腫瘤轉(zhuǎn)移新進(jìn)展和機(jī)制

腫瘤轉(zhuǎn)移新進(jìn)展傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)早期腫瘤

腫瘤增大并且生成血管和淋巴管

淋巴管

腫瘤細(xì)胞擠入血管和淋巴管中通過(guò)血液通過(guò)淋巴循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤細(xì)胞

腫瘤細(xì)胞早期轉(zhuǎn)移

肝細(xì)胞腫瘤黏附于血管壁并且通過(guò)血管壁進(jìn)入血管以形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶淋巴結(jié)

腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，這種情形發(fā)生在大多數(shù)腫瘤中并在腫瘤形成的早期階段即可發(fā)生。然而，只有少數(shù)播散的腫瘤細(xì)胞能夠形成可見(jiàn)轉(zhuǎn)移病灶。血管壁的緊密連接、遠(yuǎn)處臟器非適宜環(huán)境及以正常器官對(duì)入侵腫瘤細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供給的限制是轉(zhuǎn)移灶形成的障礙之一。

新生血管的不完整性使得腫瘤細(xì)胞得以進(jìn)入的循環(huán)系統(tǒng)。這種不完整性是否也有利于循環(huán)腫瘤細(xì)胞從循環(huán)中回歸？

腫瘤細(xì)胞不需要進(jìn)一步的適應(yīng)原發(fā)腫瘤微環(huán)境便能夠進(jìn)入活躍狀態(tài)。

腫瘤轉(zhuǎn)移是否涉及自身的種植轉(zhuǎn)移？TumorSelf-Seedingby

CirculatingCancerCells我們一直認(rèn)為癌細(xì)胞離開(kāi)原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處臟器是一個(gè)單向的過(guò)程。最新研究表明，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CirculatingCancerCells,CTCs）也能夠移居到原發(fā)腫瘤，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)之為“腫瘤自種植（TumorSelf-Seeding）”。

霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所斯隆-凱特琳癌癥中心腫瘤生物學(xué)和遺傳學(xué)項(xiàng)目TumorSelf-SeedingbyCirculatingCancerCells.Cell.2009Dec24;139(7):1315-26.新進(jìn)展TumorSelf-Seedingby

CirculatingCancerCells一.“TumorSelf-Seeding”現(xiàn)象是否存在？

一、“self-seeding”現(xiàn)象

1.將標(biāo)記GFP-熒光素酶的MDA231-LM2（人乳腺癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞群）接種于小鼠的一側(cè)乳腺，構(gòu)建—“釋放”瘤體2.將未標(biāo)記細(xì)胞接種于對(duì)側(cè)乳腺，構(gòu)建—“接受”瘤體3.60天后將“接受”瘤體切除，并應(yīng)用體外生物發(fā)光成像技術(shù)檢測(cè)瘤體是否存在標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)在85%的“接受”瘤體內(nèi)能夠檢測(cè)到標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察“接受”瘤體的冰凍切片RT-PCR檢測(cè)在“接受”瘤體內(nèi)含熒光標(biāo)記mRNA腫瘤細(xì)胞約占整個(gè)瘤體細(xì)胞數(shù)的5%-30%。

現(xiàn)象的普遍性

與空白對(duì)照組比較轉(zhuǎn)移灶播散的腫瘤細(xì)胞能否侵入到“接受”瘤體內(nèi)？

首先將熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞由尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，確定形成肺內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤后，在小鼠乳腺建立“接受”瘤體模型。10/11(91%)小鼠“接受”瘤體內(nèi)發(fā)現(xiàn)熒光標(biāo)記腫瘤細(xì)胞循環(huán)腫瘤細(xì)胞的含量與自我種植腫瘤細(xì)胞的含量呈正比TumorSelf-Seedingby

