生物技術(shù)-基因工程

重組DNA技術(shù)1第八章基因工程

23456基因工程的應(yīng)用7

首字母：大寫：細(xì)菌屬名2-3字母：小寫：細(xì)菌種名如EcoR14:大寫:菌株1，2…:分離到的次序第一節(jié)、工具酶一、限制酶（restrictionenzyme）：限制性內(nèi)切酶1類：限制和修飾作用

*2類：識別DNA內(nèi)部位點(diǎn)、切割雙鏈3類：同類．根據(jù)酶結(jié)構(gòu)、作用及DNA結(jié)合和裂解的特性1、分類2、命名89（2）產(chǎn)生平末端(bluntend):3.酶的識別和切割位點(diǎn):通常4-6bp,具有回文結(jié)構(gòu)(palindrom)（1）產(chǎn)生粘性末端(stickingend)5＇-末端:EcoR1:5＇-G

AATTC-3＇3＇-CTTAA

G-5’3＇-末端:Pst1:5＇-CTGCA

G-3＇3＇-G

ACGTC-5＇

Sma1:5＇-CCC

GGG-3＇3＇-GGG

CCC-5＇105.同尾酶(isoaudamers):識別序列不同,但產(chǎn)生相同的粘性末端BamH1:G

GATCCSau3A1:N

GATCN4.同功異源酶(isochizomers):來源不同,識別和切割位點(diǎn)相同

如:BamH1

和Bst1111、DNA聚合酶

大腸桿菌中第一個(gè)發(fā)現(xiàn)，MW109KD方向：5＇

3＇還具有5‘

3’及3‘

5’外切酶活性.缺口平移法標(biāo)記DNA時(shí)常用二修飾酶對DNA或RNA末端進(jìn)行剪切、補(bǔ)平、連接及化學(xué)修飾的酶。12兩類：禽類成骨細(xì)胞性白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（AMV）moloney小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（MMLV）

方向：5‘

3’作用：以RNA為模板合成DNA，構(gòu)建cDNA文庫2、逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）將3＇-OH與5＇-P連接形成3＇,5＇-磷酸二酯鍵3、T4DNA連接酶（T4DNAligase）134、堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）6、TaqDNA聚合酶和其它耐熱DNA聚合酶去除DNAorRNA5＇-P，制備載體時(shí)可防止載體自身連接，提高重組效率。5、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶：末端轉(zhuǎn)移酶作用：在DNA的3＇-OH上，加上dNTPPCR時(shí)14內(nèi)切酶、堿性磷酸酶、連接酶的作用15*分類：克隆載體 質(zhì)粒入噬菌體粘性質(zhì)粒M13噬菌體表達(dá)載體 大腸桿菌表達(dá)載體哺乳動物表達(dá)載體第二節(jié)載體*本質(zhì)：DNA攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載工具。16質(zhì)粒載體 大腸桿菌質(zhì)粒載體PBR322枯草桿菌質(zhì)粒載體PNC3酵母菌質(zhì)粒載體農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體Ti噬菌體載體

噬菌體載體Cos噬菌體載體病毒載體SV40病毒載體乳頭瘤病毒載體17⑴分子量相對較小，在細(xì)菌中穩(wěn)定存在，拷貝指數(shù)高。⑵具有遺傳標(biāo)記：如抗生素性基因

—半乳糖酶基因（LacZ）⑶具有多個(gè)酶的單一切點(diǎn)。稱多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsites,MCS）如PBR322(人工合成)4.3Kb：含AmP

(氨卞青霉素)、Tet

(四環(huán)素)24個(gè)單一切點(diǎn)一常用的克隆載體1. 質(zhì)粒（plasmid）：種類很多，但作為克隆載體須具備。18PBR32219質(zhì)粒的構(gòu)建20質(zhì)粒攜帶外源基因21溶菌性（Lytic）：在細(xì)菌中連續(xù)增殖直到細(xì)菌裂時(shí)，釋放噬菌體。溶原性（Lysogenic）：將其DNA整入細(xì)菌中。**只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶原周期。2.

噬菌體：最大容量：9—23kb感染細(xì)菌的病毒根據(jù)生活周期分⑴特點(diǎn)① 雙鏈DNA分子（線性或環(huán)形）② 兩端具有12個(gè)nt單鏈互補(bǔ)粘性末端③具非必需區(qū)（中間區(qū)約1/3長度）④可在E.Coli中大量繁殖⑤可克隆15Kb左右的外源基因22噬菌體的溶原周期和溶菌周期2324插入型載體：外源DNA克隆到

分子上，使噬菌體的某種生物功能喪失效力，即插入失活效應(yīng)。

如：

—半乳糖酶失活的插入型載體（藍(lán)白篩選）編碼

⑵載體類型（兩種）A:載體中含一個(gè)LacZ基因

半乳糖苷酶

X-gal(無色)X(藍(lán)色)+gal(半乳糖)*其中X為有色基因：（4-溴-5-氯吲哚）與gal結(jié)合成無色的X-galB:在含X-gal的培養(yǎng)基中，在Lac操縱子誘導(dǎo)物IPTG（異丙硫半乳糖苷）作用下，細(xì)菌合成半乳糖苷酶，分解X-gal，此菌落為藍(lán)色。25C.若LacZ基因被外源DNA插入而破壞，則不能制造半乳糖苷酶，菌落為無色（白色）。26②取代型載體（又叫替換型載體）圖8-4基因工程原理P258在

