yǎng)系統(tǒng)中小心取出，置于水平臺(tái)面上。將流出端燕尾夾移除，用注射器將0.5mLSyto9/PI染色劑（工作濃度為3.34μM/20mM)緩慢地從流入端注射進(jìn)入培養(yǎng)池中，注射完畢后將流出端用燕尾夾固定。室溫靜置避光染色15分鐘染色。用熒光顯微鏡觀察生物被膜形態(tài)并相對(duì)定量。Syto9/PI染色法技術(shù)要點(diǎn)：用熒光顯微鏡觀察生物被膜需要使用共聚焦培養(yǎng)皿類的平板，例如8-wellμ-slides(80826，ibidi)所有操作須嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)操作流程，在操作染色劑過(guò)程中，需嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)操作流程，避免誤傷操作人員;染色過(guò)程中，染色液體積須覆蓋全部生物被膜生長(zhǎng)區(qū)域，減少誤差；移液過(guò)程中，須注意不可用移液器槍頭直接觸碰生物被膜，以保持生物被膜完整性；染色完成后，應(yīng)避免劇烈震蕩，并須注意在三小時(shí)內(nèi)進(jìn)行熒光顯微鏡觀察，以免生物被膜結(jié)構(gòu)收到損傷而造成誤差；染色液廢液須傾倒至指定廢液罐內(nèi)另行處理，不可隨意傾倒或按照普通液體處理；4.1.3生物被膜定量技術(shù)-CFU計(jì)數(shù)法此方法適用于孔板培養(yǎng)、玻璃珠培養(yǎng)、玻片培養(yǎng)和管式培養(yǎng)的生物被膜。此方法可檢測(cè)生物被膜中存活的細(xì)菌數(shù)量。準(zhǔn)備以下材料：孔板培養(yǎng)、玻璃珠培養(yǎng)、玻片培養(yǎng)、peglid培養(yǎng)和管式培養(yǎng)的生物被膜樣本（參考3.1.1、3.1.2、3.1.3、3.1.4和3.2.1培養(yǎng)方法）；24孔板；無(wú)菌培養(yǎng)皿；無(wú)菌刮刀；2mL和10mL無(wú)菌離心管；無(wú)菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）；LB瓊脂平板（或按菌株需要，準(zhǔn)備其他培養(yǎng)基瓊脂平板）100μL移液器和1mL移液器；100μL和1mL移液器槍頭；10mL無(wú)菌針管；鑷子；廢液罐；超聲水浴儀（Elma,ElmasonicP120H）；操作流程：孔板培養(yǎng)的生物被膜：在無(wú)菌操作臺(tái)中，將附著有生物被膜的孔板孔洞內(nèi)加入150μLddH2O（如用24孔板，則加入1.25mLddH2O）清洗兩次去除懸浮細(xì)菌，移除所有上清液，再加入100uLddH2O（如用24孔板，則加入1mLddH2O）。將孔板用透氣封口膜密封，用超聲水浴儀，在37kHz，100%power，震蕩10分鐘。在水浴儀內(nèi)加冰以防止溫度過(guò)高。超聲后，將孔洞內(nèi)菌液以10倍連續(xù)稀釋至10-7，從10-4至10-7稀釋液中取100μL涂布在LB瓊脂平板上，至少三個(gè)重復(fù)，將涂好的平板在無(wú)菌操作臺(tái)中晾干表面，在所需溫度下將涂有菌液的平板靜置培養(yǎng)至少16小時(shí)，取出平板計(jì)算菌落數(shù)量以定量孔板生物被膜中的細(xì)菌量。玻璃珠培養(yǎng)的生物被膜：在無(wú)菌操作臺(tái)中，將附著有生物被膜的玻璃珠置于24孔板空洞內(nèi)，每孔兩個(gè)珠子。加入1.5mLddH2O清洗兩次去除懸浮細(xì)菌。用超聲水浴儀，在37kHz，100%power，震蕩10分鐘。在水浴儀內(nèi)加冰以防止溫度過(guò)高。超聲后，將玻璃珠小心移除，把孔洞內(nèi)的菌液轉(zhuǎn)移至2mL離心管內(nèi)，5000rpm室溫離心5分鐘，移除上清液并將細(xì)菌重懸在1mLddH2O中。以10倍連續(xù)稀釋至10-7，從10-4至10-7稀釋液中取100uL涂布在LB瓊脂平板上，至少三個(gè)重復(fù)，將涂好的平板在無(wú)菌操作臺(tái)中晾干表面，在所需溫度下將涂有菌液的平板靜置培養(yǎng)至少16小時(shí)，取出平板計(jì)算菌落數(shù)量以定量玻璃珠生物被膜中的細(xì)菌量。