第13章 生物制品分析概論

《藥物分析》課件第十三章

生物制品分析概論基本要求掌握：常用的定量分析方法中的色譜分析法。熟悉:該類藥物的質(zhì)量檢驗的基本程序與方法。了解：生化藥物和基因工程藥物定義、種類和特點。基本內(nèi)容一、概述二、鑒別試驗三、雜質(zhì)檢查四、含量（效價）測定練習(xí)與思考

1、生物制品藥物分析有那些特點？2、為什么必須對生物制品進行全程質(zhì)量控制？問題生物藥物（來源和生產(chǎn)方法）生化藥物生物合成藥物生物制品第一節(jié)概述2005年版藥典分為幾部？每部的收載內(nèi)容？生物藥物利用生物體、生物組織或組成生物體的各種成分，綜合運用生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、物理化學(xué)和藥學(xué)的原理與方法制得的一大類藥物。生物藥物發(fā)展過程：第一代：利用生物材料加工制成的含有某些天然活性物質(zhì)與混合成分的粗提取物制劑：魚肝油、胰酶及其腸溶、甲狀腺粉及其制劑等。第二代：根據(jù)生物化學(xué)和免疫學(xué)原理，應(yīng)用近代生化分離純化技術(shù)從生物體制取的具有針對性治療作用的特異生化成分。如：尿激酶、胰島素、人血白蛋白等。第三代：應(yīng)用生物工程技術(shù)生產(chǎn)的天然生理活性物質(zhì)，以及通過蛋白質(zhì)工程原理設(shè)計制造的具有比天然物質(zhì)更高活性的類似物，或與天然物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同的全新的藥理活性成分。如：重組人生長激素、重組人胰島素等。生化藥物定義：指從動物、植物及微生物提取的，也可用生物-化學(xué)半合成或用現(xiàn)代生物技術(shù)制得的生命基本物質(zhì)及其衍生物、降解物以及大分子的結(jié)構(gòu)修飾物等，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶、多糖、脂質(zhì)、核甘酸類。生物合成藥物定義:由微生物代謝所產(chǎn)生的藥物和必須利用微生物及其酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)共同完成的半合成藥物,如:山梨醇、木糖醇、甘露醇、維生素、甾體激素、酶與輔酶類藥物等。生物制品定義用普通的或以基因工程、細胞工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)獲得的微生物、細胞及各種動物和人源的組織和體液等生物材料制備，用于人類疾病預(yù)防、治療和診斷的藥品。包括：細菌類疫苗、病毒類疫苗、抗毒素及免疫血清、血液制品、細胞因子、體內(nèi)及體外診斷制品以及其他活性制劑微生態(tài)制劑:雙歧桿菌生物制品的種類和特點根據(jù)所采用的材料、制法或用途不同，可分為六類:疫苗類藥物:人用狂犬病疫苗抗毒素及抗血清類藥物:流感全病毒滅活疫苗;抗蝮蛇毒血清血液制品:人血白蛋白重組DNA制品診斷制品其他制品由于有效結(jié)構(gòu)或分子量不確定，其結(jié)構(gòu)的確證很難沿用化學(xué)藥物或結(jié)構(gòu)已知的生化藥物所常用的方法，還需要生物化學(xué)分析如：氨基酸組成、N末端氨基酸序列、肽圖等。大部分生物制品的活性組分均為大分子的生命物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、多糖類等）。組分相同，但相對分子量不同而產(chǎn)生不同的生理活性，因此常需進行相對分子量的測定。（二）生物制品的特點分子量不是定值。生化法結(jié)構(gòu)確證。需檢查生物活性。生物制品對熱、酸、堿、重金屬及pH等變化敏感，各種理化因素的變化易對生物活性產(chǎn)生影響。特別是多肽和蛋白質(zhì)。除理化分析，還需生物檢定，防止蛋白質(zhì)失活。要求安全性檢查。生物制品組分復(fù)雜，有效成分濃度很低，生物大分子雜質(zhì)含量比較高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，易引入特殊雜質(zhì)和污染物。如重組乙型肝炎疫苗涉及的安全性檢查包括：細胞外源因子檢查、原液、半成品、成品中有關(guān)血清白蛋白殘留量、CHO細胞DNA殘留量檢查、熱原檢查、過敏試驗、異常毒性檢查等。需做效價測定。對于生物制品有效成分的檢測，除應(yīng)有一般化學(xué)方法或理化分析進行有效成分含量測定外，更應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的特異生理效應(yīng)或?qū)Ｒ换磻?yīng)擬定其專屬性的生物效價測定方法，以表征其所含生物活性成分的含量。例：人凝血酶原復(fù)合物的效價測定。三、生物制品的全程質(zhì)量控制生物制品化學(xué)性質(zhì)與生物學(xué)性質(zhì)都很不穩(wěn)定，又易受微生物污染，故對生物制品的均一性、有效性、安全性和穩(wěn)定性等應(yīng)有嚴(yán)格要求，以生產(chǎn)出具有藥理活性高、針對性強、毒性低、副作用小，療效可靠及營養(yǎng)價值高等特點的安全、高效的生物制品。為此，必須進行原材料、生產(chǎn)過程和最終產(chǎn)品的全程質(zhì)量控制，以確保產(chǎn)品符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。生物制品及檢定規(guī)程草案（1952年）生物制品制造檢定規(guī)程（1959年）中國生物制品規(guī)程（2000年）中華人民共和國藥典三部（2005年）收載生物制品101種

