離心機(jī)的分類與結(jié)構(gòu)課件

分離分析儀器

離心機(jī)

(centrifuge)

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分離分析儀器

離心機(jī)(centrifuge)http://2內(nèi)容提綱一、離心機(jī)的工作原理二、常用的離心方法三、離心機(jī)的分類與結(jié)構(gòu)四、離心機(jī)的使用和維護(hù)2內(nèi)容提綱一、離心機(jī)的工作原理3

離心現(xiàn)象是指物體在離心力場中表現(xiàn)的沉降現(xiàn)象。引言

應(yīng)用離心沉降進(jìn)行物質(zhì)的分析和分離的技術(shù)就稱為離心技術(shù)。

實(shí)現(xiàn)離心技術(shù)的儀器是離心機(jī)(centrifuge)。3離心現(xiàn)象是指物體在離心力場中表現(xiàn)的沉降4第一節(jié)

離心機(jī)的工作原理4第一節(jié)

離心機(jī)的工作原理5一、圓周運(yùn)動與離心現(xiàn)象向心力：做圓周運(yùn)動的物體所受的外力的合力。它的大小取決于外力的大小，方向是與速度的方向垂直，指向圓心。v:線速度;ω:旋轉(zhuǎn)角速度(弧度／秒);r:旋轉(zhuǎn)體離旋轉(zhuǎn)軸的距離(cm);m:顆粒質(zhì)量;ρ:物體密度;V:物體體積F=mv2/r=mrω2=ρVrω25一、圓周運(yùn)動與離心現(xiàn)象v:線速度;6二、液體中的微粒在重力場中的分離

顆粒靜置一段時間后，受重力場影響會開始沉降運(yùn)動。粒子越重，下沉越快。反之密度比液體小的粒子就會上浮，這個現(xiàn)象為重力沉降。沉降速度(sedimentationvelocity)：微粒在重力場中下降的速度。它的影響因素：微粒的大小、形態(tài)、密度、液體的粘度和重力場的強(qiáng)度。

如實(shí)驗室制備血清時就可以采用室溫靜置的方法得到。6二、液體中的微粒在重力場中的分離顆粒靜置一段7

如果重力場的強(qiáng)度(g)足夠大，則沉降速度足夠快，那么就可以實(shí)現(xiàn)生物大分子的分離。擴(kuò)散現(xiàn)象：

重力場中擴(kuò)散現(xiàn)象是無條件的，絕對的。特別是對于病毒和蛋白質(zhì)類小分子物質(zhì)，擴(kuò)散對物質(zhì)的沉降影響更大。如何克服？二、液體中的微粒在重力場中的分離7如果重力場的強(qiáng)度(g)足夠大，則沉降速度足8三、液體中的微粒在離心力場中的沉降

顆粒在圓周運(yùn)動時的切線運(yùn)動稱為離心沉降。

實(shí)際上，顆粒在介質(zhì)中作切線運(yùn)動時，將受到介質(zhì)的摩擦阻力，使顆粒在離心管中作曲線運(yùn)動。8三、液體中的微粒在離心力場中的沉降顆粒在圓9三、液體中的微粒在離心力場中的沉降

顆粒在離心管中的沉降速度與離心機(jī)轉(zhuǎn)速有關(guān)，旋轉(zhuǎn)速度越快，顆粒沉降越快。mω2r=m(2πN/60)2r=4π2N2rm/3600m:顆粒質(zhì)量;ω:旋轉(zhuǎn)角速度；N:每分鐘轉(zhuǎn)頭旋轉(zhuǎn)次數(shù)；r:離心半徑9三、液體中的微粒在離心力場中的沉降顆粒在離10

相對離心力（RCF，Relativecentrifugalforce）是指在離心場中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度“g”。例如25000×g，則表示相對離心力為25000。三、液體中的微粒在離心力場中的沉降