玻片培養(yǎng)的生物被膜:在無(wú)菌操作臺(tái)中，將附著有生物被膜的玻片置于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用無(wú)菌刮刀將附著在玻片上的的生物被膜輕輕刮下，轉(zhuǎn)置于2mL無(wú)菌離心管內(nèi)，加入1mLddH2O并用移液槍反復(fù)吹打生物被膜細(xì)菌。用超聲水浴儀，在37kHz，100%power，震蕩10分鐘。在水浴儀內(nèi)加冰以防止溫度過(guò)高。超聲后，5000rpm室溫離心5分鐘，移除上清液并將細(xì)菌重懸在1mLddH2O中。以10倍連續(xù)稀釋至10-7，從10-4至10-7稀釋液中取100μL涂布在LB瓊脂平板上，至少三個(gè)重復(fù)，將涂好的平板在無(wú)菌操作臺(tái)中晾干表面，在所需溫度下將涂有菌液的平板靜置培養(yǎng)至少16小時(shí)，取出平板計(jì)算菌落數(shù)量以定量玻片生物被膜中的細(xì)菌量。Peglid培養(yǎng)的生物被膜：在無(wú)菌操作臺(tái)中，將附著有生物被膜的peglid置入含有125uLddH2O的96孔板內(nèi)，100rpm慢搖清洗兩次去除懸浮細(xì)菌。將peglid轉(zhuǎn)移至新的含有100uLddH2O的96孔板內(nèi)，將孔板用透氣封口膜密封，用超聲水浴儀，在37kHz，100%power，震蕩10分鐘。在水浴儀內(nèi)加冰以防止溫度過(guò)高。超聲后，移出peglid，將孔洞內(nèi)菌液以10倍連續(xù)稀釋至10-7，從10-4至10-7稀釋液中取100uL涂布在LB瓊脂平板上，至少三個(gè)重復(fù)，將涂好的平板在無(wú)菌操作臺(tái)中晾干表面，在所需溫度下將涂有菌液的平板靜置培養(yǎng)至少16小時(shí)，取出平板計(jì)算菌落數(shù)量以定量孔板生物被膜中的細(xì)菌量。管式培養(yǎng)的生物被膜：將附著有生物被膜的硅膠管從培養(yǎng)系統(tǒng)中小心取出。在無(wú)菌操作臺(tái)中，用兩支10mL無(wú)菌針管，分別吸入2.5mLddH2O，將針管分別小心插入硅膠管兩端，從一側(cè)慢慢將ddH2O注入硅膠管內(nèi)，將生物被膜推入另一側(cè)針管內(nèi)，兩側(cè)交替重復(fù)此步驟數(shù)次至完全洗脫生物被膜。將洗脫的生物被膜轉(zhuǎn)移至10mL離心管內(nèi)，5000rpm室溫離心3分鐘并移除上清液，用2mLddH2O清洗兩次生物被膜并重新懸浮在1毫升ddH2O內(nèi)，用超聲水浴儀，在37kHz，100%power，震蕩10分鐘。在水浴儀內(nèi)加冰以防止溫度過(guò)高。超聲后，將菌液以10倍連續(xù)稀釋至10-7，從10-4至10-7稀釋液中取100uL涂布在LB瓊脂平板上，至少三個(gè)重復(fù)。將涂好的平板在無(wú)菌操作臺(tái)中晾干表面，在所需溫度下將涂有菌液的平板靜置培養(yǎng)至少16小時(shí)，取出平板計(jì)算菌落數(shù)量以定量管式生物被膜中的細(xì)菌量。CFU計(jì)數(shù)法技術(shù)要點(diǎn)：所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過(guò)程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染;所有超聲破碎步驟須在冰上操作或在儀器中加入碎冰以保持低溫，避免溫度過(guò)高影響細(xì)菌活性；此處使用的超聲水浴條件只限于CFU計(jì)數(shù)法使用，如后續(xù)需進(jìn)行其他步驟，超聲條件須按需調(diào)整；涂布稀釋菌液須選擇多個(gè)稀釋濃度，靜置培養(yǎng)后選擇菌落數(shù)量在30-300個(gè)的稀釋濃度作為計(jì)數(shù)濃度，避免菌落數(shù)量過(guò)低或過(guò)高導(dǎo)致誤差；涂布好的平板在培養(yǎng)前須晾干表面，并在培養(yǎng)過(guò)程中倒置與培養(yǎng)箱內(nèi)，避免生成水珠滴在平板表面，影響計(jì)數(shù)結(jié)果；如細(xì)菌須36小時(shí)以上的培養(yǎng)時(shí)間，須用透氣封口膜密封平板，防止瓊脂蒸發(fā)造成干裂影響計(jì)數(shù)結(jié)果。