農(nóng)用抗生素的研究與開發(fā)

農(nóng)用抗生素的研究與開發(fā)

0大力生產(chǎn)和應(yīng)用環(huán)保型生物農(nóng)藥在由各種病原體引起的植物感染中，約70%的疾病是由真菌引起的。長期以來,人們大量使用化學(xué)農(nóng)藥防治植物真菌病害,雖然短時間內(nèi)收到了良好的經(jīng)濟(jì)效果,但是,隨著時間的推移,化學(xué)農(nóng)藥造成的諸多問題也日益顯現(xiàn)。由于化學(xué)農(nóng)藥的一些毒副作用以及人們對“綠色食品”要求的提高和環(huán)境保護(hù)意識的增強(qiáng),研究開發(fā)和生產(chǎn)無公害的生物農(nóng)藥成為當(dāng)務(wù)之急。農(nóng)用抗生素作為生物農(nóng)藥的一個重要分支,因其具有高效、易分解、無殘留、與環(huán)境相容性等優(yōu)點日益受到人們的重視。近年來,人們逐漸認(rèn)識到農(nóng)用抗生素作為生物產(chǎn)生的活性化學(xué)物質(zhì),本質(zhì)上和化學(xué)農(nóng)藥一樣,是具有一定分子量的化學(xué)物質(zhì),也和化學(xué)農(nóng)藥一樣有安全性及和環(huán)境的相容性問題。因此,研究開發(fā)新農(nóng)用抗生素也應(yīng)該和化學(xué)農(nóng)藥一樣在闡明其化學(xué)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上對它的安全性及環(huán)境的影響進(jìn)行詳盡的研究,從而為研究農(nóng)用抗生素的構(gòu)效關(guān)系、作用機(jī)理以及應(yīng)用化學(xué)修飾技術(shù),對一些天然農(nóng)用抗生素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造提供了物質(zhì)基礎(chǔ),進(jìn)一步發(fā)揮農(nóng)用抗生素的優(yōu)越性,使其更好的農(nóng)業(yè)于服務(wù)。1害生物的次級代謝農(nóng)用抗生素是微生物產(chǎn)生的,可用于防治病、蟲、草等有害生物的次級代謝產(chǎn)物。由于農(nóng)用抗生素具有對人畜和非靶標(biāo)生物安全,環(huán)境兼容性好,不易產(chǎn)生抗性,易分解等優(yōu)點,在植物病害防治過程中發(fā)揮著越來越重要的作用。1.1世界藥物的研究農(nóng)用抗生素是隨著醫(yī)用抗生素的發(fā)展而發(fā)展起來的,它的研究始于美國、英國、日本等國科學(xué)家用醫(yī)用抗生素如鏈霉素(Streptomycin)、土霉素(Oxytertracyline)、灰黃霉素(Griseofulvin)等來防治植物病害。隨后,Dekker等相繼報道了一批如放線菌酮(Cycloheximide)、抗霉素A(ActimycinA)以及一些多烯類農(nóng)用抗生素。這一時期的農(nóng)用抗生素發(fā)展比較緩慢。1958年,日本的Takeuchi等成功研制出殺稻瘟菌素S(BlasticidinS),并于1961年大面積應(yīng)用于稻瘟病的防治,基本上取代了有機(jī)汞制劑在防治稻瘟病上的應(yīng)用。殺稻瘟菌素S的發(fā)現(xiàn)和工業(yè)化,使農(nóng)用抗生素的開發(fā)進(jìn)入了新時期。繼殺稻瘟菌素S之后,日本又相繼開發(fā)了春雷霉素(Kasugamycin)、多氧霉素(Polyoxins)、有效霉素(Validmycin)等一系列高效低毒的抗真菌農(nóng)藥新品種。Tanaka&Omura研究表明,1988年總共發(fā)現(xiàn)了約8000種抗生素,其中43%是由日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)的。到1996年所發(fā)現(xiàn)的抗生素類農(nóng)藥中,日本發(fā)現(xiàn)的約占2/3,可見,日本在這方面的研究已經(jīng)走在世界的前面。世界抗生素研究在經(jīng)歷了20世紀(jì)70年代的高速發(fā)展期和80年代新品迭出期以后,進(jìn)入90年代已邁入市場成熟期。一些防病效果好的殺菌劑如稻瘟菌素S(BlasticidinS)、春雷霉素(Kasugamycin)、有效霉素(Validmycin)等已經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn),并在世界范圍內(nèi)推廣使用,取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益。