解磷細(xì)菌4的分離篩選及解磷能力研究

解磷細(xì)菌4的分離篩選及解磷能力研究

磷酸是植物生長(zhǎng)所必需的三個(gè)養(yǎng)分之一。中國(guó)土壤的總磷含量一般為0.02%0.11%，但可以直接吸收的有效磷含量一般不超過(guò)總磷含量的5%。大多數(shù)磷與土壤結(jié)合，如鈣、磷、鐵、磷和al3。這是一個(gè)很難分解的磷酸。因此，全國(guó)74%的耕地土壤缺磷，土壤中95%以上的磷是無(wú)效的磷。解磷菌可以將土壤中易分解或分解的磷轉(zhuǎn)化為易植物吸收的磷，提高土壤的磷含量，增加作物的磷含量，提高作物的產(chǎn)量。同時(shí)，它可以促進(jìn)植物根系硫、銅等養(yǎng)分的吸收，提高植物的抗逆性，減少污染。因此，利用解磷菌制備的細(xì)菌產(chǎn)品具有很大的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。在前蘇聯(lián)、東歐、印度、加拿大、中國(guó)等前蘇聯(lián)、東歐、印度、加拿大、中國(guó)等前蘇聯(lián)、東歐、黃褐色、卡其色、假單胞菌、假單胞菌、土壤侵生細(xì)菌、真菌、真菌、微生物等。目前，我國(guó)一些土壤和植物種類的解磷酶抑制劑的形成機(jī)制不同，而且復(fù)雜，主要包括解磷酶、乙酸、磷酸酶等藥物，以及過(guò)度磷酰胺等。目前，我國(guó)一些土壤和植物種類的解磷酶誘導(dǎo)劑的產(chǎn)生率不同，主要是通過(guò)某些地區(qū)的水果、蔬菜、花卉、中藥、小麥等作物生產(chǎn)而獲得的。然而，關(guān)于促進(jìn)水稻生產(chǎn)力的藥物結(jié)磷酶的報(bào)道很少。紅壤廣泛分布于中國(guó)南部和中部的熱帶和亞熱帶地區(qū),面積113萬(wàn)km2,占國(guó)土面積的11.8%.在紅壤地區(qū)種植的主要農(nóng)作物是水稻,該地區(qū)的稻米產(chǎn)量占全國(guó)的80%,并養(yǎng)活著全國(guó)22.5%的人口.酸、粘、瘠、旱是紅壤的主要肥力特征.紅壤對(duì)磷有強(qiáng)大的吸附固定力,磷肥易被土壤中活性鐵、鋁固定而使大多數(shù)有效態(tài)磷轉(zhuǎn)化為各種形態(tài)的非有效磷,從而大大降低磷肥的利用率.施用磷肥時(shí)間愈久,其肥效愈低.因此,如何充分利用溶磷微生物來(lái)溶解積累于土壤中的磷源、提高磷的利用率,一直是農(nóng)學(xué)、土壤學(xué)及生態(tài)環(huán)境工作者所關(guān)注的問(wèn)題.本研究從江西鷹潭紅壤稻田采集土樣,分離篩選適合酸性紅壤性水稻土應(yīng)用的高效土著解磷細(xì)菌,并對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,制成菌肥施用于有效磷含量較低的酸性紅壤稻田,以期發(fā)揮其高效解磷作用、提高紅壤稻田磷肥利用效率、部分代替無(wú)機(jī)磷肥并促進(jìn)水稻增產(chǎn).1材料和方法1.1磷、溶解ca3po42的量枯草芽孢桿菌,徐州華龍高效復(fù)合菌劑廠提供,其降解有機(jī)磷、溶解Ca3(PO4)2的量分別為107.4mgL-1、163.9mgL-1;溶解AlPO4的能力較弱,僅為2.1mgL-1.在本研究中作為對(duì)照.1.2微生物分離和復(fù)篩從位于江西鷹潭的中國(guó)科學(xué)院紅壤生態(tài)試驗(yàn)站(28°15′30″N,116°55′30″E)稻田耕作層土壤(0~15cm)中分離篩選微生物.分離篩選用培養(yǎng)基分別為無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基和有機(jī)磷培養(yǎng)基.選取分離培養(yǎng)基上透明圈與菌落直徑比值(HD/CD)較大的菌株進(jìn)行液體發(fā)酵試驗(yàn)復(fù)篩.1.3菌株鑒定及pcr擴(kuò)增形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定:取合適稀釋度的細(xì)菌純培養(yǎng)菌液涂平板,30℃恒溫培養(yǎng).待長(zhǎng)出菌落后,觀察菌落的大小、顏色等特征.革蘭氏染色,顯微鏡觀察個(gè)體形態(tài).另外,進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵、檸檬酸鹽試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、接觸酶檢驗(yàn)等生理生化鑒定.