生物制品品名定義、組成及用途基本要求制造檢定（原液、半成品、成品）保存運輸及有效期使用說明（僅預(yù)防類含此項）化學(xué)藥品品名化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子式性狀鑒別檢查含量測定藥典三部各論內(nèi)容藥典二部各論內(nèi)容生物制品質(zhì)量控制重點有效成分的同一性、結(jié)構(gòu)確證有效成分的均一性、純度檢查有害物質(zhì)及殘余雜質(zhì)等的控制高效、靈敏的生物活性及比活性等實驗方法生物制品質(zhì)量控制基本方法：鑒別試驗雜質(zhì)檢查安全性檢查含量測定（生物活性或效價）第二節(jié)鑒別試驗依據(jù)生物制品的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)特點，利用化學(xué)法、物理法及生物學(xué)方法進行某些特殊反應(yīng)，或測定某些專屬的理化常數(shù)如紫外吸收系數(shù)、等電點、電泳遷移率、色譜保留時間和肽圖等，判斷與確證產(chǎn)品的真?zhèn)巍＃ㄒ唤M實驗）一、理化鑒別法1、化學(xué)鑒別法

利用藥物與某試劑在一定條件下反應(yīng)，生成有顏色的產(chǎn)物或沉淀進行鑒別。如胰島素的沉淀反應(yīng)。2、紫外分光光度法

蛋白質(zhì)生物制品主要由芳香族氨基酸側(cè)鏈如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸產(chǎn)生紫外吸收。如重組人促紅素最大吸收279nm。3、高效液相色譜法

（主峰保留時間和肽圖的一致性）

例如重組人粒細胞集落刺激因子的肽圖分析二、生化鑒別法1、酶法利用酶對底物特異性的催化活力，做為酶類生物制品簡便、快速鑒別方法。如尿激酶的鑒別

2、電泳法

等電點聚焦電泳、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳等?？捎糜诘鞍踪|(zhì)類生物制品的鑒別。三、生物鑒別法（一）血清學(xué)法-體外抗原抗體試驗抗原抗體類生物制品的鑒別抗原抗體在體外結(jié)合時，可因抗原物理性狀不同或參與反應(yīng)的成分不同而出現(xiàn)各種類型的反應(yīng)，如凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、中和反應(yīng)和補體結(jié)合反應(yīng)，即經(jīng)典血清學(xué)反應(yīng)，在此基礎(chǔ)上，又衍生出免疫擴散、免疫電泳、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記等高度敏感的檢測技術(shù)。（二）生物學(xué)法利用生物體對生物制品特定的生物活性的反應(yīng)為基礎(chǔ)進行供試品的鑒別。例如:小鼠驚厥試驗鑒別胰島素肝素延長血凝鑒別肝素第三節(jié)雜質(zhì)檢查可用來判斷藥品的優(yōu)劣。由于生物制品來自生物體，生物活性特異性強，制造與純化工藝復(fù)雜，分子結(jié)構(gòu)常常不確定，有時產(chǎn)品并非單一，極微量雜質(zhì)可能產(chǎn)生顯著的效應(yīng)，因此，其雜質(zhì)檢查顯得尤為重要。主要包括：一般雜質(zhì)檢查特殊雜質(zhì)檢查安全性檢查