CirculatingCancerCells一.“TumorSelf-Seeding”現(xiàn)象是否存在？

存在二.在腫瘤細(xì)胞群體中，哪一細(xì)胞亞群來(lái)完成“TumorSelf-Seeding”？SW620,A375,MDA231：祖代細(xì)胞vs轉(zhuǎn)移性細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)移性細(xì)胞亞群自我種植能力為祖代細(xì)胞的8-35倍！自種植腫瘤細(xì)胞亞群分析

人乳腺癌細(xì)胞株MDA231

人黑色素瘤細(xì)胞株A375從一側(cè)乳腺“釋放”瘤體種植到對(duì)側(cè)乳腺“接受”瘤體的能力比較。＞100倍從血液循環(huán)中種植到“接受”瘤體能力比較。6倍穿血管內(nèi)皮層遷徙能力比較。4-6倍S1代細(xì)胞基因特征基因表型特征與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合TumorSelf-Seedingby

CirculatingCancerCells一.“TumorSelf-Seeding”現(xiàn)象是否存在？

存在二.在腫瘤細(xì)胞群體中，哪一細(xì)胞亞群來(lái)完成“TumorSelf-Seeding”？S1代三.“TumorSelf-Seeding”是如何實(shí)現(xiàn)的？具體機(jī)制？三、“self-seeding”機(jī)制研究初步機(jī)制1.構(gòu)建小鼠乳腺腫瘤模型（“接受”瘤體、未作標(biāo)記）。2.10天后經(jīng)左心室注射表達(dá)LacZ/GFP/luciferase的MDA231“循環(huán)細(xì)胞”。3.LacZ基因是大腸桿菌乳糖操縱子中的一個(gè)基因，LacZ基因編碼的beta--半乳糖苷酶，可催化乳糖的水解。Beta-gal比較穩(wěn)定，用X-Gal(5-N-4-氯-3-u2115,tt–beta--半乳糖普）為底物進(jìn)行染色時(shí)，呈藍(lán)色。1. 注射腫瘤細(xì)胞后其立即在體內(nèi)廣泛分布。0-7天逐漸清除，從7天開(kāi)始僅在“接受”瘤體內(nèi)局限分布。42天圖，標(biāo)記腫瘤細(xì)胞在“接受”瘤體內(nèi)，而模擬接種組的乳腺內(nèi)無(wú)種植。

瘤體因素4.轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株比其祖代細(xì)胞更具種植于“接受”瘤體的能力。循環(huán)腫瘤細(xì)胞因素1.“接受”瘤體的因素推論與假設(shè)2.循環(huán)腫瘤細(xì)胞的因素吸引循環(huán)腫瘤細(xì)胞？響應(yīng)“吸引”浸透瘤體？條件培養(yǎng)基：

腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)的培養(yǎng)基正常細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)的培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證---穿血管內(nèi)皮遷移試驗(yàn)與正常細(xì)胞條件培養(yǎng)基相比，在腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基條件下循環(huán)腫瘤細(xì)胞更容易實(shí)現(xiàn)穿血管內(nèi)皮遷移。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證---穿血管內(nèi)皮遷移試驗(yàn)

腫瘤條件培養(yǎng)基：祖代腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移性亞群腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基結(jié)果一：在兩種腫瘤條件培養(yǎng)基條件下相同的循環(huán)腫瘤細(xì)胞具有相同的穿血管內(nèi)皮遷移能力。結(jié)果二：轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞亞群較其祖代細(xì)胞更具穿血管內(nèi)皮遷移能力，且與腫瘤條件培養(yǎng)基的種類(lèi)無(wú)關(guān)。一、“接受”瘤體的腫瘤細(xì)胞釋放某種信號(hào)來(lái)吸引循環(huán)中腫瘤細(xì)胞穿透血管內(nèi)皮層。二、高侵襲性腫瘤細(xì)胞較其它亞群腫瘤細(xì)胞更具響應(yīng)“吸引”實(shí)現(xiàn)穿透血管內(nèi)皮的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)論“吸引”相關(guān)調(diào)節(jié)因子

