第九章核酸的分離與提純

第九章核酸的制備第一節(jié)核酸制備的基本原理核酸的種類

脫氧核糖核酸（DNA）：細胞核，單鏈或雙鏈

核糖體RNA

核糖核酸（RNA）轉運RNA

信使RNA細胞質，單鏈或雙鏈但無論哪核酸，在生物體中一般以核蛋白的形式存在，因此，為了提取制備核酸，必須將核蛋白解聯(lián)（即利用接聯(lián)劑將核蛋白裂解為核酸和蛋白）并去除蛋白，同時必須維持核酸的天然性狀，不使核酸發(fā)生變性或降解，操作上盡量簡化操作步驟，縮短操作時間，以減少各種不利因素對核酸的破壞，同時要求去蛋白迅速徹底。為了保證分離核酸的完整性及純度，在實驗過程中，應注意以下條件和要求：（1）盡量避免化學因素對核酸的降解

過酸或過堿以及其他化學因素將破壞多聚核苷酸鏈的磷酸二酯鍵，使核酸降解；核酸（特別是RNA）在堿性溶液中十分容易降解.因此抽提介質的pH常以5.5-9.0為宜。（2）減少物理因素對核酸的降解

物理因素主要是機械剪切力，包括強烈震蕩、攪拌、細胞突然置于低滲溶液中，以及讓溶液快速通過狹長的孔道；其次是凍融、高溫煮沸和輻射等，均將導致核酸的降解。機械剪切力主要破壞大分子量的線性DNA分子，而對分子量小的環(huán)狀質粒DNA及RNA分子，破壞相對較小。(3)防止核酸的生物降解細胞內(nèi)外各種核酸酶可作用于磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級結構，使其降解；DNA酶需要Mg2+、Ca2+的激活，因此實驗中常加入EDTA、檸檬酸鹽，以絡合核酸酶作用時所必需的Mg2+離子，以抑制DNA酶的活性；制備RNA則需克服核糖核酸酶（RNase）的降解作用。因為RNase不但分布廣泛，極易污染，而且耐高溫，即使加熱到蛋白變性，Rnase的活力也不會完全喪失，且具有驚人的回復力，而細胞內(nèi)的核蛋白又總是和它聯(lián)在一起，若去除不徹底，它將部分恢復活力，導致RNA降解。生物降解是RNA提取過程的主要危害，儲存的RNA制品也不例外，因此，為了抑制核酸酶的活性，一般在低溫下（4℃或0℃，甚至-20℃左右）進行。進行核酸分離時最好用新鮮生物組織或細胞樣品，若不能馬上進行提取，應將材料置液氮中或-80℃冰箱保存。分離純化核酸總的原則一是應保證核酸一級結構的完整性，這是研究核酸結構與功能的最基本要求；二是要排除蛋白質、脂類、糖類等其他物質的污染。純化的樣品不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑或過高濃度的金屬離子；蛋白質、脂類、糖類等的污染應降低到最低程度；無其他核酸的污染，如提取DNA時，應去除RNA。一般程序