4.1.4生物被膜定量技術(shù)-干重/濕重定量法此方法適用于玻片培養(yǎng)和管式培養(yǎng)的生物被膜。此方法可計(jì)算生物被膜內(nèi)所有物質(zhì)總重量，包括細(xì)菌、胞外多糖等。準(zhǔn)備以下材料：玻片培養(yǎng)和管式培養(yǎng)的生物被膜樣本（參考3.1.3和3.2.1培養(yǎng)方法）；無(wú)菌培養(yǎng)皿；無(wú)菌刮刀；無(wú)菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）；2mL和10mL無(wú)菌離心管；100μL移液器和1mL移液器；100μL和1mL移液器槍頭；10mL無(wú)菌針管；廢液罐；SpeedVac恒溫干燥儀；操作流程：玻片培養(yǎng)的生物被膜:先將準(zhǔn)備好的2mL無(wú)菌離心管稱重并記錄。在無(wú)菌操作臺(tái)中，將附著有生物被膜的玻片置于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用無(wú)菌刮刀將附著在玻片上的的生物被膜輕輕刮下，轉(zhuǎn)置于2mL無(wú)菌離心管內(nèi)，將生物被膜樣品在5000rpm室溫狀態(tài)下離心3分鐘，移除所有上清液。將離心管外壁擦拭干凈并晾干后稱重，用總重量減去離心管重量可得到生物被膜濕重。（若需生物被膜干重，將生物被膜離心并移除上清液后，在SpeedVac恒溫狀態(tài)下將生物被膜徹底干燥后稱重定量，干燥溫度可按實(shí)驗(yàn)需求設(shè)定，如需低溫4℃或室溫25℃等）管式培養(yǎng)的生物被膜：先將準(zhǔn)備好的10mL無(wú)菌離心管稱重并記錄。在無(wú)菌操作臺(tái)中，將附著有生物被膜的硅膠管從培養(yǎng)系統(tǒng)中小心取出，用兩支10mL無(wú)菌針管，分別吸入2.5mLddH2O，將針管分別小心插入硅膠管兩端，從一側(cè)慢慢將ddH2O注入硅膠管內(nèi)，將生物被膜推入另一側(cè)針管內(nèi)，兩側(cè)交替重復(fù)此步驟數(shù)次至完全洗脫生物被膜。將洗脫的生物被膜轉(zhuǎn)移至10mL離心管內(nèi)，5000rpm室溫離心3分鐘并移除上清液，將離心管外壁擦拭干凈并晾干后稱重，用總重量減去離心管重量可得到生物被膜濕重。（若需生物被膜干重，將生物被膜離心并移除上清液后，在SpeedVac恒溫狀態(tài)下將生物被膜徹底干燥后稱重定量，干燥溫度可按實(shí)驗(yàn)需求設(shè)定，如需低溫4℃或室溫25℃等）干重/濕重定量法技術(shù)要點(diǎn)：所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過(guò)程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染;如需測(cè)生物被膜濕重，須盡量移除所有上清液，以避免上清液遺留太多影響稱重結(jié)果或造成誤差過(guò)大；如需測(cè)量生物被膜濕重，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所有操作步驟溫度需要嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)需求設(shè)定，避免影響后續(xù)分析；如需測(cè)量生物被膜干重，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所有操作步驟以及干燥溫度須嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)需求設(shè)定，避免影響后續(xù)分析；離心后，須將離心管外壁的水汽徹底干燥后再稱重，避免凝結(jié)的水汽影響稱重結(jié)果或造成誤差過(guò)大。