一般雜質(zhì)檢查氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液的澄清度、溶液的顏色、水份及干燥失重、熾燒殘渣等。一、特殊雜質(zhì)檢查從原料中帶入或生產(chǎn)工藝中或貯藏過程中引入的雜質(zhì)根據(jù)生物制品的生產(chǎn)工藝特點與產(chǎn)品的穩(wěn)定性，其特殊雜質(zhì)分為：生物污染物：微生物污染、宿主細胞蛋白、外源性DNA、培養(yǎng)基成分等產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)：二聚體和多聚體、脫氨或氧化產(chǎn)物、突變物、裂解產(chǎn)物等工藝添加劑：殘余抗生素、蛋白分離劑聚乙二醇、乙醇、佐劑氫氧化鋁，產(chǎn)品穩(wěn)定劑如辛酸鈉、肝素，防腐劑苯酚、硫柳汞，細菌與病毒滅活劑甲醛、戊二醛等。（一）宿主細胞蛋白殘留量測定生物制品生產(chǎn)用細胞、工程菌相關(guān)的特殊雜質(zhì)。目的：控制異源蛋白含量以防超量后引起機體免疫反應(yīng)測定法：酶聯(lián)免疫吸附劑測定法－ELISA（二）外源性DNA殘留量的檢查測定方法：分子雜交技術(shù)基于DNA結(jié)合蛋白分析系統(tǒng)實時定量PCR方法（三）產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)檢查生物制品在生產(chǎn)制造、分離純化和貯藏保存過程中產(chǎn)生的與產(chǎn)品結(jié)構(gòu)類似的同系物、異構(gòu)體、突變物、氧化物、聚合體或降解物。常用HPLC法和電泳法。如重組人生長激素中相關(guān)蛋白質(zhì)的測定總相關(guān)蛋白質(zhì)含量不超過10%。（四）殘余抗生素的檢查如果生物制品在生產(chǎn)過程中使用了抗生素，則不僅要在純化工藝中除去，而且要在原液檢定中增加殘余抗生素活性的檢測方法。常用方法：抑菌圈測量。結(jié)果判定：對照溶液有抑菌圈，陰性對照無抑菌圈，供試品溶液抑菌圈的直徑小于對照溶液抑菌圈的直徑時判斷為陰性；否則為陽性。二、安全性檢查（一）熱原檢查法和細菌內(nèi)毒素檢查法（二）異常毒性檢查（三）過敏試驗

檢查異性蛋白（四）降壓試驗

檢查組胺、類組胺或其他導(dǎo)致血壓下降的物質(zhì)（五）無菌試驗檢查藥品及敷料是否有活菌的一種方法含量測定HPLCSDS效價測定第四節(jié)：含量（效價）測定常用的定量分析方法及應(yīng)用理化分析法生化分析法生物檢定法理化分析法化學(xué)分析方法電化學(xué)分析法光譜分析法色譜分析法重量法容量分析法比色法

利用樣品與顯色劑發(fā)生現(xiàn)色反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色強度來測定含量。Elson-Morgan

硫酸軟骨素的比色法測定：在酸性條件下使樣品水解成氨基己糖，再在堿性條件下與乙酰丙酮和二甲氨基苯甲醛反應(yīng)生成紅色的產(chǎn)物，該產(chǎn)物在525nm處有最大吸收。光譜分析方法具體試驗操作：1、制備對照品溶液－鹽酸氨基葡萄糖2、制備供試品溶液－硫酸軟骨素3、反應(yīng)和測定－縮合反應(yīng)和比色測定A平為供試品溶液的吸收度As平為對照品溶液的吸收度Ws為對照品溶液的濃度（mg/ml）W為稱樣量（mg）0.8309為校正因子500為