1、供體的核酸分離

供體細胞培養(yǎng)收集(菌體)細胞細胞破碎分離總DNA分離細胞器分離總RNA分離細胞器DNARNApoly(A)RNA特異性RNA

染色體DNA(組建基因組文庫)2、載體DNA分離

載體DNA感染或轉染細胞（病毒型）轉化細菌細胞（質粒型）分離病毒顆粒培養(yǎng)轉化細胞、收集菌體

病毒載體DNA分離與純化破碎細胞

質粒DNA分離與純化3、DNA片段的分離DNA限制酶切凝膠電泳分離特定DNA片段的回收4、質量評估

1）

凝膠電泳2）光密度值測定3）限制酶切分析第二節(jié)核酸制備的基本方法核酸制備的步驟（1）抽提組織或細胞的破碎、消融。抽提核酸必須事先將生物材料破碎或消融，這關系到核酸回收率的高低。破碎與消融組織細胞，通常有使用勻漿器、搗碎器的機械方法以及溫和的反復凍融法，使用表面活性劑或各種酶處理的方法。（2）抽提核酸，去除與核酸結合的蛋白質、多糖、脂類，去除鹽、有機溶劑等雜質，以及去除其他不需要的核酸分子；（3）核酸的精制純化。一、細胞的破碎一般動物組織的細胞膜較脆弱，易破碎，而植物和微生物的細胞比較牢固。細胞破碎的方法很多，可根據(jù)組織特性和核酸分離目的加以選擇。1．物理方法(1)機械碾碎對于動物組織(如鼠肝、兔肝等)，一般多采用勻漿的方法。即將組織剪碎置研缽中，研碎。為了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。但要注意石英砂對有效成分的吸附作用。用勻漿器處理，也能把動物細胞破碎，此法較溫和，適于實驗室應用。若需大規(guī)模生產(chǎn)，則可用電動研磨法，酵母、植物組織的細胞破碎也可用此法。(2)組織搗碎器法是一種劇烈的破碎細胞的方法。搗碎器(8000-10000r/min)處理30～45s，植物和動物細胞能完全破碎。若用它破碎酵母菌和細菌的細胞，則需加入石英砂方才有效。在搗碎期間必須保持低溫，以防溫度升高引起有效成分變性，同時搗碎的時間不宜太長。(3)超聲波法是借助聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器的有效方法。由于細菌的外部有一層細胞壁，破壁較為困難，因此用超聲波處理細菌和酵母的時問要長一點。有些菌體破碎需要5～l0min或更長，如果在細胞浮液中加石英砂則可縮短時間。為了防止電器長時間運轉產(chǎn)生過多的熱量，常采用間歇處理和降低溫度的方法進行。(4)壓榨法是一種溫和、徹底破碎細胞的方法。即用高壓迫使幾十毫升細胞懸液通過一個小于細胞直徑的小孔，致使細胞被擠壓破碎。2．溶脹和自溶(1)溶脹概念：在低滲溶液，如低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子將大量進入細胞，致使細胞膜膨脹破裂的現(xiàn)象稱為溶脹。步驟：將細胞置低溫下冰凍一定時間，然后取出至室溫下(或40℃左右)迅速融解。如此反復凍融多次，細胞可在形成冰粒和增高胞液鹽濃度的同時，發(fā)生溶脹，以致破碎。(2)自溶概念：細胞結構在本身所具有的各種水解酶作用下，發(fā)生溶解的現(xiàn)象稱為自溶。注意：應用此法時要特別小心操作，因為水解酶不僅可破壞細胞壁、細胞膜，同時也可使某些有效成分在自溶時分解。3．化學處理用脂溶性的溶劑(如丙酮、氯仿、甲苯等)或表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉)處理細胞時，可使細胞壁和細胞膜的結構部分溶解，導致整個細胞破碎。4．生物酶降解生物酶有降解細菌細胞壁的功能。在用此法處理細菌細胞時，先是細胞壁消融，隨之而來的是因滲透壓差引起的細胞膜破裂，最后導致細胞完全破碎。二、核酸提取的基本方法1．去垢劑(SDS)法SDS(sodiumdodecylsulfate)：即十二烷基硫酸鈉，是一種有效的細胞消溶劑、核酸酶抑制和蛋白變性劑，也是一種去污劑。去垢劑法由Marmur于1961年創(chuàng)建，最早用于從細菌中提取DNA。原理：抽提核酸時利用SDS的非極性基團破壞蛋白質分子的次級鍵，使蛋白質變性，達到使核蛋白解聯(lián)、變性和去除蛋白的目的。變性后的蛋白仍留在溶液中不生成沉淀。為了將同時存在于溶液中的核酸和蛋白分開，可在室溫條件下加入1/2體積飽和硫酸銨使蛋白沉淀。特點：此法得率高，對核酸影響小，但制品中仍殘留微量蛋白。SDS在低溫或有兩價金屬離子或鉀離子存在時將形成沉淀，使用時應該注意。2．酚抽提法酚也是一種蛋白表面變性劑。球狀蛋白在水溶液中其親水性氨基酸殘基的側鏈位于外側，疏水性氨基酸的側鏈位于內(nèi)側，酚法于1957年為Kirby建立，最早用于DNA的抽提。酚的作用機制:可能是插入蛋白結構的內(nèi)部，破壞各種氨基酸殘基側鏈基團問的次級鍵，使蛋白的結構翻轉，即原來存在于內(nèi)側的疏水性氨基酸殘基側鏈轉向外側，而外側的親水性氨基酸殘基側鏈則轉向內(nèi)側，導致蛋白質變性。酚還能使核酸酶失活。3．