mmp-12基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游ag多態(tài)性與癌遺傳關(guān)系的研究

mmp-12基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游ag多態(tài)性與癌遺傳關(guān)系的研究

0mmp-12基因基質(zhì)金屬酶（pmps）是一個(gè)由鋅依賴性的銅水合酶家族。它能分解細(xì)胞的外部反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附，維持腫瘤的微環(huán)境，在腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。另一方面也可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡、改變細(xì)胞的微環(huán)境及調(diào)節(jié)血管形成等參與腫瘤的發(fā)生過程。MMP-12是這個(gè)家族中的一員,又稱巨噬細(xì)胞彈性蛋白酶或金屬彈性蛋白酶,其底物是多種細(xì)胞外基質(zhì)和非細(xì)胞外基質(zhì)成分。MMP-12基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游82bp處存在單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP),體外實(shí)驗(yàn)表明此處的SNP可通過改變基因轉(zhuǎn)錄活性而影響該蛋白的表達(dá),有關(guān)MMP-12A-82GSNP與食管癌、賁門癌易感性關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。本研究應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP)分析方法,探討MMP-12A-82GSNP對河北省食管癌、賁門癌高發(fā)區(qū)—磁縣和涉縣人群食管鱗狀細(xì)胞癌、賁門腺癌的易感性的影響。1數(shù)據(jù)和方法1.1研究對象的選擇316名食管鱗狀細(xì)胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC)患者、243名賁門腺癌(gastriccardiacadenocarcinoma,GCA)患者均來自河北省食管癌、賁門癌高發(fā)區(qū)磁縣和涉縣的癌前普查,609名健康對照為在相同地區(qū)和同一時(shí)間、通過癌前普查獲得,所有研究對象均知情同意本項(xiàng)研究,由專門人員調(diào)查登記所有研究對象的性別、年齡、吸煙史及上消化道腫瘤家族史。將現(xiàn)吸煙或曾吸煙每天5支以上并持續(xù)兩年或兩年以上者定義為吸煙個(gè)體。將家族中有1名以上一級(jí)親屬和(或)2名以上二級(jí)親屬患有食管癌/賁門癌/胃癌者定義為上消化道腫瘤(uppergastrointestinalcancer,UGIC)家族史陽性。1.2枸杞酸鈉抗凝所有研究個(gè)體均采集外周靜脈血5ml,經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝,4℃冰箱保存。并在采血后一周內(nèi)以蛋白酶K消化-飽和氯化鈉鹽析法提取外周血白細(xì)胞DNA。1.3pcr和基因型分析MMP-12A-82G基因型檢測應(yīng)用PCR-RFLP方法進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為20μl,其中模板DNA100ng,10×PCR緩沖液2μl,染料2μl,TaqDNA聚合酶(北京賽百盛生物有限公司)2.5U,dNTPs200μM,上游引物(5′-GAGATAGTCAAGGGATGATATCA-3′)和下游引物(5′-AAGAGCTCCAGAAGCAGTGG-3′)各200nM,MgCl2(25nM)1.2μl。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性10min,然后94℃變性45s、57℃退火45s、72℃延伸45s,35個(gè)循環(huán)后,72℃繼續(xù)延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳為199bp,經(jīng)限制性內(nèi)切酶PvuⅡ(大連寶生物工程有限公司)37℃酶切16h后,進(jìn)行4%瓊脂糖凝膠電泳分析基因型。A/G基因型存在PvuⅡ的識(shí)別位點(diǎn),經(jīng)酶切后表現(xiàn)為199bp、175bp和24bp三條DNA片段,而A/A基因型缺乏PvuⅡ的識(shí)別位點(diǎn)僅有一個(gè)199bp的片段,見圖1。為進(jìn)行基因型檢測的質(zhì)量控制,每一批PCR反應(yīng)均以滅菌雙蒸水替代模板DNA作為陰性對照,并隨機(jī)挑取10%DNA標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。1.4mmp-12基因型分布的模擬用卡方檢驗(yàn)比較基因型頻率的觀察值與預(yù)期值,并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡分析。病例組和對照組的MMP-12基因型及等位基因型分布比較采用行×列表的卡方檢驗(yàn)進(jìn)行。應(yīng)用非條件Logistic回歸模型計(jì)算表示相對風(fēng)險(xiǎn)度的比值比(oddsratio,OR)及其95%可信區(qū)間(confidenceinterval,CI),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS11.5軟件包進(jìn)行。2結(jié)果2.1ugic家族ESCC患者組、GCA患者組與對照組之間性別、年齡構(gòu)成相似(P>0.05)。ESCC患者組、GCA患者組中吸煙個(gè)體比例與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.53和2.70,P=0.47和0.10)。ESCC患者組、GCA患者組中UGIC家族史陽性個(gè)體比例分別為49.4%、50.2%,顯著高于對照組36.0%(χ2=15.51和14.68,P值均為0.00),表明UGIC家族史可能增加ESCC和GCA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(經(jīng)性別和年齡校正后的OR=1.74和1.77,95%CI=1.32～2.29和1.31～2.39),見表1。