第八章 目的基因的分離克隆

第八章目的基因的分離克隆

第一節(jié)PCR技術(shù)在植物基因克隆中的應(yīng)用第二節(jié)基因文庫(kù)技術(shù)分離目的基因第三節(jié)mRNA差別顯示技術(shù)分離差別表達(dá)基因第一節(jié)PCR技術(shù)在植物基因克隆中的應(yīng)用PCR技術(shù)直接擴(kuò)增克隆目的基因

PCR技術(shù)克隆已知序列旁側(cè)的未知片段

PCR技術(shù)克隆新的未知基因一、PCR直接擴(kuò)增克隆目的基因PCR直接擴(kuò)增克隆是一種參考已知基因序列克隆基因的方法。目前已知很多植物基因的序列，當(dāng)克隆類似基因時(shí)，可先從Genebank庫(kù)中找到有關(guān)基因序列，用PCR方法克隆不同植物的基因。

一）從基因組DNA擴(kuò)增目的基因根據(jù)已知基因的序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物；（知道氨基酸序列，可以根據(jù)推測(cè)的堿基序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物）從植物中提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增片段的純化；酶切純化的擴(kuò)增片段及載體，并回收酶切片斷；將兩片段用連接酶連接；重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌；用酶切分析和序列分析檢測(cè)重組子，并與已知基因序列進(jìn)行比較；

二）從cDNA中擴(kuò)增目的基因（RT-PCR）對(duì)己知cDNA序列的目的基因可通過(guò)RT-PCR技術(shù)得到其所需片段。cDNA第一鏈的合成應(yīng)根據(jù)mRNA序列的復(fù)雜性及所擴(kuò)增區(qū)域的特性不同選取適宜的反轉(zhuǎn)錄酶和引發(fā)的引物。采用合理的策略和技術(shù)路線進(jìn)行。當(dāng)反轉(zhuǎn)錄完成后，以反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA第一鏈為模板，特異引物進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增。cDNA合成的引物

cDNA第一鏈的引物主要由RT-PCR的特定用途所決定，可由三種反式引發(fā)：以oligo（dT)為引物可與mRNA分子3‘末端的poly（A）序列相結(jié)合，有效的引發(fā)cDNA第一鏈的合成，對(duì)mRNA具有高效的特異性；對(duì)較長(zhǎng)序列的mRNA（大于3kb）分子，則較難得到全長(zhǎng)的cDNA。

以隨機(jī)六聚體的核苷酸為引物1）當(dāng)特定mRNA中由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止反應(yīng)的序列；2)mRNA分子較大且3‘端非編碼區(qū)序列較長(zhǎng)難以得到全長(zhǎng)序列的cDNA或完整的讀碼框時(shí)。當(dāng)使用隨機(jī)引物時(shí)，cDNA第一鏈的合成可能起始于mRNA上的許多部位，從而保證得到mRNA的編碼區(qū)和5‘端旁側(cè)；所有的RNA都可以作為cDNA第一鏈合成時(shí)的模板。以特異的寡核苷酸為引物

PCR反應(yīng)采用兩個(gè)特異引物，cDNA第一鏈的合成與mRNA3’端最靠近的配對(duì)引物起始。用特異引物引發(fā)cDNA第一鏈合成的好處是僅產(chǎn)生需要的cDNA，并導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。用RT-PCR擴(kuò)增目的基因的方法二、PCR克隆已知序列旁側(cè)的未知片段cDNA完整序列的獲得對(duì)基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)表達(dá)、基因功能的研究至關(guān)重要。在分離一種新轉(zhuǎn)錄的cDNA拷貝時(shí)，往往得到的cDNA克隆只是原mRNA的部分序列。運(yùn)用反向PCR、鍋柄PCR(PanhandlePCR)、連接介導(dǎo)PCR等PCR技術(shù)及cDNA文庫(kù)篩選技術(shù)為擴(kuò)增已知序列旁側(cè)的未知DNA片段提供了捷徑。然而,這些方法實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、費(fèi)用高，而且常出現(xiàn)PCR擴(kuò)增效率或特異性低等問(wèn)題。因而利用這些方法很不容易得到完整的全長(zhǎng)基因，尤其是基因的5′-端。cDNA末端的快速克?。≧ACE技術(shù)）