CTAB法CTAB(eetyltriethylammoniumbromide):即十六烷基三乙基溴化銨，是一種去污劑。特點：此法相對較為簡單，特別適用于植物材料，已成功地從一系列的單子葉和雙子葉植物中提取出總DNA。此法提取植物DNA時，可采用氯仿/異戊醇反復抽提去蛋白，通過高鹽緩沖液的選擇性沉淀去除多糖類雜質.機制：可溶解細胞膜，能與核酸形成復合物，該復合物在高鹽溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶的，當溶液鹽濃度降低到一定程度(0.3mol/I．NaCl)時，卻會從溶液中沉淀出來，因此通過離心便可將CTAB與核酸的復合物同蛋白質、多糖類物質分開。然后將此復合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，因CTAB溶解于乙醇，離心后即可得DNA沉淀。優(yōu)點既適用于新鮮的植物，也可用于經(jīng)脫水處理的材料，能夠很好地去除多糖類雜質，對于含糖較高的植物材料可優(yōu)先采用。另一優(yōu)點是提取的前期能同時得到高含量的DNA及RNA，如果后續(xù)實驗對兩者都有需要，則可分別進行純化。如只需要DNA，則加入RNase除去RNA；若只需RNA，則加入DNase去掉DNA。該法制得的DNA雖然純度不很高，但仍能滿足限制性內(nèi)切核酸酶分析、PCR反應以及DNA重組克隆的要求。4．濃鹽法機制：高濃度的鹽可以破壞核酸和蛋白質之間的次級鍵，使核蛋白解聯(lián)。一般先用lmol/LNaCl或lmol/LNaClO4進行抽提，再加入氯仿/異戊醇離心去蛋白，最后用甲醇或異丙醇使核酸沉淀。其中的氯仿可以使蛋白表面變性，幫助去蛋白。異戊醇可以消泡以維持離心層的穩(wěn)定。特點：該法對核酸的損傷較小，但由于去除蛋白不夠徹底，常與其他方法結合使用。5．高通量的RNA分離技術(1)微量移液法(micropipeting)由Karrwer等人于1995年建立的一種方法。特點：此法借助毛細管或微量移液管直接提取細胞的內(nèi)含物，進行RNA抽提。操作過程用激光移液管拉伸器(1aserpipettepuller)將毛細石英管拉成孔徑為l0um的微量移液管，將其頂端彎曲23°，以便穿透細胞壁。微量移液管被安裝在連接了氣泵的微操縱器上，通過負壓將大約1ulRNA提取液(100mmol/LTris-HCl，pH8.0；500mmol/LLiCl；10mmol/LEDTA；1%SDS；5mmol/LDTT)壓入微量移液管。裝有提取液的微量移液管被降低到葉片表面，微量移液管頂點的那一小滴提取液在275kPa氣壓作用下被排出.一旦微量移液管尖端被清空后，立即供給1.3kPa的負壓，這時微量移液管就插入到目的細胞內(nèi)。一經(jīng)插入，細胞內(nèi)含物就被吸進微量移液管?？梢悦黠@地看到，細胞立刻癟了下去。然后，微量移液管離開細胞，內(nèi)含物被注入到10u1RNA提取液中，用69kPa和1.3kPa正、負壓反復作用，以便將微量移液管頂端漂洗干凈。此法可直接從葉片的表皮細胞、防御細胞以及葉肉細胞中提取mRNA，而葉片卻不受到損傷。隨后，再加入10u1RNA提取液，其中含有50ug連接了oligo(dT)-的磁力珠，混合均勻，22℃下靜置l0min。再用2ou11倍的反轉錄緩沖液(50mmol/Ltris-HCl，pH8.3；75mmol/LKCl；3mmol/LMgCl2；10mmol/LDTT)洗兩次，即可將結合在磁力珠上的mRNA洗脫下來。(2)激光微解剖法(1aser—capturemicrodissection，LCM)該法是將一塊被冷凍或被石蠟包埋的組織切成薄片，然后所需要的部位被激光解剖下來，再利用黏膜通過靜電作用迅速地將其吸附，并立即轉移到RNA提取液中。優(yōu)點：①它減少了對組織的處理，可避免RNA表達輪廓(profile)的改變；②因為某些實驗，特別是對時鐘基因的研究，時間因素至關重要，采用此法可減少采樣時間對實驗的影響。(3)原生質體分離法(protoplastingandsorting)特點：是一種快速而準確地從分生組織的細胞中提取RNA的技術，已應用于擬南芥根系全球性基因表達圖譜的制作。原理：首先需將熒光蛋白基因轉入受體細胞，用酶處理破壁后，通過紫外照射使那些表達綠色熒光蛋白的細胞產(chǎn)生熒光，再通過熒光感受分離儀(flurescence-activatedcellsorter，簡稱FACS)將其從特定組織或區(qū)域中分離出來，進而制得RNA三、核酸的濃縮和沉淀1．核酸的濃縮若溶液中DNA含量低，而且容積較大時，常需進行濃縮，以便進一步沉淀和純化。常用的核酸濃縮方法是真空干燥法。此法比較溫和，特別適用于小量樣品的濃縮。此外，還有以下兩種方法：(1)丁醇抽提濃縮法正丁醇或仲丁醇能吸收大量水，而DNA不溶于丁醇。利用該特性，向DNA溶液中反復加入等體積正丁醇或仲丁醇，振蕩混合后離心，去除有機相，可顯著減少DNA溶液的體積并濃縮DNA。