相對離心力RCF的值（g值）取決于轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速（rpm）和旋轉(zhuǎn)半徑（r,以mm計算），可用如下公式表示（rpm：revolutionsperminute每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，r/min）

10相對離心力（RCF，Relativecentrifu11

由上式可見，只要給出旋轉(zhuǎn)半徑r，則RCF和rpm之間可以相互換算。三、液體中的微粒在離心力場中的沉降rav=(rmin＋rmax)/2

但是由于轉(zhuǎn)頭的形狀及結(jié)構(gòu)的差異，使每臺離心機(jī)的離心管，從管口至管底的各點(diǎn)與旋轉(zhuǎn)軸之間的距離是不一樣的，所以在計算是規(guī)定旋轉(zhuǎn)半徑均用平均半徑“rav”代替：11由上式可見，只要給出旋轉(zhuǎn)半徑r，則RCF12

一般情況下，低速離心時常以轉(zhuǎn)速“rpm”來表示，高速離心時則以“g”表示。計算顆粒的相對離心力時，應(yīng)注意離心管與旋轉(zhuǎn)軸中心的距離“r”不同，即沉降顆粒在離心管中所處位置不同，則所受離心力也不同。因此在報告超離心條件時，通?？偸怯玫匦囊Φ谋稊?shù)“×g”代替每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)“rpm”，因為它可以真實(shí)地反映顆粒在離心管內(nèi)不同位置的離心力及其動態(tài)變化?？萍嘉墨I(xiàn)中離心力的數(shù)據(jù)通常是指其平均值（RCFav），即離心管中點(diǎn)的離心力。三、液體中的微粒在離心力場中的沉降12一般情況下，低速離心時常以轉(zhuǎn)速“rpm”來表示，高速離13三、液體中的微粒在離心力場中的沉降由于轉(zhuǎn)頭的形狀和設(shè)計，離心管中從管頂至管底各點(diǎn)到旋轉(zhuǎn)中心的距離是不同的，為了計算相對離心力的數(shù)值可用平均相對離心力來表示，即同一離心轉(zhuǎn)頭部和底部所受離心力的平均值。離心機(jī)常有多種不同形狀的轉(zhuǎn)頭，其各自所反映的離心力場的大小和離心沉降距離也不一樣，在實(shí)際工作中應(yīng)根據(jù)分離要求正確選擇使用。13三、液體中的微粒在離心力場中的沉降由于轉(zhuǎn)頭的形狀和設(shè)計，14四、沉降系數(shù)沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient):是指單位離心力場中樣品的沉降速度。它與樣品的質(zhì)量和密度成正比。名稱沉降系數(shù)（S）R.C.F.（g）轉(zhuǎn)速（r/min）細(xì)胞>107<200<1500細(xì)胞核4x106~107600~8003000線粒體2~7x10470007000微粒體102~1.5x1041x10530000DNA10~1202x10540000RNA4~504x10560000蛋白質(zhì)2~25>4x105>6000014四、沉降系數(shù)沉降系數(shù)(sedimentationco15第二節(jié)

常用的離心方法15第二節(jié)

常用的離心方法16一、分類制備離心方法：差速離心法密度梯度離心法分析離心方法：沉降速度法沉降平衡法等密度區(qū)帶分析離心法16一、分類制備離心方法：差速離心法17二、差速離心法(differentialcentrifugation)差速離心法(differentialcentrifugationmethod)：是利用樣品中各種組分的沉降系數(shù)不同(S)而進(jìn)行分離，又稱差分離心或差級離心。17二、差速離心法(differentialcentri18

特點(diǎn)介質(zhì)的密度均一；速度由低向高，逐級離心；分辨率不高。二、差速離心法(differentialcentrifugation)

通常兩個組分的沉降系數(shù)差在10倍以上。分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器，僅僅適合粗提或者樣品濃縮。18特點(diǎn)二、差速離心法(differentialcen