4.1.5生物被膜定量技術(shù)-3D成像COMSTAT/IMARIS定量法此方法適用于激光共聚焦熒光顯微鏡拍攝的生物被膜。準(zhǔn)備以下材料：激光共聚焦熒光顯微鏡拍攝的3D生物被膜圖像（參考4.2.1觀測(cè)方法）；操作流程：Comstat2定量分析：用ImageJ軟件打開激光共聚焦熒光顯微鏡圖像，將原始文件格式轉(zhuǎn)為OME-Tiff格式，并將同一分組的所有OME-Tiff文件存在同一個(gè)子文件夾內(nèi)；打開Comstat2分析軟件，將文件夾路徑指定為保存好的子文件夾，導(dǎo)入該分組的所有OME-Tiff圖像文件；設(shè)置threshold，計(jì)算Biomass,surfacecoverage,thickness等生物被膜形態(tài)相關(guān)的關(guān)鍵參數(shù)。Imaris定量分析：打開Imaris軟件進(jìn)入Arena功能區(qū)，將要分析的圖像文件所在的文件夾導(dǎo)入Arena功能區(qū)，選擇其中一個(gè)圖像，調(diào)整threshold并保存參數(shù)，回到Arena功能區(qū)，用保存的參數(shù)進(jìn)行batchprocessing。3D成像COMSTAT/IMARIS定量法技術(shù)要點(diǎn)使用batchprocessing之前，threshold要逐一查看，以免引起計(jì)算誤差調(diào)整完參數(shù)的文件需要另存為副本，以免造成原始文件覆蓋使得信息丟失4.2生物被膜觀測(cè)技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)4.2.1生物被膜觀測(cè)技術(shù)-激光共聚焦熒光顯微鏡觀察法此方法適用于熒光染色或熒光標(biāo)記的玻片培養(yǎng)及池式培養(yǎng)的生物被膜。準(zhǔn)備以下材料：玻片培養(yǎng)以及池式培養(yǎng)的具有熒光蛋白標(biāo)記的生物被膜樣本（參考3.1.3和3.2.2培養(yǎng)方法），或熒光染色的玻片培養(yǎng)以及池式培養(yǎng)的生物被膜樣本（參考4.1.2染色方法）操作流程：將生物被膜樣本置于激光共聚焦熒光顯微鏡的載物臺(tái)上，通過(guò)光學(xué)目鏡找到合適的視野和焦點(diǎn)；選擇熒光蛋白/熒光染色劑匹配的激光源和濾波片參數(shù)，調(diào)整激光源強(qiáng)度和信號(hào)放大器強(qiáng)度，找到高信噪比的參數(shù)集；確定拍攝的最低表面和最高表面，設(shè)置最佳z-軸拍攝間距，進(jìn)行z-stack掃描拍攝，并收集圖像信息。共聚焦顯微鏡技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)：為保證統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)有效性和可重復(fù)性，每個(gè)樣品須通過(guò)隨機(jī)采樣法對(duì)生物被膜培養(yǎng)區(qū)域拍攝不少于5個(gè)視野的生物被膜。觀測(cè)前生物被膜須以進(jìn)行熒光染色，如不經(jīng)染色，則須使用攜帶熒光標(biāo)記的細(xì)菌菌株；熒光染色劑/熒光蛋白標(biāo)記的熒光信號(hào)，須跟所用的激光共聚焦熒光顯微鏡的激光通道相匹配，且進(jìn)行多熒光通道染色/標(biāo)記時(shí)須避免激發(fā)光/吸收光相近的通道，以免造成誤差；在使用激光共聚焦熒光顯微鏡時(shí)，應(yīng)避免載物臺(tái)震動(dòng)引起的誤差；在使用激光共聚焦熒光顯微鏡時(shí)，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整激光源能量，較高的能量容易引發(fā)熒光信號(hào)猝滅，造成誤差。如需使用熒光探針觀測(cè)生物膜，具體參考專利（US10416153B2）。4.2.2生物被膜觀測(cè)技術(shù)-電子顯微鏡（SEM）此方法適用于流式培養(yǎng)的生物被膜。