lc-msms法測定健康人體血漿中氫溴酸加蘭他敏及其藥動學(xué)及生物等效性研究

lc-msms法測定健康人體血漿中氫溴酸加蘭他敏及其藥動學(xué)及生物等效性研究

加蘭特敏是第二代膽堿酯酶抑制劑（ache）。這是前蘇聯(lián)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的一種名為“歐萊爾-甲基-3-甲基-4a”的菲涅耳生物?；瘜W(xué)名稱為11-甲基-3-甲基-4a，5，9，10，11，12-6h-苯并置溶菌酶[3a，3，2-]。20世紀(jì)60年代，中國從類黃酮和紅景天中分離出來。加蘭他敏與乙酰膽堿競爭膽堿酯酶,阻斷此酶對乙酰膽堿的降解,進(jìn)而增加腦內(nèi)乙酰膽堿的濃度。本品具有易透過血腦屏障的特點,可產(chǎn)生較強的中樞作用,原用于治療重癥肌無力和小兒麻痹后遺癥,近年來國外將該藥用于改善記憶障礙和治療早老性癡呆癥,效果明顯。目前,氫溴酸加蘭他敏的體內(nèi)分析方法主要有高效液相色譜紫外檢測法和熒光檢測法、放射免疫法、液質(zhì)聯(lián)用法等。與已有文獻(xiàn)報道相比,本試驗建立LC-MS/MS法測定血漿中氫溴酸加蘭他敏含量,樣品處理簡單,專屬性更強,靈敏度更高,分析時間短。測得結(jié)果可用于評價2種氫溴酸加蘭他敏制劑的生物等效性以及研究其藥動學(xué),為臨床用藥提供依據(jù)。1材料表面1.1參比制劑及對照品受試制劑:氫溴酸加蘭他敏口服液(南京華威科技開發(fā)有限公司研制,魯南貝特制藥有限公司生產(chǎn),規(guī)格為10mg∶10mL,批號:060202);參比制劑:氫溴酸加蘭他敏片(常州天普制藥有限公司生產(chǎn),商品名:慧敏,規(guī)格:5mg/片,批號:20040901);氫溴酸加蘭他敏對照品(批號:100049-200308,購自中國藥品生物制品檢定所);鹽酸克侖特羅對照品(批號:100072-198501,購自中國藥品生物制品檢定所)。甲醇為色譜純(美國TEDIA公司);冰醋酸、醋酸銨、乙酸乙酯為分析純(南京化學(xué)試劑廠);試驗用水為自制純凈水。1.2儀器Waters2695液相色譜儀,WatersQuattromicro三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司),MassLynxV4.0色譜工作站。2方法2.1分析條件2.1.1流動相、流速色譜柱:LichrospherC6H6(250mm×4.6mm,5μm);流動相:甲醇-醋酸鹽緩沖液(0.2%醋酸銨+0.1%冰醋酸)(50∶50);流速:1.0mL/min;分流比:7∶3;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:30℃。2.2.2離子檢測方法采用電噴霧離子化正離子化選擇性反應(yīng)檢測法。噴霧電壓:3.0kV;錐孔電壓:30V;脫溶劑溫度:350℃;脫溶劑氣流速:560L/h;反吹氣流速:62L/h。加蘭他敏選擇性反應(yīng)檢測離子:[M+H]+(m/z:287.9→212.9),氬氣(0.35Pa)CID碰撞能量:20eV;內(nèi)標(biāo)克倫特羅選擇性反應(yīng)檢測離子:[M+H]+(m/z:277→202.7),氬氣(0.35Pa)CID碰撞能量:20eV。2.2氮氣吹干劑的制備精密吸取血漿0.5mL,置于10mL帶塞試管中,精密加入內(nèi)標(biāo)溶液(500μg/L的鹽酸克侖特羅溶液)50μL和1mol/LNaOH溶液100μL,堿化,渦旋混勻后加乙酸乙酯5mL,渦旋混勻3min,3500r/min離心5min,取上清液4mL于40℃水浴中氮氣吹干。殘留物加入150μL流動相渦旋混勻,16000r/min離心5min,取上清液20μL進(jìn)行LC-MS/MS分析,按內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算血漿樣品中氫溴酸加蘭他敏的濃度。2.3方法學(xué)評價2.3.1加內(nèi)標(biāo)的典型色譜空白血漿、空白血漿加氫溴酸加蘭他敏和內(nèi)標(biāo)及受試者服藥1小時后血漿樣品加內(nèi)標(biāo)的典型色譜如圖1所示。由圖1可見氫溴酸加蘭他敏和鹽酸克侖特羅的保留時間分別為5.06和4.41min左右,血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)對測定無干擾。2.3.2線性回歸分析配制0.50、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、200μg/L系列濃度的氫溴酸加蘭他敏血漿樣品,照“血漿樣品處理及測定”項下操作,按內(nèi)標(biāo)峰面積比(R)對濃度(C)進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果表明,在0.50～200μg/L范圍內(nèi)色譜響應(yīng)線性關(guān)系良好,R=0.06910C+0.001922(r=0.9999),最低定量下限(LLOQ)為0.5μg/L(RSD=9.21%,n=5)。