1.2中國抗菌藥的研究與開發(fā)現(xiàn)狀中國是農(nóng)用抗生素生產(chǎn)和應(yīng)用大國,也是農(nóng)用抗生素研究開展較早的國家,早在20世紀(jì)50年代就已經(jīng)開始此類研究,由于當(dāng)時經(jīng)濟(jì)條件的限制進(jìn)展比較緩慢,到20世紀(jì)70年代以后逐漸取得了較大突破,進(jìn)入了蓬勃發(fā)展時期。中國研制成功并在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的農(nóng)用抗生素主要有:井岡霉素(Jinggangmycin)、多抗霉素(Polyoxins)、慶豐霉素(Qingfengmycin)、農(nóng)抗120(Agriculturalantibiotic120)、武夷菌素(Wuyiencin)、中生菌素(Zhongshengmycin)等10多個品種。目前,大規(guī)模生產(chǎn)并且應(yīng)用面積最大的品種是井岡霉素,年產(chǎn)值達(dá)到5億多元。進(jìn)入20世紀(jì)90年代,中國的抗生素研究開發(fā)又進(jìn)入一個新的發(fā)展高潮,科研水平處于世界先進(jìn)國家之列。目前,中國研究開發(fā)農(nóng)用抗生素新品種的數(shù)量在不斷增加,如西北農(nóng)林科技大學(xué)從產(chǎn)生菌委內(nèi)瑞拉鏈霉菌秦嶺變種(Streptomycesvenezuelaevar.qinlingensisn.var.)中分離純化出的瑞拉霉素(Zuelaemycin)對植物病原真菌有很強(qiáng)的抑制作用,該項成果已于2002年在西安通過鑒定。浙江省農(nóng)科院植保與微生物研究所施躍峰等從刺孢吸水鏈霉菌天目山亞種(S.hygrospinosvar.tianmushanensisn.var.Sangeta1)發(fā)酵液中,分離純化出一種核苷類抗生素——抑霉菌素(Yimeimycin),對瓜類白粉病菌、灰霉病菌、稻瘟病菌、稻紋枯病菌、炭疽病菌、黃瓜枯萎病菌等病原真菌具有強(qiáng)抑制活性,抑霉菌素的開發(fā)研究已獲得國家863計劃立項資助。沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)從土壤中分離到1株對番茄葉霉病有很好作用的抗生素——凱地菌素產(chǎn)生菌,編號為SY20-4,目前正在研究中。2抗真菌育種中抗生素的有效成分研究2.1國外抗真菌工農(nóng)業(yè)抗旱抗生素的有效結(jié)論的研究2.1.1色產(chǎn)色鏈霉菌滅瘟素BlasticidinS是第一個成功應(yīng)用于農(nóng)業(yè)的核苷類抗生素。1958年,Takeuchi等從灰色產(chǎn)色鏈霉菌(Streotomycesgriseochromogenes)中成功將其分離。1959年,Misato等發(fā)現(xiàn)BlasticidinS對稻瘟病有很好的抑制作用。其結(jié)構(gòu)見圖1。除了BlasticidinS外,從同一菌株中又分離到了BlasticidinA,B,和C,但是在實際應(yīng)用中,它們沒有抑菌效果。2.1.2美多酚2.1.3基于iha.aseonus的水稻紋枯病防治多氧霉素(Polyoxins)是一種肽嘧啶核苷類抗生素,它是日本的Klsono等從可可鏈霉菌阿蘇變種(S.cacaoivar.asoensis)中分離得到的代謝產(chǎn)物,對水稻紋枯病及其他真菌病害有良好的防治效果。多氧霉素主要成分包括A-M13種組分,結(jié)構(gòu)見圖3,由于結(jié)構(gòu)式中的R1、R2、R3不同而有多種結(jié)構(gòu),其中,有效組分為B組分。KiyoshiIsono等分別采用活性炭、Dowex50W離子交換樹脂、SE-Sephadex、纖維素色譜法等分離得到了A、B組分。2.1.4土壤大素pa的活性成分有效霉素(Validmycin)是由日本武田制藥公司篩選抗水稻紋枯病抗菌素時找到的一個新品種。該藥1966年由日本兵庫縣明石市土壤中分離的吸水鏈霉菌檸檬變種(Str.hygroscopicusvar.limoneus)所產(chǎn)生,對水稻紋枯病有良好的抑制效果。有效霉素的化學(xué)成分包括有效霉素A、B、C、D、E、F,和有效氧胺(Validoxylamine)A和B。隨后,又發(fā)現(xiàn)了有效霉素G、H2個組分。其中,用于防治病害的主要是A組分。其結(jié)構(gòu)見圖4。2.1.5小銀行酶pa的基因型菌株春雷霉素(Kasugamycin)又稱春日霉素,是于1963年4月從日本奈良縣春日神社境內(nèi)的土壤中分離得到的一種放線菌所產(chǎn)生的氨基糖苷類抗菌素,其產(chǎn)生菌為小金色鏈霉菌(SterptomycesKasugaensis)。