不同劑量亞砷酸鈉對(duì)大鼠皮膚和臟器的毒性損傷

不同劑量亞砷酸鈉對(duì)大鼠皮膚和臟器的毒性損傷

慢性砷中毒的毒性物質(zhì)嚴(yán)重影響了人類的健康。目前，尤其是分子機(jī)制，尚不清楚權(quán)限。此外，砷體具有很強(qiáng)的蓄積性，臨床上可視為逐漸漸進(jìn)的非叛逆過程，沒有敏感的原檢測(cè)方法和特效藥物，限制了早期診斷和預(yù)防。本研究采用亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)方法觀察不同劑量的砷劑對(duì)皮膚和其他臟器的毒性損傷作用,進(jìn)一步闡明砷中毒的作用機(jī)制,為今后地方性砷中毒的防治提供科學(xué)資料。1材料和方法1.1材料、試劑與儀器Virian240FS原子吸收儀(美國(guó)瓦里安公司),過氧化氫(分析純,天津市福晨化學(xué)試劑廠),砷元素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)溶液(國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心),亞砷酸鈉(分析純,北京化學(xué)試劑三廠)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1干預(yù)濃度的確定選用SPF級(jí)SD大鼠40只,雌雄各半,體重(100±20)g,由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物使用許可證編號(hào):SYXK(新)2003-0001。經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng),按性別和體重隨機(jī)分成4組(對(duì)照組,低劑量組,中劑量組,高劑量組),每組10只。采用霍恩氏法測(cè)得大鼠經(jīng)口半數(shù)致死量(LD50)為46.4mg/kg。在查閱、分析大量文獻(xiàn)基礎(chǔ)上,確定本實(shí)驗(yàn)各組的干預(yù)濃度。高劑量組約為受試物的1/5LD50,每個(gè)劑量組相差2倍。按大鼠每日飲水20ml,平均體重為100g計(jì)算,采用蒸餾水配制成50、25、12.5mg/L的亞砷酸鈉水溶液,按大鼠每公斤體重計(jì)算的劑量為10、5、2.5mg/kg。正常對(duì)照組飲用蒸餾水。1.2.2大鼠的尿量檢測(cè)均喂飼常規(guī)飼料。大鼠正常飲食,室溫18~22℃,濕度40%~60%。每天換水,并記錄各組的每天飲水量,每周一空腹稱重,根據(jù)大鼠每天的平均飲水量及每周的平均體重調(diào)整各組砷含量。連續(xù)染毒90d。1.2.3觀察指標(biāo)和測(cè)試方法1.2.3.組織剪碎、分離取樣品稱重,所有標(biāo)本重量均在0.5g左右,放入洗凈小瓶中;用刻度吸管量取預(yù)冷的生理鹽水(組織重量的9倍)于小瓶中,置于冰上,用眼科剪刀盡快將組織剪碎;將剪碎組織使用玻璃勻漿器進(jìn)行勻漿,左手持勻漿管將下端插入冰浴中,右手將搗桿垂直插入套筒中上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次,充分研碎,以上操作均在0~4℃下進(jìn)行。離心10~15min(組織勻漿:3000r/min;皮膚:4000r/min;r=5cm),提取上清液,棄去沉淀,待檢。1.2.3.2.一般情況和體重變化每天觀察動(dòng)物的攝食、飲水、活動(dòng)、精神狀態(tài)等一般情況,每天換水并記錄各組的每天飲水量,每周按時(shí)稱量體重,觀察動(dòng)物體重變化情況。1.2.3.3.器官系數(shù)1.2.3.4、測(cè)定硫含量1.2.3.皮膚組織學(xué)檢測(cè)大鼠處死后,將皮膚、心、肝、腎、腦以4%甲醛溶液固定,石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色后,光鏡下觀察皮膚表皮結(jié)構(gòu)及心、肝、腎、腦臟器的組織學(xué)變化。1.3量資料結(jié)果采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料結(jié)果以表示。多組樣本均數(shù)比較,方差齊時(shí)應(yīng)用單因素方差分析及兩兩比較的LSD檢驗(yàn);方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果2.1一般情況下和體重變化2.1.1一般情況下2.1.2各組大鼠染毒前5周平均體重的比較不同時(shí)間、不同劑量亞砷酸鈉染毒大鼠后,體重經(jīng)重復(fù)測(cè)量資料的方差分析,發(fā)現(xiàn)時(shí)間和劑量存在時(shí)間-劑量交互作用(F=4.511,P=0.000)。