苜蓿根瘤菌accc17631和accc177菌株培養(yǎng)基配方優(yōu)化

苜蓿根瘤菌accc17631和accc177菌株培養(yǎng)基配方優(yōu)化

紫草是世界上最大的科劇作家，被稱為“繁殖之王”。它豐富、高含量和良好的口感可以解決水產(chǎn)養(yǎng)殖中蛋白質(zhì)和食物不足的問(wèn)題。研究表明,播種前對(duì)苜蓿進(jìn)行根瘤菌接種,可增加苜蓿的出苗率、抗病蟲(chóng)害能力,明顯提高牧草產(chǎn)量以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。接種根瘤菌劑已成為世界各國(guó)豆科作物增產(chǎn)的一項(xiàng)技術(shù)措施,在許多國(guó)家都有大規(guī)模的商品菌劑生產(chǎn)和出售,應(yīng)用面積不斷擴(kuò)大。為了適應(yīng)中國(guó)苜蓿根瘤菌肥生產(chǎn)的需求,本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化篩選最適合苜蓿根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)生長(zhǎng)的碳源、氮源及培養(yǎng)基配方,由于不同的根瘤菌對(duì)其培養(yǎng)基中的最佳碳氮源的選擇存在差異,故選擇2株苜蓿根瘤菌ACCC17631和ACCC17676作為供試菌株進(jìn)行對(duì)比,以期為苜蓿根瘤菌今后的研究與菌肥生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1生長(zhǎng)特性菌株及其特性:快生型苜蓿根瘤菌ACCC17631和ACCC17676,由中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心提供。2株菌均屬于苜蓿中華根瘤菌,菌體小桿狀,在根瘤菌培養(yǎng)基上菌落為圓型、乳白色、半透明,邊緣整齊,有粘質(zhì),在B.T.B反應(yīng)中產(chǎn)酸,在石蕊牛奶中均凝結(jié)。2株根瘤菌在pH4.0～9.0范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)。根瘤菌ACCC17631在含鹽量為4.0%NaCl的YMA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)正常,ACCC17676耐鹽性略差,在含鹽量3.5%NaCl的YMA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)正常,2株菌均適合華北、東北、西北等鹽堿土地區(qū)接種使用。培養(yǎng)基:YMA液體培養(yǎng)基(g·L-1):甘露醇10,K2HPO40.25,KH2PO40.25,MgSO4·7H2O0.2,酵母粉0.8,NaCl0.1,蒸餾水1000mL,pH6.8～7.0。1.2培養(yǎng)基碳源的篩選菌種活化:在斜面培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48h后,接種到Y(jié)MA液體培養(yǎng)基中,28℃,150r·min-1轉(zhuǎn)速的搖床中震蕩培養(yǎng)48h制成接種液。培養(yǎng)基碳源的篩選:YMA培養(yǎng)基中分別用等量蔗糖、葡萄糖、甘露醇及麥芽糖作為碳源,培養(yǎng)基其他部分保持不變。將活化菌液按1%(V/V)接種量接入裝有50mL液體培養(yǎng)基的100mL三角瓶中,28℃,150r·min-1震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)期間用分光光度計(jì)每6h測(cè)定菌液OD600nm吸光度值,連續(xù)測(cè)定60h,分別繪制苜蓿根瘤菌ACCC17631和ACCC17676在不同碳源下的生長(zhǎng)曲線并選出各自的最佳碳源,每處理均重復(fù)4次。培養(yǎng)基氮源的篩選:YMA培養(yǎng)基中分別用等量酵母粉、蛋白胨、大豆粉作為氮源進(jìn)行試驗(yàn),培養(yǎng)基其他成分不變。將活化菌液按1%(V/V)接種量接入裝有50mL液體培養(yǎng)基的100mL三角瓶中,28℃,150r·min-1震蕩培養(yǎng)。用分光光度計(jì)測(cè)定OD600nm值,繪制苜蓿根瘤菌ACCC17631和ACCC17676在不同氮源下的生長(zhǎng)曲線并選出最佳氮源。正交試驗(yàn):根據(jù)上述單因子試驗(yàn)得出結(jié)果,對(duì)選定的碳源、氮源、磷源以及MgSO4·7H2O這4種主要成分進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),培養(yǎng)48h后,用分光光度計(jì)測(cè)定OD600nm值,分析4種物質(zhì)對(duì)苜蓿根瘤菌的影響度及最佳劑量組合。