優(yōu)點(diǎn)：樣品處理量較大，可用于大量樣品的初級分離。

缺點(diǎn)：分離復(fù)雜樣品和要求分離純度要求較高時，離心次數(shù)太多，操作繁雜。優(yōu)點(diǎn)：樣品處理量較大，可用于大量樣品的初級分離。缺點(diǎn)差速離心形成的沉淀（肝臟）沉淀RCF(gav)×?xí)r間內(nèi)容物P11000g×10min細(xì)胞核，重線粒體，大片細(xì)胞膜P23000g×10min重線粒體，細(xì)胞膜碎片P36000g×10min線粒體，溶酶體，過氧化物酶體，完整高爾基體P410000g×10min線粒體，溶酶體，過氧化物酶體，高爾基體P520000g×10min溶酶體，過氧化物酶體，高爾基體膜，大的高密度小泡（如粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）P6100000g×10min從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而來的所有小泡，細(xì)胞膜，高爾基體，核內(nèi)體等例注：RCF即相對離心力。差速離心形成的沉淀（肝臟）沉淀RCF(gav)×?xí)r間內(nèi)容物21三、密度梯度離心(isodensitycentrifugation)密度梯度離心(isodensitycentrifugation)：又稱為區(qū)帶離心，是將樣品溶液置于一個由梯度材料形成的密度梯度液體柱中，離心后被分離組分以區(qū)帶層分布于梯度柱中。離心脫水機(jī)21三、密度梯度離心(isodensitycentrif22

按照離心分離原理，密度梯度離心又可分為兩種類型：

三、密度梯度離心

(isodensitycentrifugation)

分類速率區(qū)帶離心法（連續(xù)密度梯度離心法)

等密度離心法（不連續(xù)密度梯度離心法）

22按照離心分離原理，密度梯度離心又可分為兩種類23①分離效果好，可一次獲得較純顆粒。②適應(yīng)范圍廣，能象差速離心法一樣分離具有沉降系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒。③顆粒不會擠壓變形，能保持顆?；钚?。

優(yōu)點(diǎn)三、密度梯度離心

(isodensitycentrifugation)常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖、甘油。23優(yōu)點(diǎn)三、密度梯度離心(isodensitycent24（1）速率區(qū)帶離心法

(velocitysedimentation)原理

根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度（s)不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達(dá)到彼此分離的目的。離心時，由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層向下沉降最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶，沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低，離心必須在沉降最快的大顆粒到達(dá)管底前結(jié)束。24（1）速率區(qū)帶離心法

(velocity25

分離密度相近而沉降速度不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。用途（1）速率區(qū)帶離心法

(velocitysedimentation)操作注意事項先在離心管中裝入密度梯度介質(zhì)。然后將預(yù)分離樣品混入一起離心。梯度液在離心過程中及離心完畢應(yīng)該避免因為震動而引起的粒子再混合。離心的時間要嚴(yán)格控制，如果時間過長，所有樣品可能全部到達(dá)離心管的底部；離心時間不足，樣品則還沒有完全分離。25分離密度相近而沉降速度不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。用26（2）等密度離心法

(isopycnicsedimentation)

原理

樣品顆粒在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心后，沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處達(dá)到平衡，從而將不同密度的顆粒分離。

特點(diǎn)

所需的力場通常比速率區(qū)帶離心法大10

100倍，往往需要高速或超速離心。26（2）等密度離心法

(isopycnic27

操作注意事項預(yù)先配置介質(zhì)的密度梯度溶液，將介質(zhì)和預(yù)分離樣品混合或者是置于梯度溶液頂部，這也是等密度區(qū)帶離心法產(chǎn)生梯度的兩種方法。離心所需時間以最小顆粒到達(dá)等密度點(diǎn)（即平衡點(diǎn)）的時間為基準(zhǔn)，有時長達(dá)數(shù)日。一旦達(dá)到了平衡，再延長離心時間也不能改變粒子的成帶位置。（2）等密度離心法

(isopycnicsedimentation)