其結(jié)構(gòu)見圖5。春雷霉素對稻瘟病菌有強(qiáng)烈的抑制作用。2.2抗真菌育種中的抗真菌有效成分的研究2.2.1石蠟2.2.2農(nóng)抗400外因子類抗菌素農(nóng)抗120(Agriculturalantibiotic120)是刺孢吸水鏈霉菌北京變種(Streptomyceshygrospinosusvarbeijingensis)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。該菌于1957年由中國農(nóng)科院土肥所劉守初等在中國農(nóng)科院實驗農(nóng)場分離得到。中國農(nóng)科院生防室進(jìn)行了該杭生素的開發(fā)研究,并對其理化性質(zhì)、組分、作用機(jī)理和誘變育種作了一系列的研究。農(nóng)抗120是嘧啶核苷類抗菌素,其主要組分為120-B,類似下里霉素(Harimycan),次要組分120-A和120-C,類似潮霉素B(Hy-gronycanB)和星霉素(Asteromycin)。江愛兵分別用堿性氧化鋁、硅膠G、711離子交換樹脂、732離子交換樹脂、H101離子交換樹脂、微晶纖維素制成層析柱,水飽和的正丁醉作為流動相調(diào)pH值4、9分別進(jìn)行柱層析,最后選取硅膠GF薄層層析得到I、Ⅱ號素2個具有很強(qiáng)的抑制真菌能力的活性物質(zhì)。2.2.3尼可口及其衍生物尼可霉素(Nikkomycin)首先是由德國的Z?hner等從唐德鏈霉菌的發(fā)酵液中分離的。中國是由中國科學(xué)院微生物研究所從東北土壤中分離到的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌7100是尼可霉素的良好產(chǎn)生菌。尼可霉素是一類兩性水溶性核苷肽類抗生素,到目前為止已從野生株及突變株的發(fā)酵液中分離到20多種活性單組分,其中研究較多的活性組分為X和Z,兩者均為別呋喃糖醛酸的衍生物,尼可霉素X和Z均是由鏈霉菌屬(Streptomycestendae)的發(fā)酵液中分離出來的,化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖7。尼可霉素在生物合成基因研究方面取得了很大的進(jìn)展,但是在分離提取等下游技術(shù)方面的報道不多。汪志鑫采用離子交換法和減壓濃縮法對尼可霉素的分離提取工藝進(jìn)行了研究。2.2.4萬隆素2.2.5植物界elisa/外部材料武夷菌素是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所1979年從福建省武夷山區(qū)采集的1株鏈霉菌——不吸水鏈霉菌武夷變種(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)分離的1種核苷類抗生素,又稱農(nóng)抗Bo-10。對植物真菌性病害具有廣譜性和特異性,尤其對蔬菜真菌病害防效突出。武夷菌素為水溶性物質(zhì),目前已分離出A、B2個組分。其主要活性組分A為1種結(jié)構(gòu)全新的、具有1含過氧鍵側(cè)鏈的氮取代胞苷骨架的核苷類抗生素,具有中國自主知識產(chǎn)權(quán),但其側(cè)鏈有過多的雙氧鍵,穩(wěn)定性還有待待進(jìn)一步研究確定。初步確定的結(jié)構(gòu)見圖9。2.2.6菌株組成、結(jié)構(gòu)中生菌素(Zhongshengmycin)是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物防治研究所研制成功的一種新型生物農(nóng)藥殺菌劑,產(chǎn)生菌屬于淡紫色灰鏈霉菌海南變種(Streptomyceslavendulaevar.hainanensisn.var.)。中生菌素的主要組分為N-糖苷類堿性水溶性物質(zhì),屬于鏈絲菌素族抗生素的一員,其結(jié)構(gòu)包括一分子古洛糖胺,一分子鏈里定和由1-7分子β-賴氨酸組成的肽鏈。結(jié)構(gòu)見圖10。3結(jié)構(gòu)的優(yōu)化設(shè)計及篩選隨著人們環(huán)保意識的增強(qiáng),一些不易降解的化學(xué)農(nóng)藥已經(jīng)禁止使用,如DDT、六六粉等,各主要發(fā)達(dá)國家均陸續(xù)公布了禁用化學(xué)農(nóng)藥名單并制定了生物農(nóng)藥(包括農(nóng)用抗生素)的發(fā)展規(guī)劃。