驗(yàn)證試驗(yàn):用已篩選得到的最佳培養(yǎng)基與試驗(yàn)中OD600nm值最高的培養(yǎng)基進(jìn)行比較,驗(yàn)證正交試驗(yàn)的結(jié)果。2結(jié)果與分析2.1雙組分生長(zhǎng)效果碳源是根瘤菌培養(yǎng)基中必不可少的組成成分,是構(gòu)成根瘤菌細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳架來(lái)源的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),因此對(duì)根瘤菌培養(yǎng)基中碳源進(jìn)行篩選對(duì)根瘤菌生長(zhǎng)有至關(guān)重要的作用。蔗糖、葡萄糖、甘露醇以及麥芽糖4種常見(jiàn)碳源對(duì)苜蓿根瘤菌ACCC17631和ACCC17676生長(zhǎng)的影響結(jié)果如圖1和圖2所示。不同碳源對(duì)苜蓿根瘤菌ACCC17631和ACCC17676生長(zhǎng)具有不同的影響。根瘤菌ACCC17631在蔗糖和甘露醇為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好,且蔗糖略優(yōu)于甘露醇,生長(zhǎng)60h后,其OD600值最高分別達(dá)到1.884和1.819。在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)間短,其OD600值最高達(dá)到1.203,在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最差,其OD600值最高僅達(dá)到0.745。根瘤菌ACCC17676在蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好,其OD600值高達(dá)1.920,在甘露醇中生長(zhǎng)次之,60h后OD600值為1.563,在以葡萄糖和麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較差。由于甘露醇在生產(chǎn)成本上遠(yuǎn)高于蔗糖,所以選擇蔗糖作為ACCC17631和ACCC17676根瘤菌培養(yǎng)基進(jìn)一步優(yōu)化的碳源。2.2accc1731在大豆粉培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況氮源對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果如圖3和圖4所示。根瘤菌ACCC17631在大豆粉為氮源的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)快于在其他氮源中的生長(zhǎng)速度,60h后,ACCC17631在大豆粉中的OD600值達(dá)到2.129,在蛋白胨中卻僅為1.164。由圖4可知,根瘤菌ACCC-17676在以酵母粉為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)效果最好,OD600最高達(dá)到2.079,大豆粉次之,其OD600最高達(dá)到1.9055,蛋白胨的利用效果最差。故選擇大豆粉作為根瘤菌ACCC17631培養(yǎng)基進(jìn)一步優(yōu)化的氮源,而選酵母粉作為根瘤菌ACCC17676培養(yǎng)基中的最優(yōu)氮源。2.3培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)accc17651發(fā)酵的影響在篩選培養(yǎng)基碳源、氮源的基礎(chǔ)上,對(duì)培養(yǎng)基的主要成分:蔗糖、大豆粉(酵母粉)、K2HPO4/KH2PO4和MgSO4·7H2O做正交設(shè)計(jì)試驗(yàn),進(jìn)一步優(yōu)化確定最佳組合劑量。正交設(shè)計(jì)方案及結(jié)構(gòu)如表1所示。結(jié)果表明:ACCC17631在3號(hào)配方的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度最快,其次為6號(hào)培養(yǎng)基(表1);由表2所示方差分析結(jié)果表明:大豆粉、K2HPO4/KH2PO4和MgSO4·7H2O對(duì)根瘤菌ACCC17631的活菌數(shù)影響極顯著(F>F0.01);蔗糖對(duì)其影響不顯著(F<F0.05)。