一）經(jīng)典RACERACE技術(shù)是通過(guò)以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈后，用PCR方法實(shí)現(xiàn)從基因內(nèi)部某個(gè)特定位點(diǎn)到3‘端或5’端之間未知序列克隆，因而有5‘－RACE和3’－RACE。

3’－RACE策略：以帶有Q0、Q1引物序列的oligo（dT)的引物QT為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA第一鏈以Q0和基因特異性引物（GSP1）進(jìn)行首次PCR擴(kuò)增以Q1和基因特異性引物（GSP2）為巢穴引物進(jìn)行嵌套式PCR擴(kuò)增，獲得所需的3‘端目的片段。

5‘-RACE策略：以基因特異引物（GSP-RT）將mRNA特異性反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈；在cDNA第一鏈3‘端加入poly（A）尾；以QT和GSP1進(jìn)行首次擴(kuò)增；以Q1和GSP2進(jìn)行第二次擴(kuò)增，最后獲得5‘端目的片段。經(jīng)典RACE原理示意圖二)新RACE一般的5‘－RACE技術(shù)中存在的最困難的一步誘導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄酶將目的mRNA反轉(zhuǎn)錄成完整的cDNA第一鏈。經(jīng)典RACE中反轉(zhuǎn)錄過(guò)程的提前終止導(dǎo)致非全長(zhǎng)第一鏈cDNA的多聚腺苷化，并在PCR中全部擴(kuò)增，全部cDNA在PCR中均能擴(kuò)增，產(chǎn)生非全長(zhǎng)cDNA5’末端，從而給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)一定難度。新RACE技術(shù)不同之處在于，錨定引物在反轉(zhuǎn)錄之前就連接到mRNA的5‘末端，因此，只有通過(guò)目的mRNA5’端全長(zhǎng)的反轉(zhuǎn)錄物，錨定序列才能整合到cDNA第一鏈中.基本原理用牛小腸磷酸酶（CIP）對(duì)mRNA脫磷酸化，脫磷酸化的作用只對(duì)降解的mRNA有效而對(duì)全長(zhǎng)的mRNA無(wú)效；用煙草酸性焦磷酸酶（TAP）處理全長(zhǎng)mRNA使其脫帽，即可使全長(zhǎng)mRNA5’端帶上活化的磷酸基團(tuán)；用T4RNA連接酶將其與一段由線性化質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的特異RNA寡核苷酸相連；用基因特異引物或隨機(jī)引物對(duì)RNA寡核苷酸－mRNA雜合體進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA第一鏈；用基因特異引物和RNA寡核苷酸特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得5‘端未知序列。新RACE與經(jīng)典RACE比較新RACE圖示第二節(jié)基因文庫(kù)技術(shù)分離目的基因

基因文庫(kù)的類別植物核基因組文庫(kù)構(gòu)建植物cDNA文庫(kù)構(gòu)建利用PCR技術(shù)構(gòu)建植物cDNA文庫(kù)一、基因文庫(kù)類別基因文庫(kù)：是指某一生物類型全部基因的集合。（這種集合是以重組體形式出現(xiàn)）某生物DNA片段群體與載體分子重組，重組后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出的單個(gè)菌落（或噬菌斑）即為一個(gè)DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合即為該生物的基因文庫(kù)。

意義：使生物的遺傳信息以穩(wěn)定的重組體形式儲(chǔ)存起來(lái)；分離克隆目的基因的主要途徑；是復(fù)雜基因組作圖的重要依據(jù)。文庫(kù)分離目的基因的主要內(nèi)容：基因的克隆；克隆基因的分離；分離基因的鑒定。