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn),染毒的前5周,低、中劑量組大鼠平均體重均高于對(duì)照組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;自第7周開始,低、中劑量組大鼠平均體重低于對(duì)照組,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高劑量組大鼠平均體重總體都低于對(duì)照組,尤其以第7周開始為甚,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與低劑量組比較,自第3周開始高劑量組大鼠平均體重均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。此外,大鼠體重的性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2對(duì)大鼠腦臟器系數(shù)的影響表2結(jié)果表明,隨著染毒劑量的增高,染毒組大鼠肝臟、腎臟的臟器系數(shù)隨之升高,中、高劑量組與對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量組大鼠腦臟器系數(shù)與對(duì)照組相比有所升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但低、中劑量組與對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;低、高劑量組大鼠心臟臟器系數(shù)與正常對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與低劑量組相比,高劑量組大鼠的心臟、肝臟、腎臟及腦臟器系數(shù)升高(P<0.05)。2.3皮膚和臟器中砷含量的比較表3中給出了對(duì)照組和染毒組大鼠皮膚和各主要臟器組織中砷的分布,可以看出,砷在大鼠皮膚和各臟器組織中并非均勻分布。經(jīng)單因素方差分析后發(fā)現(xiàn)各組大鼠皮膚和各臟器中砷含量不全相同,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(皮膚、心、肝、腦、腎中F值分別為550.06、545.21、471.73、1680.00、273.45;P值均為0.000)。由表3可見,隨著染毒劑量的增高,低、中、高劑量組大鼠皮膚和臟器中砷的含量依次升高,與正常對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與低劑量組比較,中、高劑量組大鼠皮膚和臟器中砷的含量依次升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2.4病理觀察的結(jié)果2.4.1表皮形態(tài)正常及去皮層厚度均勻性光鏡觀察的結(jié)果顯示,對(duì)照組(封三圖1A)大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)基本正常,表皮層厚度均勻,表皮細(xì)胞排列整齊;低劑量組(封三圖1B)可見表皮輕度角化;中劑量組和高劑量組(封三圖1C、D)可見表皮重度角化,表皮層厚度不均勻,部分細(xì)胞細(xì)胞核固縮、溶解或消失。2.4.2低劑量劑量組光鏡觀察的結(jié)果顯示,對(duì)照組(封三圖2A)大鼠心肌細(xì)胞呈梭形,細(xì)胞間通過胞體相連;低劑量組(封三圖2B)可見部分心肌纖維輕度水腫,胞漿疏松、淡染;中劑量組和高劑量組(封三圖2C、D)可見部分心肌灶性變性,間質(zhì)出血。2.4.4神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞光鏡觀察的結(jié)果顯示,對(duì)照組(封三圖4A)大鼠的大腦皮質(zhì)層內(nèi)錐體細(xì)胞突起明顯,細(xì)胞輪廓清晰,細(xì)胞核深染,尼氏體清楚可見,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞體積小,核圓而清晰。各劑量組大鼠大腦皮質(zhì)層內(nèi)均見有不同程度的神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核溶解、樹突拉長(zhǎng)等病理改變,中、高劑量組可見胞漿疏松(封三圖4B、C、D)。2.4.5小鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)光鏡觀察的結(jié)果顯示,正常對(duì)照組(封三圖5A)大鼠腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常,腎小管上皮細(xì)胞呈正方形,無明顯病變,細(xì)胞核圓形,位于基底部,排列整齊;低劑量組(封三圖5B)腎小球毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張、充血,腎小管上皮細(xì)胞部分輕度水腫;中劑量組和高劑量(封三圖5C、D)可見腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血,腎小管上皮細(xì)胞明顯水腫,脂肪變性,管腔狹窄。