為了進(jìn)一步研究具體的腫瘤源性吸引因子，篩選腫瘤條件條件培養(yǎng)基中180種細(xì)胞因子的分泌水平。分析發(fā)現(xiàn)與普通條件培養(yǎng)基相比，腫瘤條件培養(yǎng)基中含有更高水平的IL-6,IL-8,oncostatinM,andVEGF；和更低水平的CCL2。分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證正常細(xì)胞條件培養(yǎng)基中加入IL-6orIL-8，進(jìn)行腫瘤細(xì)胞穿膜遷徙試驗(yàn)：

A圖：未加血管內(nèi)皮層B圖：添加血管內(nèi)皮層。AB體內(nèi)IL-6,IL-8在吸引循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的作用？研究發(fā)現(xiàn)IL-8對(duì)MDA231的遷徙無(wú)明顯作用，進(jìn)一步研究表明這種腫瘤細(xì)胞不表達(dá)IL-8受體。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)將S1代細(xì)胞的IL-6R基因及其轉(zhuǎn)錄相關(guān)正調(diào)節(jié)因子IL6ST基因封閉后，其自我種植率明顯降低?！皾B透”相關(guān)調(diào)節(jié)因子轉(zhuǎn)移性相關(guān)基因在MDA231-S1亞代中的增強(qiáng)表達(dá)說(shuō)明循環(huán)腫瘤細(xì)自我種植優(yōu)先涉及到具有轉(zhuǎn)移潛質(zhì)腫瘤細(xì)胞亞群。

為了明確介導(dǎo)滲透功能的相關(guān)因子，研究人員從表達(dá)在原發(fā)乳腺癌腫瘤并證實(shí)與乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)的因子中進(jìn)行篩選。篩選標(biāo)準(zhǔn)：在原發(fā)腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的這些因子賦予腫瘤細(xì)胞潛在的侵透優(yōu)勢(shì)，正如介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵入的循環(huán)中一樣。研究發(fā)現(xiàn)：三種基因符合標(biāo)準(zhǔn)，膠原酶-1（基質(zhì)金屬蛋白酶-1）、成束蛋白-1、CXCL1（趨化因子）。這三種基因的均涉及到侵襲和滲透功能，重要的是其在原發(fā)乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)與肺轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移有關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶MMP-1：幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分,破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用，從而在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用日益受到重視，被認(rèn)為是該過(guò)程中主要的蛋白水解酶。Fascin-1：成束蛋白，是肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白中與癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)時(shí)絲狀偽足、微棘異常形成有關(guān)的主要分子。已證實(shí)與惡性膠質(zhì)瘤和結(jié)直腸癌的遷移和侵襲能力有關(guān)。CXCL1：是一小分子的細(xì)胞因子屬于CXC趨化因子家族，又被稱(chēng)作生長(zhǎng)調(diào)節(jié)致癌基因α，參與新血管形成、炎癥反應(yīng)、傷口愈合和腫瘤形成。實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)S1腫瘤細(xì)胞內(nèi)的FSCN1,CXCL1,andMMP1表達(dá)水平是其祖代腫瘤細(xì)胞MDA231的11倍--100倍。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)將S1內(nèi)三種基因做不同模式的封閉，再進(jìn)行穿血管內(nèi)皮遷徙試驗(yàn)，以此來(lái)觀察這些基因在腫瘤“種植”中的作用。應(yīng)用應(yīng)用RNA干擾后三種基因的表達(dá)情況基因封閉后的腫瘤細(xì)胞在穿血管內(nèi)皮試驗(yàn)中的表現(xiàn)1.單獨(dú)封閉MMP1或CXCL1，對(duì)穿內(nèi)皮遷徙能力無(wú)影響。2.FSCN1的封閉明顯降低遷移能力。3.聯(lián)合封閉MMP1