分子生物學(xué)鑒定:提取和純化菌體DNA,用細(xì)菌通用引物BSF8(5’-TATCCTATGCCTTACACTTC-3’)和BSR1541(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3’)擴(kuò)增16SrDNA.PCR反應(yīng)體系(50μL)為5μL10×PCR緩沖液,0.2mmol/LMgCl2(25mmolL-11.4菌種生物量的測(cè)定在250mL三角瓶中分別加入50mL無(wú)機(jī)磷、有機(jī)磷液體培養(yǎng)基,接種1mL菌懸液,對(duì)照用1mL無(wú)菌水代替菌懸液,在30℃,150rmin-1下分別振蕩培養(yǎng)7d和5d.所有處理進(jìn)行3次重復(fù).通過(guò)鑒定菌液D440nm評(píng)價(jià)菌體生物量;將培養(yǎng)液在6000rmin-1下離心20min,通過(guò)鉬藍(lán)比色法測(cè)定上清液中有效磷含量來(lái)評(píng)價(jià)解磷量.1.5土壤有效磷的測(cè)定采集江西鷹潭余江縣紅壤性水稻土,風(fēng)干并過(guò)2mm篩該土壤母質(zhì)為第四紀(jì)紅粘土(Quaternaryredclay),基本化學(xué)性質(zhì)為pH(H2O)5.2~5.3、全氮1.69gkg-1、全磷0.35gkg-1、全鉀33.2gkg-1、有機(jī)質(zhì)32.1gkg-1、速效氮145.4mgkg-1、有效磷5.21mgkg-1、速效鉀91.5mgkg-1.主要的氧化物為氧化鐵(游離氧化鐵約49%)和氧化鋁(游離氧化鋁約10%).設(shè)滅菌與不滅菌兩組處理,土壤滅菌采用24h內(nèi)間歇滅菌3次,每次121℃、1h.各處理稱取200g土裝入500mL玻璃瓶中,加入菌劑10g(有效活菌數(shù)≧2億個(gè)g-1),調(diào)節(jié)土壤水分為田間最大持水量的60%.置于28℃下培養(yǎng),分別在d7、d15、d25、d35、d45、d55采樣測(cè)定土壤有效磷含量.所有處理進(jìn)行3次重復(fù).1.6細(xì)菌劑的生產(chǎn)和陸地社區(qū)試驗(yàn)1.6.1解磷菌的活性將篩選獲得的高效解磷菌株在徐州華龍高效復(fù)合菌劑廠生產(chǎn),拌加草碳(有機(jī)質(zhì)含量50%~70%,腐植酸含量20%~40%,含氮、磷、鉀總量大于3%)制成固體菌劑.菌劑中解磷菌有效活菌數(shù)≧2億個(gè)g-1,有效磷及總磷的含量分別為0.61mgkg-1、0.35gkg-1.1.6.2土壤理化性質(zhì)2009年在江西鷹潭早稻、晚稻田中布置試驗(yàn)小區(qū),施用研制的菌劑.早稻、晚稻田間小區(qū)各設(shè)4個(gè)和3個(gè)試驗(yàn)處理(表1),每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù).早稻小區(qū)面積為11.4m×5.5m=62.7m2.土壤母質(zhì)為第四紀(jì)紅粘土,基本化學(xué)性質(zhì)為pH(H2O)5.3~5.4,全氮1.51gkg-1、全磷0.35gkg-1、全鉀33.8gkg-1、有機(jī)質(zhì)31.2gkg-1、速效氮142.8mgkg-1、有效磷4.87mgkg-1、速效鉀88.2mgkg-1.晚稻小區(qū)面積14.08m×11.4m=160.5m2,土壤基本化學(xué)性質(zhì)同1.5.早、晚稻中化肥(單肥)和菌劑施用量見(jiàn)表1,其中單肥作基肥和追肥施用,早稻中菌劑作追肥施用,晚稻中菌劑做基肥施用.1.7數(shù)據(jù)處理及分析用SPSS16.0forWindows對(duì)不同利用方式之間的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析、方差分析(ANOVA),差異水平通過(guò)鄧肯法檢驗(yàn);運(yùn)用MEGA4.0對(duì)測(cè)定所得DNA序列分析、繪制系統(tǒng)發(fā)育樹.2結(jié)果與分析2.1t4溶解alpo4和磷礦粉的能力從江西紅壤性水稻土篩選到解磷細(xì)菌11株,溶解AlPO4的能力介于101.3~334.2mgL-1之間,其中菌株T4溶解AlPO4和磷礦粉的能力最高,分別為334.2mgL-1、193.1mgL-1.