表3所示極差分析結(jié)果表明:ACCC17631在優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),4種營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)其生長(zhǎng)速度影響順序是:酵母粉(B)>MgSO4·7H2O(D)>K2HPO4/KH2PO4(C)>葡萄糖(A),最佳表現(xiàn)組合為A3B3C1D3,即蔗糖20g,大豆粉2.4g,K2HPO40.25g,KH2PO40.25g,MgSO4·7H2O0.2g;ACCC17676在8號(hào)配方的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度最快,其次是6號(hào)培養(yǎng)基(表1)。表4所示方差分析結(jié)果表明:蔗糖、大豆粉、K2HPO4/KH2PO4以及MgSO4·7H2O對(duì)根瘤菌ACCC17676的活菌數(shù)影響均極顯著(F>F0.01)。而表3所示極差分析結(jié)果表明:ACCC17676在優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),4種營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)其生長(zhǎng)速度影響的順序是:MgSO4·7H2O(D)>酵母粉(B)>葡萄糖(A)>K2HPO4/KH2PO4(C),最佳表現(xiàn)組合為A3B3C1D3,即蔗糖20g,酵母粉2.4g,K2HPO40.25g,KH2PO40.25g,MgSO4·7H2O0.2g。2.4生長(zhǎng)速度的比較對(duì)正交試驗(yàn)得出的優(yōu)化培養(yǎng)基與它們的常規(guī)培養(yǎng)基及2株供試菌株在正交試驗(yàn)中生長(zhǎng)速度最快的3,8,6號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果如圖5和圖6所示。根瘤菌ACCC17631培養(yǎng)60h后在優(yōu)化培養(yǎng)基和3號(hào)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度相近,OD600值分別為2.126和2.092,在6號(hào)培養(yǎng)基中的OD600值為1.99,均高于常規(guī)培養(yǎng)基YMA中的1.438;同樣根瘤菌ACCC17676培養(yǎng)60h后測(cè)定的優(yōu)化培養(yǎng)基和正交試驗(yàn)8號(hào)培養(yǎng)基的OD600值分別為2.123和2.002,而對(duì)照YMA只有1.694,根瘤菌ACCC17631和ACCC17676的生長(zhǎng)曲線(圖5和圖6)更進(jìn)一步說(shuō)明篩選出來(lái)的優(yōu)化培養(yǎng)基優(yōu)于常規(guī)YMA培養(yǎng)基。3培養(yǎng)基組分的優(yōu)化目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于根瘤菌培養(yǎng)基優(yōu)化的研究主要集中于大豆(Glycinemax)、花生(Arachishypogaea)等經(jīng)濟(jì)作物,對(duì)豆科牧草,特別是紫花苜蓿的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。苜蓿根瘤菌的常規(guī)培養(yǎng)基是YMA培養(yǎng)基,但由于YMA培養(yǎng)基是半合成培養(yǎng)基,用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)時(shí),成本較高。本研究在YMA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上針對(duì)碳源、氮源以及培養(yǎng)基的其他主要成分做出了優(yōu)化。碳源、氮源的利用試驗(yàn)表明,蔗糖和甘露醇是2株供試菌株比較理想的碳源,但是蔗糖價(jià)格相對(duì)較低,故選蔗糖作為碳源更加經(jīng)濟(jì)高效。而大豆粉和酵母粉分別是根瘤菌ACCC17631和ACCC17676最佳的氮源選擇。正交試驗(yàn)以及優(yōu)化培養(yǎng)基的驗(yàn)證試驗(yàn)得出根瘤菌ACCC17631(ACCC17676)的最佳培養(yǎng)基配方(g·L-1):蔗糖20,K2HPO40.25,KH2PO40.25,MgSO4·7H2O0.2,大豆粉(酵母粉)2.4,NaCl0.1,pH6.8～7.0。另外,通過(guò)2株供試菌株的對(duì)比試驗(yàn)證明,苜蓿