DNA分子的中央，插入一段DNA片段：具有多克隆位點(diǎn)的反向重復(fù)序列當(dāng)外源DNA插入時(shí)其可被置換掉作用：提高了克隆外源DNA的能力。27*由

DNA的Cos區(qū)與質(zhì)粒構(gòu)建*環(huán)狀雙鏈DNA特點(diǎn)；①含質(zhì)粒的抗性標(biāo)記如Amp

，Tet

②帶Cos區(qū)，可進(jìn)行體外包裝③一個(gè)或多個(gè)酶切位點(diǎn)④分子量小，容量大/篩選AP平板2、 粘性質(zhì)粒（Cosmid）：容量40-50kb282930（1）大腸桿菌噬菌體（2）基因組DNA全長6.5kb（單鏈）（3）感染后，可復(fù)制成雙鏈DNA（RF，DNA）（4）當(dāng)RF→100—200后，只有（+）鏈復(fù)制4種常用載體的比較P146表8—2篩選：藍(lán)白篩選3、 M13噬菌體（M13phage）3132在受體細(xì)胞中表達(dá)（轉(zhuǎn)錄和翻譯）外源基因的載體。二. 表達(dá)載體（expressingvector）㈠大腸桿菌表達(dá)載體除克隆載體的特性外還含有：表達(dá)系統(tǒng)元件啟動子核糖體結(jié)合位點(diǎn)克隆位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止信號啟動子：常用的有trp-lac啟動子（ortac啟動子）

噬菌體Pc啟動子T7噬菌體啟動子33除含有原核序列：在E-Coli中的復(fù)制起始點(diǎn)、便于篩選的抗性基因還包括真核表達(dá)元件啟動子/增強(qiáng)子克隆位點(diǎn)終止信號和加poly（A）信號㈡哺乳動物表達(dá)載體原核受體E-Coli受體系統(tǒng)外源基因復(fù)制、擴(kuò)增場所鏈霉菌受體系統(tǒng)外源基因表達(dá)場所

酵母菌受體系統(tǒng)真核受體動物（哺乳）細(xì)胞受體系統(tǒng)一般只作基因表植物/昆蟲細(xì)胞受體系統(tǒng)達(dá)場所基因工程的受體系統(tǒng)341.特點(diǎn)：①遺傳背景清楚——利于研究②繁殖快——易獲得大量基因產(chǎn)物（20’一代）③含質(zhì)?！诨蜣D(zhuǎn)移④表達(dá)非E-Coli基因，其潛力幾乎是無限的—.E-Coli受體系統(tǒng)2.缺點(diǎn)：①高水平表達(dá)基因產(chǎn)物易沉淀、凝集、不易折疊②基因產(chǎn)物純化工藝復(fù)雜③基因產(chǎn)物易受污染（內(nèi)毒素）④基因產(chǎn)物對受體菌有毒害作用⑤基因產(chǎn)物易被水解⑥從安全角度——并不理想⑦缺乏基因產(chǎn)物表達(dá)后加工機(jī)制35特點(diǎn)：①安全性大②遺傳信息和生理狀況更適合于真核基因表達(dá)③基因產(chǎn)物外分泌遺傳背景較清楚具基因表達(dá)后加工機(jī)制二.酵母菌受體系統(tǒng)36⑴目的基因的獲得⑵載體的選擇與制備⑶目的基因與載體的結(jié)合（DNA分子的體外連接）⑷重組DNA導(dǎo)入受體⑸重組體篩選和鑒定⑹目的基因表達(dá)⑺基因產(chǎn)物的分離純化第三節(jié)重組DNA技術(shù)的基本過程七步：37—.目的基因的制備方法：1.內(nèi)切酶法2.機(jī)械力降解3.化學(xué)合成4.cDNA合成5.PCR制備法6.從基因文庫中提取1.限制性內(nèi)切酶法（鳥槍法或散彈法）用酶降解染色體DNA（esp原核生物），將降解的DNA克隆到載體上，從而得到目的基因優(yōu)點(diǎn)：原理簡單，操作簡便，具有一定的應(yīng)用范圍。缺點(diǎn)：隨機(jī)性有限，盲目性大，篩選麻煩，應(yīng)用范圍有限（只適用于原核生物）382、機(jī)械降解法優(yōu)點(diǎn)：隨機(jī)性大缺點(diǎn)：所得基因片段不能直接連接，需加工修飾。用超聲波震蕩等機(jī)械法使DNA斷裂。3.cDNA合成cDNA文庫（Cdnalibrary）：將一個(gè)細(xì)胞中，所有cDNA都與載體連接成重組DNA，并列入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)