3討論3.1砷對(duì)大鼠體重的影響砷廣泛存在于土壤、水體、作物和大氣中,微量的砷具有生血和促進(jìn)組織、細(xì)胞生長(zhǎng)等功能。20世紀(jì)70年代后,人們逐漸發(fā)現(xiàn)動(dòng)物缺砷會(huì)出現(xiàn)異常,當(dāng)攝砷恢復(fù)到正常水平時(shí),異常癥狀又會(huì)消失。但過量的砷在體內(nèi)蓄積可引起嚴(yán)重的砷中毒,引起機(jī)體的多系統(tǒng)的損害,且砷對(duì)組織造成的損傷程度與砷的濃度有劑量-效應(yīng)關(guān)系,慢性砷中毒的發(fā)病率及嚴(yán)重程度與砷暴露時(shí)間及水砷含量等因素密切相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)研究中,通過大鼠自由飲用含不同濃度NaAsO2的飲水染毒90d后,觀察了不同劑量的砷對(duì)大鼠體重變化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,砷可使低、中劑量組大鼠體重增長(zhǎng)加快,在第1周末就已表現(xiàn)出來,在前5周內(nèi),低、中劑量組大鼠平均體重均高于對(duì)照組,這可能與砷促進(jìn)生長(zhǎng),刺激機(jī)體代謝旺盛,促進(jìn)蛋白質(zhì)合成有關(guān),據(jù)有關(guān)資料表明,在飼料中添加0.01%~0.02%的砷化合物(主要是對(duì)氨基苯砷酸、3-硝基-4-羥基苯砷酸)時(shí),可刺激家禽的生長(zhǎng);以0.005%~0.01%水平添加可刺激豬的生長(zhǎng),并提高飼料效率。但隨著染砷時(shí)間的延長(zhǎng),可能由于蓄積作用砷影響到大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。自本實(shí)驗(yàn)第7周開始,低、中劑量組大鼠平均體重開始低于對(duì)照組;而高劑量組大鼠平均體重總體都低于對(duì)照組,尤其以第7周開始為甚。染毒組大鼠在經(jīng)過一段時(shí)間的體重增長(zhǎng)后,在染毒7周后,低、中、高劑量組大鼠平均體重呈現(xiàn)出增長(zhǎng)緩慢現(xiàn)象,而高劑量組大鼠甚至出現(xiàn)體重下降現(xiàn)象,提示砷對(duì)動(dòng)物增長(zhǎng)的影響呈雙相性,即短期低劑量砷對(duì)動(dòng)物機(jī)體有一定的正向效應(yīng),而高劑量下和長(zhǎng)期低、中劑量砷對(duì)機(jī)體可出現(xiàn)抑制或毒性效應(yīng)。動(dòng)物體重是綜合反映動(dòng)物健康狀況最基本的靈敏指標(biāo)之一,可以很好地反映動(dòng)物機(jī)體中毒的效應(yīng),以往的實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)高砷刺激會(huì)對(duì)機(jī)體造成一些毒性效應(yīng),其中一個(gè)表現(xiàn)就是體重降低,本實(shí)驗(yàn)中高劑量染毒7周時(shí)體重的變化也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。3.2大鼠砷中毒的病理組織學(xué)檢測(cè)砷在體內(nèi)有強(qiáng)蓄積性,易與巰基結(jié)合而蓄積在角蛋白含量較多的組織(如皮膚、毛發(fā)、指甲)中,本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),皮膚和心、肝、腦、腎主要臟器中砷的蓄積量隨著砷染毒劑量的升高而增高,說明砷在體內(nèi)具有較強(qiáng)的蓄積性,從而對(duì)皮膚和臟器造成嚴(yán)重?fù)p傷。另外,皮膚和各臟器組織對(duì)砷的蓄積有一定的差異,以皮膚中砷含量相對(duì)較高,腦組織中砷含量相對(duì)于其他臟器來說較低,說明血腦屏障對(duì)砷有一定的阻擋作用,這與以前的結(jié)果一致。造成皮膚和各臟器組織中砷分布不同的原因可能與各臟器與砷的親和力不同有關(guān),另外也與臟器本身的代謝情況有關(guān)。臟器系數(shù)是反映某個(gè)臟器受損的一個(gè)靈敏、有效和經(jīng)濟(jì)的指標(biāo),可為進(jìn)一步進(jìn)行生物化學(xué)和病理組織學(xué)檢測(cè)以及尋找毒物作用靶器官提供重要線索。通過對(duì)心、肝、腦、腎各臟器的臟器系數(shù)進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)隨著砷濃度的升高,大鼠心、肝、腦和腎臟器系數(shù)均隨之升高,肝臟與腎臟分別是砷代謝與排泄的重要器官,心臟和腦也是砷毒性作用的主要靶器官,臟器系數(shù)的升高說明砷蓄積對(duì)機(jī)體各臟器造成了嚴(yán)重?fù)p傷。