與徐州華龍高效復(fù)合菌劑廠生產(chǎn)用解磷菌X3的解磷能力相比,T4溶解AlPO4、磷礦粉的能力較X3強(qiáng)(表2).2.2菌株t4的識(shí)別2.2.1基因型菌株的鑒定結(jié)果菌株T4在固體解磷培養(yǎng)基上培養(yǎng),菌落顏色為乳白色,中間凸起,無(wú)同心圈,表面光滑,無(wú)光澤,生理生化鑒定結(jié)果為革蘭氏陰性菌,顯微鏡觀察(×1000)結(jié)果顯示細(xì)胞形態(tài)為桿狀,不運(yùn)動(dòng)(圖1).革蘭氏染色、葡萄糖發(fā)酵、檸檬酸鹽試驗(yàn)、硝酸鹽試驗(yàn)、接觸酶、卵黃反應(yīng)試驗(yàn)等呈陽(yáng)性,硫化氫試驗(yàn)、V.P試驗(yàn)呈陰性,初步生理生化鑒定該菌株屬于伯克霍爾德菌屬.2.2.2srdna分析通過(guò)測(cè)定菌株T416SrDNAPCR產(chǎn)物序列,獲得序列信息與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中其它的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較,用MEGA4.0軟件構(gòu)建T4的16SrDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2),將菌株T4鑒定為伯克霍爾德菌屬(Burkholderiasp.).2.3菌株t4的降解磷能力不同碳源對(duì)菌株T4的生長(zhǎng)及解磷都影響較大,所試驗(yàn)的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉等幾種碳源中,最適合菌株Y8生長(zhǎng)和解磷的碳源為乳糖.不同氮源對(duì)菌株T4的解磷液影響較大,硫酸銨、硝酸鉀、尿素、蛋白胨幾種氮源中,最適合菌株T4生長(zhǎng)和解磷的氮源為硝酸鉀;當(dāng)提供的氮源為尿素時(shí),基本不解磷.菌株T4對(duì)pH有較廣的適應(yīng)范圍,在pH4.0和11.0時(shí)仍具有解磷能力,最適pH為7.0~8.0.菌株T4菌體量及解磷量在20~35℃范圍內(nèi)隨溫度升高而增加,超過(guò)35℃時(shí),菌體量及解磷量開(kāi)始下降;最適溫度為35℃左右.根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,按正交設(shè)計(jì)表[L9(34)]進(jìn)行試驗(yàn),優(yōu)化菌株T4的解磷培養(yǎng)條件.最優(yōu)組合為:乳糖15gL-1,KNO31.0gL-1,pH為7.0,溫度為30℃,此時(shí)溶解AlPO4的量為806.3mgL-1.最佳培養(yǎng)條件下菌體生長(zhǎng)和解磷曲線見(jiàn)圖3.實(shí)驗(yàn)顯示,隨著時(shí)間的增加,菌體量與解磷量逐漸增多且成正相關(guān),培養(yǎng)48h后菌液pH下降,并且開(kāi)始具有解磷能力,pH與解磷能力呈反相關(guān);培養(yǎng)至120h后D440nm、pH及解磷量基本穩(wěn)定(圖3).2.4不添加菌劑對(duì)土壤解磷效果的影響紅壤性水稻土接入菌劑T4于28℃培養(yǎng)7d以后,未滅菌處理、滅菌處理土壤有效磷含量比未接菌土壤分別增加了3.78mgkg-1、2.48mgkg-1(圖4).未滅菌處理結(jié)果顯示,添加菌劑T4在短期(15d)內(nèi)解磷效果明顯,比未接菌土壤和接種X3對(duì)照解磷量分別增加93.4%和32.5%.2.5農(nóng)田測(cè)試2.5.1不同化肥用量對(duì)水稻產(chǎn)量的影響在早稻育秧秧田施用菌劑,秧苗生長(zhǎng)較為粗壯,與未施菌劑對(duì)照相比效果明顯.田間小區(qū)試驗(yàn)表明,施用菌劑可在不降低水稻產(chǎn)量的情況下減少化肥用量(圖5):在施用菌劑T475.0kg/hm2、常規(guī)N、K肥和70%P肥的情況下(處理4),可獲得施常規(guī)化肥(處理1)的水稻產(chǎn)量,比施常規(guī)N、K肥和70%P肥的對(duì)照(處理2)產(chǎn)量提高將近11.6%.2.5.2不同施肥量的產(chǎn)量結(jié)果在2009年種植的農(nóng)香98晚稻小區(qū),施用菌劑T475.0kg/hm2和施常規(guī)氮、K肥的處理(處理3)與不施磷肥、僅施常規(guī)氮、鉀肥的對(duì)照(處理1)相比,平均產(chǎn)量提高7.5%;與當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施肥處理(處理2)的產(chǎn)量相比低1.9%,但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)上顯著差異(圖6).