(2)聚乙二醇(PEG)水沉淀法聚乙二醇同樣具有吸水能力。將DNA溶液裝入透析袋，包埋在聚乙二醇(分子量6000～12000為宜)中，聚乙二醇吸水液化，同時DNA溶液體積減小、可通過更換PEG干粉達到濃縮的目的。2．核酸的沉淀沉淀是濃縮核酸最常用的方法。其最大優(yōu)點是通過沉淀來改變和重新調節(jié)核酸溶液的濃度，并可去除溶液中某些鹽類和雜質，在一定程度上將核酸純化。核酸是多聚陰陽離子的水溶性化合物，它與鈉、鉀、鎂形成的鹽在多種有機溶劑中不溶解，也不會變性。常用的有機溶劑有乙醇、異丙醇、聚乙二醇等。(1)常用于沉淀核酸的鹽類及其濃度1)NaAc：沉淀DNA、RNA最常用的鹽類，終濃度為0．3mol/L(pH5.0)。2)NaCl：對于含有SDS的DNA樣品是優(yōu)先選用的試劑，終濃度為0.2mol/L。3)NHAc：4種dNTP在NHAc溶液中均具較高的溶解度，通過乙醇沉淀DNA，可去除大部分dNTP。4)KAc：沉淀效果與NaAc相同。終濃度為0.3mol/L。但核酸的鉀鹽很難溶于含SDS的溶液，若在下一步選用含SDS的緩沖液溶解核酸沉淀時，則不宜選用此法沉淀核酸。5)LiCl：在乙醇中溶解度非常好，在70％乙醇中不與DNA共沉淀，且高濃度0.8mol/L)時可直接沉淀大分子RNA(包括rRNA、mRNA)，故常用于RNA的沉淀。6)MgCl2：Mg2+是核酸沉淀中的有效離子，當核酸濃度低于0.1ug/ml或其長度小于100個核苷酸時，加入l0mmol/L的Mg2+可明顯提高核酸沉淀的回收率。Mg2+對核酸的沉淀并不需要低溫條件。即使在室溫條件下，10min之內(nèi)也比NaAc在0℃時沉淀DNA的效率高2倍。(2)沉淀核酸的有機溶劑1)乙醇：沉淀DNA一般首選乙醇，它對鹽類沉淀較少，含在DNA沉淀中的少量乙醇易被蒸發(fā)去除，不影響后續(xù)的實驗。在適當?shù)柠}濃度下，兩倍樣品容積的乙醇可有效沉淀DNA，對于RNA則需將乙醇用量增至2.5倍。優(yōu)點是所需的用量較少且速度快，適用于濃度低而體積大的DNA沉淀。0.54～1.0倍的異丙醇可選擇性地沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，但對5SRNA、tRNA及多糖不產(chǎn)生沉淀，一般不需在低溫條件下長時間放置。缺點是易使鹽類與DNA共沉淀，在DNA沉淀中的異丙醇難以揮發(fā)除去，所以通常要用70％乙醇漂洗DNA沉淀數(shù)次.(2)異丙醇:(3)聚乙二醇(PEG)：可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同分子量的DNA片段。應用PEG6000進行沉淀時，其使用濃度與DNA片段的大小成反比。PEG沉淀一般需要加入0.5mol/LNaCl或10mmol/LMgCl2。除去DNA沉淀中PEG的最簡單有效的辦法是用70％的乙醇漂洗2次。(4)精胺(spermine)：精胺不是有機溶劑，但可快速有效地沉淀DNA，適用于少量DNA的純化。原理:精胺與DNA結合后，使DNA在溶液中結構凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質雜質與DNA分子分開，達到純化DNA的目的。對于大于60bp的DNA片段，其濃度在0.1～100ug/ml左右，也有很好的效果。沉淀DNA的要求是溶液中無鹽或低鹽(小于0.1mol/L)，最后可用70％的乙醇漂洗2次以去除DNA沉淀中的精胺。(3)核酸沉淀的離心力與離心時間大多數(shù)DNA的沉淀在0～4℃、12000g離心10min即可。若DNA片段小于100個核苷酸時，則需要超速離心。對于pg水平的核酸沉淀，應加入tRNA作為載體共沉淀。四、核酸的純化方法:很多，如超速離心、柱層析、免疫沉淀、凝膠電泳等。實驗室最常用的純化方法:酚/氯仿抽提法。該方法的標準程序是用酚抽提一次，酚/氯仿(1:1)抽提一次，氯仿抽提一次。如果情況需要可再重復幾次?；驹?是通過交替使用酚、氯仿這兩種不同的蛋白質變性劑來增加去除蛋白質的效果。1．低分子物質的去除可以通過加入乙醇或用鹽溶液選擇性沉淀進行分離，也可以通過透析除去。例如:在醋酸根離子存在下加入乙醇，或在高濃度的鹽溶液中，或于低溫下的33%硫酸銨介質中，高分子量的RNA都可以沉淀。高分子物質主要指蛋白質和黏多糖.2．高分子物質的去除去此類高分子物質常用的方法有:如果核酸不是采用酚法制備的，可在對氨基水楊酸等化合物存在的條件下，將核酸制品連續(xù)用苯酚進行處理，此時DNA和RNA均進入水相，蛋白質沉淀留在酚相。然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，也可以用酚或SDS反復搖蕩抽提。如果是用酚法制得的核酸，則大部分蛋白質已被除去，若要進一步除去其中的微量蛋白，可用氯仿/異戊醇或辛醇振蕩抽提，同時加熱處理使蛋白質凝固形成沉淀，離心分離，核酸即留在溶液中。