用途

分離大小相同、密度不等的顆粒（如線粒體、溶酶體的分離。）27操作注意事項預(yù)先配置介質(zhì)的密度梯度溶液，將介質(zhì)和預(yù)分離28

例如：（1）用注射器和滴管由離心管上部吸出。

（2）有針刺穿離心管底部滴出。

（3）

用針刺穿離心管區(qū)帶部份的管壁，把樣品區(qū)帶抽出。

（4）用一根細(xì)管插入離心管底，泵入超過梯度介質(zhì)最大密度的取代液，將樣品和梯度介質(zhì)壓出，用自動部分收集器收集。

（2）等密度離心法

(isopycnicsedimentation)

收集區(qū)帶的方法28

例如：（2）等密度離心法

(isopy29沉降速度法：主要用于樣品純度檢查。沉降平衡法：常用的測量絕對分子量的方法。等密度區(qū)帶分析離心法：主要用在核酸的分析和研究中。四、分析離心法

分類29沉降速度法：主要用于樣品純度檢查。四、分析離心法分類30五、離心機(jī)的分類與結(jié)構(gòu)普通離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速6000rpm左右，容量為幾十毫升至幾升。轉(zhuǎn)子有角式和外擺式，其轉(zhuǎn)速不能嚴(yán)格控制，通常不帶冷凍系統(tǒng)，于室溫下操作，用于收集易沉降的大顆粒物質(zhì)，如紅血球、酵母細(xì)胞等。30五、離心機(jī)的分類與結(jié)構(gòu)普通離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速6000rpm31高速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速為20000～25000rpm，最大容量可達(dá)3升。轉(zhuǎn)頭多樣。一般都有制冷系統(tǒng)，以消除高速旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭與空氣之間摩擦而產(chǎn)生的熱量，離心室的溫度可以調(diào)節(jié)和維持在0～40C。通常用于微生物菌體、細(xì)胞碎片、大細(xì)胞器、免疫沉淀物等的分離純化工作，但不能有效地沉降病毒、小細(xì)胞器(如核蛋白體)或單個分子。

五、離心機(jī)的分類與結(jié)構(gòu)31五、離心機(jī)的分類與結(jié)構(gòu)32

超速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速可達(dá)50000～80000rpm，相對離心力最大可達(dá)510000g，離心容量由幾十毫升至兩升，設(shè)有冷凍系統(tǒng)、真空系統(tǒng)和安全保護(hù)系統(tǒng)。分離的形式是速率區(qū)帶離心和等密度區(qū)帶離心。最著名的生產(chǎn)廠商有美國的貝克曼公司和日本的日立公司等。五、離心機(jī)的分類與結(jié)構(gòu)32超速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速可達(dá)50000～80000rpm，相對33儀器特點(diǎn)

■轉(zhuǎn)速高達(dá)70,000rpm。

■日備有兩種檢測器，可供選擇：

．紫外(XL-A)：190-800nm，高靈敏度

．干涉光(XL-I)：適用于沒有紫外吸收之樣品，如碳水化合物，高濃度樣品

(<50D值)

■專利橢圓形全息衍射光柵、及四倍光束系統(tǒng)，減少散射光干擾。

■采用光電倍增管，大大提高檢測靈敏度。

■精確可靠的控制軟件及數(shù)據(jù)處理。

應(yīng)用范圍

■絕對／相對分子量測定

■樣品純度，濃度測定

■分子的聚和，解離分析

■熱動力學(xué)和流體力學(xué)參數(shù)確定

■核酸，蛋白及病毒測定與分析

■分子間之互相作用

■污泥處理設(shè)備配合核磁共振應(yīng)用

分析超速離心機(jī)

33儀器特點(diǎn)