說(shuō)明解磷菌劑可起到代替大部分磷肥的作用.3菌株t4的生物活性及菌肥施用本研究得到的解磷細(xì)菌為伯克霍爾德菌屬(Burkholderiasp.).已報(bào)道的解磷細(xì)菌主要有芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、歐文氏菌(Erwinia)、土壤桿菌(Agrobacterium)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderiasp.)、黃桿菌(Flavobacterium)等.現(xiàn)有研究較多關(guān)注溶解Ca3(PO4)2的解磷菌,本研究旨在篩選適合紅壤應(yīng)用、能溶解紅壤中含量較高的特征性磷酸鹽AlPO4及磷礦粉的解磷細(xì)菌,獲得的菌株T4較趙小蓉等獲得的解磷細(xì)菌、徐州華龍高效復(fù)合菌劑廠生產(chǎn)用解磷菌X3(表2)和我們篩選獲得的另一菌株Y8相比,溶解AlPO4及磷礦粉的能力較高,同時(shí)T4還具有一定的溶解Ca3(PO4)2的的能力,因此菌株T4具有較好的綜合解磷能力,有望成為開(kāi)發(fā)紅壤高效微生物磷肥的優(yōu)良微生物資源.對(duì)T4的解磷條件研究發(fā)現(xiàn),不同碳源對(duì)菌株T4生長(zhǎng)及解磷量影響較大,菌體量與解磷量存在相關(guān)性(圖3),這與現(xiàn)有的一些報(bào)道不同,這些報(bào)道認(rèn)為不同碳源對(duì)解磷菌生長(zhǎng)影響不大,且菌體生長(zhǎng)量與其解磷量沒(méi)有明顯相關(guān)性[21~22]如Narsian等發(fā)現(xiàn)解磷菌Aspergillusaculeatus能利用11種不同的碳源物質(zhì),其中以阿拉伯糖、葡萄糖為碳源時(shí)解磷活性最高,并且發(fā)現(xiàn)菌體生長(zhǎng)量與其解磷量之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性,其原因可能與糖類不同的結(jié)構(gòu)有關(guān),菌體更適宜利用某種結(jié)構(gòu),需要的酶越少,過(guò)程越簡(jiǎn)單,從而可能更易產(chǎn)酸.氮源物質(zhì)可以改變解磷微生物產(chǎn)有機(jī)酸或釋放H+的溶磷機(jī)制,改變其溶磷能力.本研究顯示不同氮源對(duì)菌株T4的解磷量影響很大,氮源為硝酸鉀時(shí)解磷量最高,當(dāng)提供的氮源為尿素時(shí)基本不解磷,這與現(xiàn)有報(bào)道也不相同,如有的報(bào)道表明氮源為硫酸銨時(shí)的解磷量是硝酸鉀時(shí)的80多倍.大多數(shù)研究表明銨態(tài)氮是溶磷微生物的必需氮源,對(duì)銨態(tài)氮有依賴性,甚至依靠吸收銨態(tài)氮分泌出H+質(zhì)子溶磷[24~25].室內(nèi)培養(yǎng)條件下對(duì)紅壤性水稻土的解磷效果研究顯示,接種菌株T4可使未滅菌處理、滅菌處理土壤有效磷含量分別增加3.78mgkg-1、2.48mgkg-1,與現(xiàn)有資料報(bào)道相比,顯示出T4在紅壤中具有較好的溶解磷的作用.菌株T4是江西紅壤土著解磷細(xì)菌,具有較高的溶解AlPO4、磷礦粉的能力.在江西鷹潭進(jìn)行的初步大田小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果顯示菌株T4具有代替一部分化肥的作用,即菌株T4制成微生物菌肥施用于水稻田可減施磷肥30%而不致水稻減產(chǎn).從試驗(yàn)土壤的理化指標(biāo)看,試驗(yàn)小區(qū)土壤的有效磷含量較低而有效氮含量相對(duì)較高[27~28],土壤中有效磷相對(duì)缺乏,施用菌劑可使土壤中部分被固定的磷轉(zhuǎn)化為易于被植物吸收利用的有效磷而被作物吸收利用,這樣減施磷肥30%而不致水稻減產(chǎn).本研究顯示,土壤中有效磷相對(duì)缺乏是菌肥發(fā)揮肥效的前提,但是另一方面,在稻田中施過(guò)多的菌劑也未能使水稻進(jìn)一步增產(chǎn),施菌劑比施化肥將使種稻成本略有提高,根據(jù)初步大田小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果,每畝施用菌劑5~7kg而減施磷肥30%將增加費(fèi)用50~80元/畝.從早、晚稻田施用菌肥效果看,T