第二個方法是Kirby創(chuàng)建并經(jīng)Ralph和Bellamy等改良的有機溶劑法。即在pH8的1.25mol/L磷酸緩沖液中，用2-甲氧基乙醇抽提，多糖溶于水相，核酸在有機相，加入CTAB(十六烷基三乙基溴化銨)沉淀核酸，然后在70%乙醇中用醋酸鈉處理，以鈉鹽的形式回收核酸。此外，也可以用鈣鹽沉淀DNA，再用草酸鉀處理形成DNA鉀鹽回收，然后用離子交換層析法吸附DNA使之與多糖分離。3．不同類型核酸的分離通?？刹捎妹柑幚?、有機溶劑抽提、鹽分步沉淀和密度梯度離心等方法。從DNA中除去RNA的有效方法是利用RNase選擇性地降解RNA。但由于RNase中常含有極微量的DNase，因而必須先將RNase試劑于80～100℃)加熱處理5～10min。反之，為了從RNA制品中除去DNA，可加入DNase降解DNA，加入的酶則利用酚法除去。其他除去DNA的常用方法是苯酚抽提法。4．同類核酸的分離在初步純化的RNA制品中，常含有各種RNA和某些降解RNA的混合物；在DNA制品中則往往含有變性或降解的DNA，通常多采用梯度離心、電泳、柱層析及反復萃取抽提等方法進一步純化或分級分離。五、超離心技術在核酸分離中的應用核酸的分離和純化，通常采用密度梯度離心法。密度梯度離心是一種帶狀分離法。密度梯度離心法包括密度梯度差速離心、等密度離心和浮力密度梯度離心。梯度溶液所使用的成分有蔗糖、甘油、氯化銫、氯化銣、右旋糖酐和蔗糖多聚物等。這些物質本身對核酸、蛋白質等具有化學惰性，因此不會導致其分子間的聚集，而且由于這些物質的黏性大，可以維持重力的穩(wěn)定性，防止由于局部溫度變化或機械振動所產(chǎn)生的對流,起著穩(wěn)定離心液保證分離效果的作用.