準(zhǔn)備以下材料：管式培養(yǎng)的生物被膜樣本（參考3.2.1培養(yǎng)方法）；玻片培養(yǎng)生物被膜樣本（參考3.1.3培養(yǎng)方法）操作流程：管式培養(yǎng)的生物被膜：從管式生物被膜系統(tǒng)中將附著有生物被膜的硅膠管小心取出。將附著有生物被膜的培養(yǎng)管用無(wú)菌切刀切成0.5mm大小.2.5%戊二醛，乙醇梯度脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，并按標(biāo)準(zhǔn)步驟濺射涂金。玻片培養(yǎng)的生物被膜：將載有生物被膜的玻片小心取出，2.5%戊二醛，乙醇梯度脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，將玻片切成0.5mm大小，并按標(biāo)準(zhǔn)步驟濺射涂金。電子顯微鏡技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)：觀測(cè)前生物被膜須以2.5%戊二醛室溫固定1h后，放置于4℃冰箱保存（不要超過(guò)1周）；乙醇梯度脫水。樣品先用蒸餾水清洗三次，每次7min，然后依次用50%、70%、85%及95%、100%的乙醇分別處理12min，最后再用無(wú)水乙醇處理三次，每次15min。CO2臨界點(diǎn)干燥及噴金操作，按儀器使用說(shuō)明進(jìn)行即可。細(xì)菌生物被膜耐藥性檢測(cè)方法與評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)5.1細(xì)菌生物被膜耐藥性檢測(cè)方法-最小抑菌濃度法此方法適用于孔板培養(yǎng)以及玻璃珠培養(yǎng)的生物被膜。準(zhǔn)備以下材料：孔板培養(yǎng)、玻璃珠培養(yǎng)和peglid培養(yǎng)的生物被膜（參考3.1.1、3.1.2和3.1.4培養(yǎng)方法）；所需抗生素（或其他抑菌化合物）；100μL排槍移液器；100μL移液器槍頭；96孔板、24孔板；無(wú)菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）；無(wú)菌LB培養(yǎng)基（或按菌株所需其他培養(yǎng)基）；LB瓊脂板；廢液桶；操作流程：孔板培養(yǎng)的生物被膜：在無(wú)菌操作臺(tái)中，用適當(dāng)體積的LB培養(yǎng)基將所需抗生素溶解至起始濃度為100μμg/mL（可按需調(diào)整起始濃度），用0.2μm過(guò)濾膜過(guò)濾后，2倍連續(xù)稀釋得到適當(dāng)體積的50μμg/mL，25μμg/mL，12.5μμg/mL，6.25μμg/mL，3.125μμg/mL，1.562μμg/mL和0μμg/mL（僅培養(yǎng)基）。移除孔板生物被膜中全部上清液，用ddH2O清洗兩次，移除所有廢液。將100uL體積（24孔板生物被膜取1mL）的100μμg/mL至0μμg/mL全部稀釋濃度的抗生素溶液分別添加至孔洞中，每濃度至少3個(gè)重復(fù)，在菌株生長(zhǎng)所需溫度下靜置培養(yǎng)16-24小時(shí)（可根據(jù)菌株生長(zhǎng)或?qū)嶒?yàn)?zāi)康倪m當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)時(shí)間）。取出孔板，用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD650nm測(cè)量孔洞中菌液濃度，OD650nm<0.1代表細(xì)菌生長(zhǎng)被抑制。移除孔洞內(nèi)菌液，將孔洞中生物被膜用ddH2O清洗兩次，洗脫懸浮細(xì)菌。之后，按4.1.3a部分CFU計(jì)數(shù)法操作方法，定量抗生素處理后的生物被膜細(xì)菌CFU數(shù)量，計(jì)算抗生素最小抑菌濃度。玻璃珠培養(yǎng)的生物被膜：在無(wú)菌操作臺(tái)中，用適當(dāng)體積的LB培養(yǎng)基將所需抗生素溶解至起始濃度為100μμg/mL（可按需調(diào)整起始濃度），用0.2μm過(guò)濾膜過(guò)濾后，2倍連續(xù)稀釋得到適當(dāng)體積的50μμg/mL，25μμg/mL，12.5μμg/mL，6.25μμg/mL，3.125μμg/mL，1.562μμg/mL和0μμg/mL（僅培養(yǎng)基）。