■轉(zhuǎn)速高達(dá)70,000rpm。

■日備有兩種34

普通離心機(jī)：電動機(jī)、離心轉(zhuǎn)盤（轉(zhuǎn)頭）、調(diào)速器、離心套管與底座。高速、超速（冷凍）離心機(jī)：驅(qū)動電機(jī)、制冷系統(tǒng)、真空系統(tǒng)（超離有）、顯示系統(tǒng)、自動保護(hù)系統(tǒng)和控制系統(tǒng)組成。必要的配件為離心轉(zhuǎn)頭和離心管。

五、離心機(jī)的分類與結(jié)構(gòu)34普通離心機(jī)：電動機(jī)、離心轉(zhuǎn)盤（轉(zhuǎn)頭）、調(diào)速器、離心套管35（1）離心轉(zhuǎn)頭角式轉(zhuǎn)頭：角式轉(zhuǎn)頭是指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)頭。蕩平式轉(zhuǎn)頭：這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的4或6個自由活動的吊桶（離心套管）構(gòu)成。垂直轉(zhuǎn)頭：其離心管是垂直放置。區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個轉(zhuǎn)子桶和可旋開的頂蓋組成。連續(xù)流動轉(zhuǎn)頭：可用于大量培養(yǎng)液或提取液的濃縮與分離，轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似。五、離心機(jī)的分類與結(jié)構(gòu)35（1）離心轉(zhuǎn)頭角式轉(zhuǎn)頭：角式轉(zhuǎn)頭是指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定36五、離心機(jī)的分類與結(jié)構(gòu)（1）離心轉(zhuǎn)頭36五、離心機(jī)的分類與結(jié)構(gòu)（1）離心轉(zhuǎn)頭37

離心轉(zhuǎn)頭的注意事項1.每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累積限時，使用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書，不得過速使用。每一轉(zhuǎn)頭都要有一份使用檔案，記錄累積的使用時間，若超過了該轉(zhuǎn)頭的最高使用限時，則須按規(guī)定降速使用。

2.轉(zhuǎn)頭是離心機(jī)中須重點(diǎn)保護(hù)的部件，搬動時要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉(zhuǎn)頭長時間不用時，要涂上一層上光臘保護(hù)。五、離心機(jī)的分類與結(jié)構(gòu)（1）離心轉(zhuǎn)頭37離心轉(zhuǎn)頭的注意事項1.每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速離心機(jī)轉(zhuǎn)頭損壞的原因（操作或使用不當(dāng)所造成的）過速腐蝕金屬疲勞不平衡五、離心機(jī)的分類與結(jié)構(gòu)（1）離心轉(zhuǎn)頭離心機(jī)轉(zhuǎn)頭損壞的原因五、離心機(jī)的分類與結(jié)構(gòu)（1）離心轉(zhuǎn)頭39玻璃離心管絕對不能在高、超速離心機(jī)上使用。ＰＡ和ＰＰ管：化學(xué)性能穩(wěn)定，半透明，能耐高溫消毒。ＰＣ管：透明度好，能耐高溫消毒。但不耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿及某些有機(jī)溶劑。主要用于５萬轉(zhuǎn)／分以上離心。ＣＮ管：質(zhì)地較軟，透明，不能高壓消毒，但不耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿及某些有機(jī)溶劑，適合于蔗糖、甘油等密度梯度離心。因透明，利于收集。五、離心機(jī)的分類與結(jié)構(gòu)

離心管的選用39玻璃離心管絕對不能在高、超速離心機(jī)上使用。五、離心機(jī)的分40六、離心機(jī)的使用和維護(hù)離心方法的選擇一般是根據(jù)樣品顆粒的質(zhì)量和密度，選擇合適的離心方法。離心機(jī)的轉(zhuǎn)速和離心時間的確定：離心分離的效果除了與離心機(jī)種類、離心方法、離心介質(zhì)及密度梯度外，實(shí)際操作時，與離心機(jī)轉(zhuǎn)速、離心時間、離心介質(zhì)的pH值和溫度等條件有關(guān)。40六、離心機(jī)的使用和維護(hù)離心方法的選擇一般是根據(jù)樣品顆粒的41

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