lc-msms法測定人血漿中氫氯噻嗪

lc-msms法測定人血漿中氫氯噻嗪

坎地沙坦酯和氫氯仿銨（hydrochrort虞家遺址，1）由坎地沙坦酯和1組成。1為噻嗪類利尿劑,具有利尿、降壓作用,坎地沙坦酯是血管緊張素Ⅱ受體抑制劑,兩者合用作用增強,臨床用于心血管系統(tǒng)疾病的治療。主要采用HPLC法測定1。本試驗采用LC-MS/MS法測定血漿中的1濃度,定量限為lng/ml,方法簡捷,適于藥動學和藥效學研究。1色譜資料和對照品FiniganTSQDiscoveryMax型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國熱電公司);Xcalibur1.2色譜工作站?？驳厣程辊?片(批號04091702,每片含112.5mg)、1對照品(純度>99.0%)和磺胺甲唑(sulfamethoxazole,2,內(nèi)標)對照品(純度>99.0%)均為江蘇健翔藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;甲醇為色譜純,鹽酸、乙酸乙酯均為分析純,水為超純水。2方法和結(jié)果2.1對照品貯備液的制備1對照品貯備液:精密稱取1對照品10mg,置10ml量瓶中,加甲醇溶解并定容,搖勻,得1mg/ml1對照品貯備液。內(nèi)標溶液:精密稱取2對照品10mg,置10ml量瓶中,加甲醇溶解并定容,搖勻,即得1mg/ml的2貯備液。用甲醇稀釋得2μg/ml的內(nèi)標工作液。2.2質(zhì)譜條件色譜條件:色譜柱C18柱(4.6mm×150mm,5μm);流動相甲醇-水(50:50);柱溫25℃;流速0.7ml/min,進樣量10μl。質(zhì)譜條件:離子源API-ESI源;噴霧電壓4000V;霧化氣壓0.4MPa;輔助氣壓力0.03MPa;加熱毛細管溫度350℃;碰撞氣壓力0.5Pa;碰撞誘導解離CID電壓均為25eV;選擇性反應(yīng)離子檢測(SIM):m/z296.0→296.0(1)和m/z251.9→251.9(2)。2.3有機相及內(nèi)標液制備精密量取血漿0.5ml置5ml離心管中,精密加入內(nèi)標工作液25μl和0.1mol/L鹽酸0.1ml,渦旋混勻,加入乙酸乙酯2.5ml,渦旋3min,離心(2700×g)10min。精密吸取有機相2ml置離心管中,50℃水浴下用氮氣流吹干。殘渣用流動相150μl溶解,取上清液測定。上述操作均需避光。2.4lc-ms/ms分析空白血漿、1和2對照品溶液、空白血漿加1和2、給藥后2h血漿樣品的LC-MS/MS圖譜見圖1。1和2的保留時間約為2.2min和2.5min。1和2峰形良好,基線平穩(wěn),內(nèi)源性物質(zhì)無干擾。2.5標準血漿樣品的線性回歸分析分別取1對照品貯備液適量,以氮氣流吹干,加入空白血漿0.5ml,渦旋1min,配成1濃度分別為1、3、10、20、50、100、200ng/ml的系列標準血漿樣品,照“2.3”項下操作后進樣測定。以1與2的峰面積比值R為縱坐標,1濃度c為橫坐標,進行線性回歸,得回歸方程R=9.54×10-3c-1.9×10-4,r=0.9980。表明在1～200ng/ml濃度范圍,1的線性關(guān)系良好。1的定量限為1ng/ml。2.6流動相的測定分別取1對照品溶液適量,用甲醇配成濃度為3、20、100ng/ml的溶液,各10份,取0.5ml,用氮氣流吹干,其中5份以流動相150μl溶解殘渣,進樣測定,記錄1的峰面積As。另5份加空白血漿0.5ml,按“2.3”項下方法處理后進樣測定,記錄1的峰面積Ax。計算介質(zhì)效應(yīng)ME(%)=Ax/As×100%,結(jié)果分別為110.1%、108.5%、107.1%,表明本法測定1,不受介質(zhì)效應(yīng)干擾。