隨著生物農(nóng)藥尤其是農(nóng)用抗生素的廣泛應(yīng)用,人們逐漸認(rèn)識到農(nóng)用抗生素作為活性化學(xué)物質(zhì),也同樣具有安全性及和環(huán)境的相容性問題。因此,研究農(nóng)用抗生素的有效成分,從其化學(xué)結(jié)構(gòu)角度進(jìn)行討論,對新農(nóng)用抗生素的研究與開發(fā)將起到指導(dǎo)性的作用。從大的方面來說,農(nóng)用抗生素的研究主要是上游過程的研究和下游過程的研究。上游過程中,除了繼續(xù)篩選新的農(nóng)用抗生素,通過傳統(tǒng)的物理化學(xué)等方法對產(chǎn)生菌進(jìn)行誘變,篩選效價更高的菌株外,還應(yīng)該利用分子生物學(xué)等方法,在基因水平對產(chǎn)生菌有針對性的進(jìn)行改造,提高產(chǎn)生菌的發(fā)酵水平,降低生產(chǎn)成本。下游過程是為上游過程服務(wù)的,在農(nóng)用抗生素整個研究中尤為重要。在下游過程中,農(nóng)用抗生素的分離純化技術(shù)及有效成分的結(jié)構(gòu)鑒定是關(guān)鍵環(huán)節(jié),直接關(guān)系到農(nóng)用抗生素能否符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并且產(chǎn)業(yè)化進(jìn)入市場。在鑒定結(jié)構(gòu)以后,可以利用化學(xué)手段,對農(nóng)用抗生素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾和改造,從而篩選效價更高的衍生物;為農(nóng)用抗生素菌種誘變選育及利用分子生物學(xué)技術(shù)對菌種進(jìn)行改造提供檢測的依據(jù);為明確農(nóng)用抗生素的作用機(jī)理提供物質(zhì)基礎(chǔ);人們還可以利用已知農(nóng)用抗生素的結(jié)構(gòu)為前體,按照人們的意愿合成藥效更好、對環(huán)境影響更小的生物農(nóng)藥。所以,在以后農(nóng)用抗生素的研究工作中,無論是新開發(fā)的還是已經(jīng)商品化的都要加強(qiáng)研究、生產(chǎn)、應(yīng)用過程中的基礎(chǔ)研究,尤其是有效成分的研究,提高農(nóng)用抗生素的整體水平,增強(qiáng)農(nóng)副產(chǎn)品的國際競爭力。米多霉素(Mildiomycin)是由放線菌科鏈霉菌屬的龜裂鏈輪絲菌(StreptoverticilliumrimofaciensB-98891)產(chǎn)生的一種水溶性核苷類代謝產(chǎn)物,結(jié)構(gòu)見圖2。其產(chǎn)生菌是SetsuoHarada等從日本的PapuaNewGuinea地區(qū)的土壤中分離得到的。米多霉素對白粉病菌等粉狀霉菌有很強(qiáng)的抑制作用。日本學(xué)者Suita等探索性的摸索了一條米多霉素的提取方法,但是該流程繁瑣且成本較高,所以就限制了其在實際中的應(yīng)用。YongChen等根據(jù)其結(jié)構(gòu)特性,選用弱酸性HZ110TM型離子交換樹脂,對米多霉素在HZ110TM樹脂上的的分離提取工藝進(jìn)行了研究,實現(xiàn)了米多霉素的高收率、高純度的分離純化。井岡霉素(Jinggangmycin)是1972年上海農(nóng)藥所在中國井岡山地區(qū)土壤中發(fā)現(xiàn)的吸水鏈霉菌井岡變種(S.hygroscopicusvar.jinggangensisyen)產(chǎn)生的一種氨基糖苷類代謝產(chǎn)物,對水稻紋枯病有良好的的防治作用。經(jīng)組分測定,井岡霉素化學(xué)成分為A、B、C、D、E、F6個組分,后來又報道了G和H2個組分,其中,有效成分為井岡霉素A,與日本的有效霉素A的結(jié)構(gòu)相似,其結(jié)構(gòu)見圖6。自井岡霉素生產(chǎn)以來,文獻(xiàn)中先后報道了5種提取方法,其中以離子交換法的分離提取效果最好。上海農(nóng)藥所用凝膠型離子交換法對井岡霉素進(jìn)行了分離提取。鄭裕國等通過對樹脂類型、上柱流速、洗脫劑等條件的篩選,摸索了離子交換法提取井岡霉素的提取工藝路線,得到了化學(xué)效價900u/mg的井岡霉素粉劑,為井岡霉素降低生產(chǎn)成本,獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益提供了理論基礎(chǔ)。楊志鈞等用大孔離子交換樹脂對井岡霉素進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)大孔強(qiáng)酸性樹脂比凝膠強(qiáng)酸性樹脂交換容量大