一）類別根據(jù)基因類型分：基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)；根據(jù)文庫(kù)功能分：克隆文庫(kù)和表達(dá)文庫(kù)；根據(jù)構(gòu)建文庫(kù)的載體分：質(zhì)粒文庫(kù)、噬菌體文庫(kù)；黏粒文庫(kù)；人工染色體文庫(kù)?；蚪M文庫(kù)：是指某生物的全部基因組DNA切割成一定長(zhǎng)度的DNA片段克隆到某種載體上而形成的集合。cDNA文庫(kù)：是指某生物某一發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。兩者區(qū)別：

cDNA文庫(kù)具有時(shí)效性

cDNA文庫(kù)只反應(yīng)mRNA的分子結(jié)構(gòu)克隆文庫(kù)：由克隆載體構(gòu)建。載體中具有復(fù)制子、多克隆位點(diǎn)及選擇標(biāo)記，可通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)使克隆片段大量增殖。表達(dá)文庫(kù)：是用表達(dá)載體構(gòu)建。載體中除克隆文庫(kù)的元件外，具有控制基因表達(dá)的序列（如啟動(dòng)子、SD序列等），可在宿主細(xì)胞中表達(dá)出克隆片段的編碼產(chǎn)物篩選：從克隆文庫(kù)分離某的基因主要利用核酸探針；從表達(dá)文庫(kù)分離某的基因除利用核酸探針外，還可以利用免疫學(xué)探針及生物功能進(jìn)行篩選。二）文庫(kù)構(gòu)建的基本程序植物DNA提取及片段化，或cDNA的合成；載體的選擇及制備；DNA片段或cDNA與載體連接；重組體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選；二、植物核基因組文庫(kù)構(gòu)建主要使用λ噬菌體置換型或黏粒載體（柯斯載體）隨機(jī)文庫(kù)克隆數(shù)目N=ln（1－P）/ln（1－X/Y）如：小麥基因組1.5x1010，在文庫(kù)中找到任一序列的概率不低于99％，則構(gòu)建的基因組文庫(kù)的克隆數(shù)目應(yīng)不少于4.1x106植物基因組大小及克隆文庫(kù)所需噬菌斑數(shù)1、基因組DNA的片段化隨機(jī)片段可通過(guò)機(jī)械切割或限制酶局部消化產(chǎn)生。機(jī)械切割可獲得較為均一的隨機(jī)片段，但片段不能直接用于克隆，須經(jīng)末端修飾，連上接頭后產(chǎn)生粘性末端才可以；限制酶局部消化可直接產(chǎn)生粘性末端，但片段的隨機(jī)性較差。一般采用Sau3AI（和BamHI同尾酶）在λ噬菌體載體上構(gòu)建基因組文庫(kù)植物基因組文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)流程2、核基因組文庫(kù)構(gòu)建的技術(shù)說(shuō)明較理想的置換型載體有EMBL、3EMBL4、2001等，能容納23kb外源片段，具有Spiˉ正選擇表型。載體臂的制備：用兩個(gè)靠近的限制酶進(jìn)行雙酶切，防止填充片段與臂的重新連接。DNA插入片段的制備：控制反應(yīng)時(shí)間及酶量；防止酶切后的片段重新連接；1）堿性磷酸酶除去5‘末端磷酸基團(tuán)，2）Klenow酶的凹陷末端不完全補(bǔ)平。三、cDNA文庫(kù)構(gòu)建步驟：細(xì)胞總RNA提取并分離純化mRNA；

合成cDNA第一鏈；將mRNA－DNA雜交分子轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA；

雙鏈cDNA的修飾；

雙鏈cDNA重組到載體上。一）RNA提取及

mRNA的純化用纖維素柱純化mRNA的流程示意圖二）合成第一鏈cDNA

oligo（dT）引導(dǎo)的cDNA合成法；隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA合成法；