2.3.3回收率、精密度及基質(zhì)效應(yīng)測得低、中、高(1.0、10.0、100.0μg/L)3種濃度血漿樣品回收率、精密度及基質(zhì)效應(yīng)(見表1)。由表1可見,回收率與精密度均良好,血漿樣品LC-MS/MS測定的基質(zhì)效應(yīng)均在80%～120%之間,符合中國藥典的規(guī)定,表明無明顯基質(zhì)效應(yīng)。2.3.4融、-20穩(wěn)定性對氫溴酸加蘭他敏血藥濃度為10μg/L的血漿樣品分別進(jìn)行凍融、-20℃長期放置及處理后的進(jìn)樣溶液室溫放置,考察其穩(wěn)定性。結(jié)果顯示,反復(fù)凍融3次、-20℃長期保存及進(jìn)樣溶液室溫放置12小時后,穩(wěn)定性均良好(RSD均小于9.66%)。2.4臨床試驗計劃2.4.1年齡、體重分布20名男性健康志愿受試者,經(jīng)全面體檢合格,并符合臨床試驗要求,年齡(21±1.5)歲,體重(63.5±4.7)kg;所有受試者簽署知情同意書,本臨床試驗方案經(jīng)國家藥物臨床試驗機構(gòu)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批同意。2.4.2參比制劑和受試制劑試驗采用雙周期兩制劑交叉設(shè)計。受試者隨機分為2組,雙交叉單劑量口服受試制劑或參比制劑。A組先服用受試制劑(10mg),間隔1周后服用參比制劑(10mg);B組先服用參比制劑(10mg),間隔1周后服用受試制劑(10mg)。試驗時,受試者服藥前禁食12小時(不禁水),次日晨,用250mL溫水送服,服藥后2小時內(nèi)禁水,服藥后4小時進(jìn)統(tǒng)一食譜標(biāo)準(zhǔn)餐。分別于服藥前(0時)及服藥后0.17、0.33、0.50、0.75、1、1.5、2、3、5、8、12、24、36小時自肘靜脈取血約4mL,置肝素化離心管中,3500r/min離心10min分取血漿,于-20℃保存,供血藥濃度測定用。2.4.3統(tǒng)計學(xué)分析方法血藥濃度經(jīng)DAS2.0軟件處理,求算藥動學(xué)參數(shù)及相對生物利用度。Tmax、Cmax為實測值;AUC0-τ用梯形法計算;半衰期(t1/2)由消除相的末端5點計算;同時計算清除率(CL/F)和表觀分布容積(V/F)。2種制劑的Cmax、AUC0-36、AUC0-∞經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后采用交叉試驗設(shè)計的方差分析,分析藥劑間、個體間和周期間變異的統(tǒng)計學(xué)意義。Cmax、AUC0-36、AUC0-∞經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行雙單側(cè)t檢驗,根據(jù)2005年版中國藥典(二部)附錄ⅪⅩB規(guī)定,受試制劑AUC的90%可信限落在參比制劑的80%～125%范圍內(nèi)作為等效標(biāo)準(zhǔn),Cmax的90%可信限落在參比制劑的70%～143%范圍內(nèi)作為等效標(biāo)準(zhǔn),對Tmax采用非參數(shù)法檢驗進(jìn)行考察,以此來評價受試制劑與參比制劑是否生物等效。3結(jié)果3.1平均血藥濃度經(jīng)時過程20名健康受試者口服氫溴酸加蘭他敏受試和參比制劑后的平均血藥濃度經(jīng)時過程如圖2所示,受試與參比制劑在體內(nèi)的經(jīng)時過程符合二房室模型,主要藥動學(xué)參數(shù)見表2。3.2各受試制劑的ct、cmx值將受試制劑與參比制劑的Cmax、AUC0-36、AUC0-∞對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析檢驗,結(jié)果表明,在α為0.05時,2種制劑的Cmax和AUC無顯著性差異;雙單側(cè)t檢驗結(jié)果表明,AUC0-∞受試制劑/AUC0-∞參比制劑的90%置信區(qū)間為93.8%～106.5%,符合80%～125%的限度;Cmax受試制劑/Cmax參比制劑的90%置信區(qū)間為102.3%～123.6%,符合70%～143%的限度,Tmax無顯著性差異。以氫溴酸加蘭他敏片為參比,按AUC0-36估算,測得氫溴酸加蘭他敏口服液單劑量時的平均相對生物利用度為(101.5±19.1)%。4生物等效性評價在進(jìn)行ESI正離子選擇性反應(yīng)條件優(yōu)化時,分別考察了不同的CID碰撞能量(10～25eV)對子離子響應(yīng)強度的影響,結(jié)果表明,CID碰撞能量為20eV時,加蘭他敏的子離子響應(yīng)最好且穩(wěn)定,其他碎片離子干擾少。國內(nèi)外已有相關(guān)文獻(xiàn)報道對生物樣本中氫溴酸加蘭他敏的含量測定,如宋洪杰等采用高效液相色譜法,最低檢測限為2.50μg/L,內(nèi)源性物質(zhì)干擾多,樣品分析時間長;司天梅等采用高效液相-熒光檢測法,測定時血漿樣品需用無水乙醚提取2次,最低檢測限為1.0μg/L。而本試驗采用LC-MS/MS法測定血漿中氫溴酸加蘭他敏的含量時,樣品經(jīng)NaOH溶液堿化后,只需用乙酸乙酯提取1次,最低檢測限可達(dá)0.5μg/L,內(nèi)源性雜質(zhì)干擾少,樣品分析時間只需6