2.7內(nèi)標峰面積比值按“2.5”項下方法制備低、中、高3種濃度(3、20、100ng/ml)的血漿樣品,各5份,共3批,按“2.3”項下方法處理后進樣測定,結(jié)果見表1。取1對照品貯備液適量,用甲醇稀釋得1濃度分別為3、20、100ng/ml的溶液,分別取0.5ml,精密加入內(nèi)標溶液25μl,以氮氣流吹干后用流動相150μl溶解殘渣,取上清液進樣分析,記錄色譜圖,計算1和2的峰面積比值fs(fs=As/Ai)。另取離心管數(shù)支,分別精密加入上述1對照品溶液適量,氮氣吹干后加空白血漿0.5ml,渦旋混勻,配成含1濃度分別為3、20、100ng/ml的血樣,每種濃度5份,然后按“2.3”項下操作后進樣測定,記錄色譜圖,計算樣品和內(nèi)標的峰面積比值fx(fx=As/Ai)。計算1的提取回收率(R%=fx/fs×2.5/2×100%,其中2.5/2為稀釋倍數(shù)),結(jié)果見表1。2.8凍融穩(wěn)定性測定取1濃度為3、100ng/ml的含藥血漿樣品,在室溫放置8h、反復凍融3次及在-70℃凍存10d后測定,得RSD(%,n=3)分別為1.3、0.3、1.3和1.5、2.6、0.9。2.9試驗組及主要藥動學參數(shù)試驗方案經(jīng)南京市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準。20名健康志愿者,男女各半(年齡20～25歲,體重55～68kg,身高165～177cm),體檢證實心、肝、腎功能正常,試驗前2周及試驗期間未服用其它任何藥物,試驗前簽署知情同意書。受試者隨機分為試驗Ⅰ、Ⅱ二組,每組10名,男女各5人,Ⅰ組受試者按A、B……I、J頁序編號;Ⅱ組受試者按K、L……S、T順序編號。單劑量給藥方案:I組(12.5mg×1片)和Ⅱ組25mg(12.5mg×2片);多劑量給藥方案:I組(12.5mg×1片/天),連續(xù)服用6d。受試者于試驗前1d和試驗期內(nèi)禁飲用酒、碳酸、咖啡類飲料,試驗前禁食過夜至少10h(不禁水)。試驗前晚入住Ⅰ期試驗室,翌晨空腹服用受試制劑,以溫開水250ml送服,服藥2h后可再飲水,4h后統(tǒng)一進餐。受試者服藥后避免劇烈運動,亦不得長時間臥床。試驗期間受試者統(tǒng)一飲食。受試者于服藥前及服藥后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、11、14、24、36、48h靜脈采血約5ml,血樣置肝素化離心管中,離心(1540×g)分取血漿,于-70℃冷凍待測。單劑量Ⅰ、Ⅱ組口服坎地沙坦酯1片后的平均藥-時曲線見圖2,主要藥動學參數(shù)見表2。10名志愿者多劑量口服坎地沙坦酯1片后d4、5、6的平均谷濃度和藥-時曲線見圖3,結(jié)果表明連續(xù)服藥4d后血藥濃度達穩(wěn)態(tài),估算的1穩(wěn)態(tài)藥動學參數(shù),tmax為(1.83±0.25)h,為(3.72±1.79)ng/ml,cav為(19.37±3.20)ng/ml,波動系數(shù)DF為3.93±0.36,累積因子R為1.12,AUC0-48h為(484.90±76.89)h.ng·ml-1。3反相高效液相色譜法1水溶性較強,文獻采用固相萃取法富集樣品,回收率可達85%以上,但操作繁瑣;其它文獻均采用液-液萃取法提取血漿中的1,優(yōu)化條件后,最終選用0.1mol/L鹽酸0.1ml酸化血漿后用乙酸乙酯提取,萃取回收率約為70%,血樣的處理過程比固相萃取法簡單。1極性較強,在C18柱上保留差,出峰時間短,易受內(nèi)源性雜質(zhì)峰的干擾,故有文獻采用離子對反相高效液相色譜法和正相高效液相色譜法來增強保留,改善峰形,提高分離效率,但分析時間長達10min,且靈敏度不高,定量限為3～l0ng/ml;文獻采用毛細管反相高效液相色譜法,樣品峰與雜質(zhì)峰未能基線分離,定量限為5ng/ml?？驳厣程辊?片中的