和FSCN1進(jìn)一步降低其遷徙能力。4.CXCL1和FSCN1的聯(lián)合封閉無(wú)進(jìn)一步降低。對(duì)MMP1或FSCN1得封閉對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)影響。相應(yīng)動(dòng)物試驗(yàn)中也得出了相似的結(jié)論IL-6，8在瘤體吸引循環(huán)腫瘤細(xì)胞的過(guò)程中具有重要調(diào)節(jié)作用。FSCN1和MMP1在循環(huán)腫瘤細(xì)胞再次滲透到腫瘤的過(guò)程中具有重要調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)論TumorSelf-Seedingby

CirculatingCancerCells一.“TumorSelf-Seeding”現(xiàn)象是否存在？

存在二.在腫瘤細(xì)胞群體中，哪一細(xì)胞亞群來(lái)完成“TumorSelf-Seeding”？S1代三.“TumorSelf-Seeding”是如何實(shí)現(xiàn)的？瘤體“吸引”IL-6,8循環(huán)腫瘤細(xì)胞“滲透”FSCN1,MMP1四.“TumorSelf-Seeding”后的影響？

背景：

多項(xiàng)研究證實(shí)侵襲性腫瘤細(xì)胞可能通過(guò)旁分泌形式釋放某些刺激信號(hào)促進(jìn)腫瘤血管形成和營(yíng)養(yǎng)性細(xì)胞基質(zhì)的募集以此來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。(Carmeliet,2005;CoussensandWerb,2002;JoyceandPollard,2009;TistyandCoussens,2006)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞“self-seeding”后是否釋放某種物質(zhì)反作用于“接受”瘤體？四、“self-seeding”影響

小鼠乳腺建立MDA231腫瘤模型，10天后經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)注射LacZ/GFP/luciferase-表達(dá)的MDA231-LM2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比，研究組瘤體明顯增大。實(shí)驗(yàn)研究

“接受”瘤體的增大是因?yàn)槠浼?xì)胞數(shù)量的增加而不是因?yàn)槠涿芏鹊臏p低。組織切片的β-半乳糖苷酶藍(lán)色發(fā)現(xiàn)LacZ+種植細(xì)胞約占整個(gè)“接受”瘤體內(nèi)腫瘤細(xì)胞數(shù)量的7%-19%，這一數(shù)量并不能與瘤體的增大一致。少量MDA231-LM2細(xì)胞種植于“接受”瘤體后能夠通過(guò)旁分泌途徑釋放某種物質(zhì)到細(xì)胞外基質(zhì)中以此促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，提高其生長(zhǎng)率。實(shí)驗(yàn)結(jié)論機(jī)制？通過(guò)數(shù)字圖像定量分析腫瘤脈管CD31染色，發(fā)現(xiàn)“接受”瘤體內(nèi)毛細(xì)血管分支的長(zhǎng)度和寬度增加。CD31是一個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面130KD的糖基化蛋白質(zhì)。

免疫組化檢測(cè)泛白細(xì)胞標(biāo)記CD45，“接受”瘤體內(nèi)白細(xì)胞遷移增多。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在“接受”瘤體內(nèi)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞（CD68+）增多。應(yīng)用RNAi將“自種植”腫瘤細(xì)胞的CXCL1封閉與封閉MMP1和FSCN1不同，封閉CXCL1并不能減少M(fèi)DA231cells穿血管內(nèi)皮細(xì)胞遷徙和“自我種植”程度；但是，明顯減少對(duì)粒細(xì)胞的募集。CXCL1是一小分子的細(xì)胞因子屬于CXC趨化因子家族，又被稱(chēng)作生長(zhǎng)調(diào)節(jié)致癌基因α，參與新血管形成、炎癥反應(yīng)、傷口愈合和腫瘤形成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。TumorSelf-Seedingby

CirculatingCancerCells一.“TumorSelf-Seeding”現(xiàn)象是否存在？

存在二.在腫瘤細(xì)胞群體中，哪一細(xì)胞亞群來(lái)完成“TumorSelf-Seeding”？S1代三.“TumorSelf-Seeding”是如何實(shí)現(xiàn)的？