在排除體重變化對(duì)臟器系數(shù)變化影響的情況下,臟器系數(shù)的異常,可旁證病理組織學(xué)改變的可能性。皮膚是砷的主要靶組織之一,近年來,砷對(duì)皮膚損害的機(jī)制成為眾多研究者關(guān)注的焦點(diǎn)之一。皮膚損害是慢性砷中毒時(shí)最早出現(xiàn)的病理改變,也是慢性砷中毒患者特異的臨床特征,一旦發(fā)生,將很難恢復(fù)。光鏡下觀察皮膚病理切片,正常對(duì)照組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)基本正常,表皮層厚度均勻,表皮細(xì)胞排列整齊;而染毒組可見表皮不同程度的角化,表皮層厚度不均勻,部分細(xì)胞細(xì)胞核固縮、溶解或消失,尤以中、高劑量組病變明顯。砷吸收后通過循環(huán)系統(tǒng)分布到全身各組織、器官,對(duì)循環(huán)系統(tǒng)的危害首當(dāng)其沖。臨床上主要表現(xiàn)為與心肌損害有關(guān)的心電圖異常和局部微循環(huán)障礙導(dǎo)致的雷諾氏綜合征、球結(jié)膜循環(huán)異常、心腦血管疾病等。對(duì)心臟組織行光鏡觀察,結(jié)果顯示正常對(duì)照組心肌細(xì)胞呈梭形,細(xì)胞間通過胞體相連;低劑量組可見部分心肌纖維輕度水腫,胞漿疏松、淡染;中、高劑量組部分心肌灶性變性,間質(zhì)出血。人群流行病學(xué)調(diào)查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,砷可以透過血腦屏障進(jìn)入腦組織,并可在腦組織中蓄積,對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,引起記憶障礙、智力低下等神經(jīng)行為異常。從本實(shí)驗(yàn)的腦組織病理切片可以觀察到砷染毒組大鼠的大腦皮質(zhì)層有不同程度的神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核溶解、樹突拉長(zhǎng)等病理改變。提示砷可導(dǎo)致腦損傷,腦是砷毒性作用的一個(gè)敏感的靶器官,因此不容忽視砷對(duì)腦組織的損傷。肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞與肝血竇以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列,肝細(xì)胞形態(tài)基本正常,呈多邊形,結(jié)構(gòu)完好,細(xì)胞核大而圓,核染色質(zhì)稀疏淡染,核仁清晰;染毒組大鼠肝臟出現(xiàn)細(xì)胞水腫及脂肪變性,部分細(xì)胞細(xì)胞核固縮或溶解,胞漿稀疏、淡染,細(xì)胞灶性壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn),與以往的報(bào)道一致。砷主要通過腎臟排泄,因此會(huì)對(duì)腎臟產(chǎn)生一定的影響。砷還可導(dǎo)致染砷大鼠子代腎組織超微結(jié)構(gòu)的改變。光鏡下觀察腎臟病理切片,正常對(duì)照組大鼠腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常,腎小管上皮細(xì)胞呈正方形,無明顯病變,細(xì)胞核圓形,位于基底部,排列整齊;染毒組腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張充血,腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞水腫、脂肪變性、管腔狹窄等病理改變。表明大鼠經(jīng)飲水?dāng)z入NaAsO2,持續(xù)90d后,可致明顯的腎臟損害。與其他研究者報(bào)告的結(jié)果一致。綜上所述,飲水中砷的劑量與砷的作用有著直接關(guān)系,不同劑量的砷均可對(duì)機(jī)體造成不同程度的損傷。關(guān)于砷在皮膚及不同臟器中的作用機(jī)制有待在以后的研究中予以進(jìn)一步研究。分別計(jì)算心臟,肝臟,腦及腎臟臟器系數(shù),即各個(gè)臟器的濕重與單位體重的比值。采用火焰原子吸收法測(cè)定皮膚和心、肝、腦、腎各組織中總砷含量。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,對(duì)照組大鼠活動(dòng)正常,生長(zhǎng)發(fā)育良好,未見任何明顯的異常表現(xiàn)。染毒組大鼠與對(duì)照組比較進(jìn)食量、飲水量都相對(duì)減少,染毒后期活動(dòng)減少,反應(yīng)遲緩,出現(xiàn)程度不等的被毛雜亂脫落,光潔度降低,以高劑量組更為明顯。在染砷9周后,高劑量組大鼠出現(xiàn)煩躁、互相抓咬;部分大鼠出現(xiàn)毛發(fā)光澤度降低,背部掉毛,皮膚潮紅,活動(dòng)減少等異常