三）mRNA-DNA雜交分子變?yōu)殡p鏈cDNA自身引導(dǎo)合成法：用堿處理使mRNA模板水解，從而導(dǎo)致第一鏈cDNA解離，并在其末端形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以此為引物合成cDNA第二鏈，用S1核酸酶切割除去發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。置換合成法：大腸桿菌RNaseH能夠識(shí)別mRNA－DNA雜交分子，將其中的mRNA模板消化成許多短片段，以這些mRNA短片段為引物，利用原來(lái)的cDNA為模板合成第二鏈cDNA，通過(guò)連接酶連接成完整的雙鏈cDNA分子。

oligo（dG）引導(dǎo)合成法：在第一鏈cDNA分子尚未與mRNA模板分離之前，先在其3‘－末端加上一段oligo（dG）序列，然后通過(guò)堿性蔗糖梯度離心處理，使mRNA模板分子發(fā)生水解作用，回收全長(zhǎng)的cDNA，以互補(bǔ)的oligo（dG）序列作引物引導(dǎo)第二鏈cDNA的合成。cDNA合成過(guò)程四）cDNA鏈的末端修飾合成的cDNA克隆前要經(jīng)末端修飾，使之能與載體的相應(yīng)末端連接。同聚物加尾：利用末端轉(zhuǎn)移酶在DNA分子3‘－OH加上一系列同種脫氧核苷酸。一般采用cDNA加上oligo（dC），載體加上與之互補(bǔ)的oligo（dG）。加接頭：利用T4DNA連接酶將接頭連接到cDNA平末端，（非平端可用Klenow補(bǔ)平），用限制酶進(jìn)行消化，產(chǎn)生帶粘性末端的cDNA。（此法須用甲基化酶對(duì)cDNA中的酶切位點(diǎn)進(jìn)行保護(hù)或采用罕見(jiàn)的接頭）