將附著有生物被膜的玻璃珠轉(zhuǎn)移至新的24孔板中，用ddH2O清洗兩次后轉(zhuǎn)移至新的24孔板。將1mL的100μμg/mL至0μμg/mL全部稀釋濃度的抗生素溶液分別添加至孔洞中，每濃度至少3個(gè)重復(fù)，在菌株生長(zhǎng)所需溫度下以100rpm轉(zhuǎn)速慢搖培養(yǎng)16-24小時(shí)（可根據(jù)菌株生長(zhǎng)或?qū)嶒?yàn)?zāi)康倪m當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)時(shí)間）。取出孔板并將玻璃珠轉(zhuǎn)移至新的24孔板內(nèi)，用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD650nm測(cè)量孔洞中菌液濃度，OD650nm<0.1代表細(xì)菌生長(zhǎng)被抑制。之后，將玻璃珠用ddH2O清洗兩次，洗脫懸浮細(xì)菌。之后，按4.1.3b部分CFU計(jì)數(shù)法操作方法，定量抗生素處理后的生物被膜細(xì)菌CFU數(shù)量，計(jì)算抗生素最小抑菌濃度。Peglid培養(yǎng)的生物被膜：在無(wú)菌操作臺(tái)中，用適當(dāng)體積的LB培養(yǎng)基將所需抗生素溶解至起始濃度為100μμg/mL（可按需調(diào)整起始濃度），用0.2μm過(guò)濾膜過(guò)濾后，2倍連續(xù)稀釋得到適當(dāng)體積的50μμg/mL，25μμg/mL，12.5μμg/mL，6.25μμg/mL，3.125μμg/mL，1.562μμg/mL和0μμg/mL（僅培養(yǎng)基），將100μL體積的100μμg/mL至0μμg/mL全部稀釋濃度的抗生素溶液分別添加至孔洞中，每濃度至少3個(gè)重復(fù)，將附著有生物被膜的peglid小心置入抗生素溶液中，在菌株生長(zhǎng)所需溫度下靜置培養(yǎng)16-24小時(shí)（可根據(jù)菌株生長(zhǎng)或?qū)嶒?yàn)?zāi)康倪m當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)時(shí)間）。取出peglid，蓋好96孔板，用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD650nm測(cè)量孔洞中菌液濃度，OD650nm<0.1代表細(xì)菌生長(zhǎng)被抑制。同時(shí)，將peglid生物被膜用ddH2O清洗兩次，洗脫懸浮細(xì)菌。之后，按4.1.3d部分CFU計(jì)數(shù)法操作方法，定量抗生素處理后的生物被膜細(xì)菌CFU數(shù)量，計(jì)算抗生素最小抑菌濃度。最小抑菌濃度法評(píng)定要點(diǎn)：所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過(guò)程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染;抗生素需按照特性溶解于不同溶液中：如四環(huán)素溶于乙醇中，僅微溶于水等；后稀釋于所需培養(yǎng)基；懸浮細(xì)菌須徹底清洗，以免影響最終評(píng)測(cè)結(jié)果；抗生素起始濃度和加入抗生素后培養(yǎng)時(shí)間須按抗生素特性如時(shí)間依賴性或濃度依賴性進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整；最小抑菌濃度須按抑制99.9%的細(xì)菌生長(zhǎng)為測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)；生物被膜耐藥程度可以NCCLS/CLSI藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中的MIC值做參考標(biāo)準(zhǔn);如需使用群體感應(yīng)抑制劑（Qu