第三節(jié)DNA與RNA的制備一、供體DNA的分離與純化

要求：盡可能地保持其高分子量，無其它污染物.1、

基因組大小：染色體細菌3300~4200kb酵母15,000kb果蠅1.28x105kb人3x106kb植物2x105~1x108kb天花病毒288kb痘病毒196kb質體幾~100以上kb線粒體

藻類線狀15kb酵母環(huán)狀19~78kb植物環(huán)狀100~150kb動物(扁蟲到人)環(huán)狀15~18kb錐蟲網(wǎng)狀6000

kb(幼體)短膜蟲網(wǎng)狀30,000

kb(幼體)(Kinetoplast）葉綠體雙子葉植物121（菠菜）~154kb（豌豆）單子葉植物151（玉米）~182kb（浮萍）藻類132（裸藻）~191kb（衣藻）

1、

DNA分離純化過程

破碎細胞+DNA抽提液(EDTA、去污劑、還原劑)65℃溫育20’冰浴冷卻離心去細胞碎片苯酚抽提法①

CsCl密度梯度離心②2)CsCl密度梯度離心上清液加入固體CsCl與EtBr溶液室溫下超速離心(45,000rpm）16小時穿孔取出DNA（320nm）異丙醇抽提溴乙錠緩沖液透析除去殘余CsCl兩倍體積冷乙醇沉淀DNA離心、洗滌、干燥1)苯酚抽提法上清液緩沖液用水飽和苯酚抽提2~3次上層液相用氯仿抽至界面無蛋白變性物上層液相用兩倍體積冷乙醇沉淀沉淀物用70%冷乙醇洗滌,干燥溶于緩沖液加入RNAase處理除去RNA苯酚氯仿抽提沉淀干燥

*兩種方法比較：CsCl法操作步驟少，分離DNA分子量大，耗財多，且需超速離心機。苯酚法耗時少，不需昂貴儀器，但操作步驟多，易使DNA分子斷裂。若小心操作，所獲DNA亦符合要求。**上述兩種分離方法都包含了下述四個分離步驟ⅰ.可溶與不可溶物分離：高速離心除去細胞碎片，保留上清液。ⅱ.使蛋白質分離：苯酚抽提或超速離心ⅲ.使RNA分離：RNase處理或超速離心ⅳ.使DNA與其它可溶物分離2、細胞器DNA的分離

植物組織用核分離緩沖液勻漿過濾濾液離心(2000g,10’,4℃)核緩沖液使核裂解(含0.5%TritonX-100)抽提DNA植物組織細胞器緩沖液勻漿離心(100g,10’,4℃)除去細胞核離心(1800g,10’,4℃)分離葉綠體離心(10,000g,10’,4℃)分離線粒體DNase除去細胞器外DNA加入EDTA使DNase失活純化細胞器細胞器裂解提取DNA二、

載體DNA的分離與純化1、質粒載體DNA的分離關鍵：如何使質粒DNA與宿主染色體DNA分開原理：質粒DNA比染色體DNA小得多，在DNA抽提過程中，染色體DNA斷裂成小片段(線狀)，質粒DNA仍保持超螺旋構型.

方法：ⅰ.超速離心：利用兩種DNA分子的大小和空間構型ⅱ.變性法：在變性條件下使染色體DNA變?yōu)閱捂?，而質粒DNA仍保持環(huán)狀結構，當變性條件發(fā)生迅速變化時，前者仍不能復性，而后者又可回復到天然構型。變性條件可采用加熱煮沸法或堿變性法上述方法亦可用于ss環(huán)狀病毒DNARF型的分離,質粒DNA的氯霉素擴增使用并不廣泛（菌株和載體）2、噬菌體載體DNA的分離純凈病毒顆粒病毒載體DNAM13mp載體可采用質粒DNA的分離方法。二、RNA的分離與純化1.

制備RNA的關鍵-防止內(nèi)外源RNase的作用1)

RNase的特點：抗酸抗堿,具很廣pH作用范圍;抗高溫嚴寒(0~65℃均具活性）；抗變性劑2)

解決辦法：外源RNase—高溫，焦磷酸二乙酯(DEPC)處理所有溶液（Tris·HCl除外）和器皿，操作者帶手套。內(nèi)源RNase—高溫抽提，強蛋白質變性劑，RNase抑制劑，蛋白酶K等。2.

總RNA的制備根據(jù)所用蛋白質變性劑種類不一樣分為以下三種制備方法：1）熱苯酚抽提法2）胍鹽法：異硫氰酸胍和硫氰酸胍3）LiCl/尿素法其中以胍鹽法最好，對于從那些RNase含量很高的組織（胰臟）中提取RNA特別有效，可使RNase迅速變性，制備的RNA有較高翻譯活性。在RNA制備中，細胞破碎與蛋白質變性是同步進行的。3.

多聚核糖體RNA的制備1)

多聚核糖體的分離①超速離心法（30-40萬g，離心2-3h）②鎂鹽沉淀法（0.1MMg++