加銜接頭（子）：五）cDNA克隆載體用于植物cDNA文庫(kù)構(gòu)建的λ噬菌體載體主要有λgt10、λgt11等λgt10為免疫區(qū)插入型克隆載體，克隆位點(diǎn)位于cI基因內(nèi)，可以通過(guò)清亮噬菌斑（重組型）和混濁噬菌斑（非重組型）進(jìn)行篩選。文庫(kù)用核酸探針篩選。λgt11為－半乳糖苷酶失活型載體?？寺∥稽c(diǎn)位于lacZ基因內(nèi)，可以通過(guò)藍(lán)斑（重組型）白斑（非重組型）進(jìn)行重組體篩選。文庫(kù)即可用核酸探針篩選，也可用免疫學(xué)探針（抗體探針）進(jìn)行篩選。以質(zhì)粒為載體構(gòu)建cDNA文庫(kù)以λ噬菌體為載體構(gòu)建的cDNA文庫(kù)流程圖四、利用PCR技術(shù)構(gòu)建植物cDNA文庫(kù)cDNA文庫(kù)構(gòu)建的起始信息物質(zhì)是mRNA，植物細(xì)胞中mRNA含量較低，對(duì)于低豐度的mRNA，要通過(guò)富集或增大克隆數(shù)目來(lái)保證構(gòu)建的文庫(kù)中能含有所需克隆。用PCR技術(shù)構(gòu)建植物cDNA文庫(kù)優(yōu)點(diǎn)：能夠從極有限的起始材料中構(gòu)建cDNA文庫(kù)；可以以總RNA為模板合成cDNA，無(wú)需mRNA的純化，且避免低豐度信息分子的丟失；能夠提高cDNA文庫(kù)的完整性；末端轉(zhuǎn)移酶加尾法擴(kuò)增cDNA寡核苷酸銜接子法擴(kuò)增cDNA五、基因文庫(kù)篩選方法從文庫(kù)中篩選目的基因的方法主要有：核酸雜交法；免疫學(xué)檢測(cè)法；PCR篩選法等核酸雜交法適用于大量群體的篩選，可同時(shí)快速篩選克隆數(shù)目很大的文庫(kù)。對(duì)已知部分序列的目的基因的克隆，使用按已知信息合成的寡核苷酸探針；分離植物同源基因時(shí)，可根據(jù)保守序列合成同源探針；免疫學(xué)檢測(cè)使用抗體探針，通過(guò)檢測(cè)重組克隆表達(dá)出的蛋白質(zhì)來(lái)篩選目的克隆?？贵w探針只適用于表達(dá)文庫(kù)的篩選，且只能篩選出表達(dá)了的克隆。PCR篩選法是通過(guò)混合克隆的PCR，以盡可能少的PCR反應(yīng)次數(shù)從含成千上萬(wàn)個(gè)克隆的基因文庫(kù)中篩選出目的（陽(yáng)性）克隆?；蛭膸?kù)PCR篩選的“反應(yīng)池”示意圖第三節(jié)mRNA差別顯示技術(shù)分離差別表達(dá)基因一般真核生物基因的總數(shù)是10萬(wàn)個(gè)左右，在生物的一定發(fā)育階段或在某一類型的細(xì)胞中，大約只有15％的基因得到表達(dá)。基因的差別表達(dá)是生物個(gè)體發(fā)育的不同階段，或是在不同的組織或細(xì)胞中發(fā)生的不同基因按時(shí)間、空間進(jìn)行有序的表達(dá)方式。基因的差別表達(dá)是決定細(xì)胞分化的基礎(chǔ)，無(wú)論是正常的代謝變化還是非正常的變化，無(wú)論是由單基因還是由多基因控制的，這種變化都是由于基因表達(dá)的改變所引起的。1992年美國(guó)的liang和Pardee首次提出mRNA差別顯示技術(shù)。mRNA差別顯示技術(shù)是對(duì)組織特異性表達(dá)基因進(jìn)行分離的一種快速并行之有效的方法之一，簡(jiǎn)稱DDRT-PCR。是將mRNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與PCR技術(shù)相互結(jié)合發(fā)展起來(lái)的一種RNA指紋圖譜技術(shù)。一、mRNA差別顯示技術(shù)的基本原理真核生物基因中絕大多數(shù)mRNA在3‘末端都有poly（A）尾巴結(jié)構(gòu)，利用這一特征設(shè)計(jì)3’端錨定引物，將mRNA分成不同的群體。錨定引物的通式是oligo（dT）12MN，這樣共有12種oligo（dT）12MN引物，用這12種引物分別對(duì)同一總RNA樣品進(jìn)行cDNA合成。每一種3‘端錨定引物，都能夠把總mRNA群體的1/12分子反轉(zhuǎn)錄成mRNA-cDNA雜交分子。（DDRT）代表特異性表達(dá)基因的雜交分子在全部雜交分子中所占比例很低，須用PCR擴(kuò)增放大后進(jìn)行比較，才可能把它們從龐大的群體中分離出來(lái)。另外需要一種10個(gè)核苷酸組成的5‘端隨機(jī)引物。用3’錨定引物和5’隨機(jī)引物組成的引物對(duì)，以mRNA－cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以顯示50－100條長(zhǎng)度在100－500bp的DNA條帶

若用12中3‘錨定引物和20種5’隨機(jī)引物組成的240組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以得到20000條左右的DNA條帶，能覆蓋一定發(fā)育階段某種類型細(xì)胞中所表達(dá)的全部mRNA種類的96％。不同組織樣品的同一類cDNA的PCR選擇性產(chǎn)物在凝膠電泳上的差別表現(xiàn)在同一遷移位置上條帶的有和無(wú)、條帶所含分子數(shù)目的多少。條帶的有無(wú)反映出組織特異性表達(dá)基因的“開(kāi)”與“閉”，條帶所含分子數(shù)目多少則是mRNA劑量效應(yīng)的一種體現(xiàn)。二、mRNA差別顯示

技術(shù)的基本程序三、mRNA差別顯示技術(shù)優(yōu)點(diǎn)及局限性優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便性在技術(shù)上主要依靠PCR擴(kuò)增和聚丙稀酰胺變性凝膠電泳靈敏度高豐度較低的目的mRNA通過(guò)調(diào)整引物，進(jìn)行P