所有標(biāo)本均成功進(jìn)行了基因型分型,所有重復(fù)分型結(jié)果均與原結(jié)果相符。經(jīng)卡方檢驗(yàn),健康對照組MMP-12A-82G基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。2.2兩組患者的基因型頻率及吸煙行為的比較MMP-12A-82GSNP在ESCC患者組、GCA患者組與對照組中A/A、A/G和G/G基因型頻率分別為96.2%、3.8%、0,93.4%、6.6%、0和94.1%、5.9%、0。MMP-12A-82GSNP的A/A和A/G的基因型頻率在ESCC患者組、GCA患者組與對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.89和0.14,P=0.17和0.71)。在ESCC患者組、GCA患者組與對照組中A和G的等位基因頻率分別為98.1%、1.9%,96.7%、3.3%和97.0%、3.0%。A和G的等位基因頻率在ESCC患者組、GCA患者組及對照組之間差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.84和0.13,P=0.18和0.72),見表1。根據(jù)吸煙狀況分層分析發(fā)現(xiàn),吸煙組中GCA患者組與對照組A/A、A/G基因型頻率分別是89.8%、10.2%和95.0%、5.0%,GCA患者組A/G基因型頻率雖明顯高于對照組,但其兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.43,P=0.06)。與A/A基因型相比,A/G基因型增加吸煙個(gè)體GCA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相對風(fēng)險(xiǎn)度OR值為2.13(95%CI=0.94～4.83)。吸煙組中ESCC患者組A/A、A/G基因型頻率為96.0%、4.0%,與對照組基因型頻率之間無顯著性差異。與A/A基因型相比,A/G基因型對吸煙組人群ESCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)并無影響(OR=0.78,95%CI=0.27～2.24)。也未發(fā)現(xiàn)MMP-12基因A-82GSNP對非吸煙組人群ESCC、GCA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響(OR=0.55,95%CI=0.23～1.30和OR=0.47,95%CI=0.16～1.39)。另外在根據(jù)上消化道腫瘤家族史分層分析中,未發(fā)現(xiàn)MMP-12基因A-82GSNP與ESCC、GCA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間存在關(guān)聯(lián),見表2。3mmp-12在臨床意義上的作用食管癌和賁門癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤,我國河北省的磁縣和涉縣為食管癌、賁門癌等上消化道腫瘤的高發(fā)地區(qū)。研究表明,環(huán)境因素與食管癌、賁門癌的發(fā)生密切相關(guān),但是暴露于相同環(huán)境因素的人群卻只有少數(shù)人發(fā)病,提示個(gè)體之間存在遺傳易感性的差異,并且這種易感性差異在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究顯示,UGIC陽性家族史可增加ESCC和GCA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),進(jìn)一步證實(shí)了遺傳背景在這兩種腫瘤的發(fā)病過程中可能起重要作用,也提示有上消化道腫瘤家族史的人群,應(yīng)定期檢查以發(fā)現(xiàn)早期病變。MMPs是一個(gè)高度依賴于鋅的蛋白水解酶家族,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。大多數(shù)MMPs成員表達(dá)和活性的增高與幾乎所有人類惡性腫瘤的階段進(jìn)展、侵襲性增強(qiáng)和生存期縮短有關(guān)。MMP-12能夠降解多種細(xì)胞外及非細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成分,一方面它通過分解纖溶酶原和Ⅴ型、ⅩⅢ型膠原產(chǎn)生血管抑素和內(nèi)抑素抑制血管生成,另一方面,它還能分解細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分如Ⅳ型膠原和纖維蛋白促進(jìn)血管生成。有報(bào)道顯示在某些腫瘤中MMP-12表達(dá)增高可以使病人具有良好的預(yù)后。MMP-12A-82G多態(tài)位于MMP-12基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子激動(dòng)蛋白-1(AP-1)結(jié)合區(qū)域,體外實(shí)驗(yàn)表明A等位基因與AP-1結(jié)合能力高導(dǎo)致MMP-12啟動(dòng)子活性增高從而使該基因表達(dá)增高。本研究的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示MMP-12基因A-82GSNP與河北省磁、涉縣人群的食管癌、賁門癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān);但與A/A基因型相比,攜帶A/G基因型有增加吸煙個(gè)體GCA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的趨勢(OR=2.13,95%CI=0.94～4.83)。而Kader等報(bào)道攜帶G等位基因可顯著增加吸煙人群膀胱癌的轉(zhuǎn)移能力(OR=2.32,95%CI=1.30～4.12),另外Su等也有研究顯示攜帶G等位基因有增加男性人群肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的趨勢(OR=1.20,95%CI=0.91～1.59)。由于本研究中吸煙人群均為男性,因此本研究結(jié)果與以上研究具有一致性。本研究結(jié)果中基因型頻率分布G/G基因型為0,這與張榮葆等對中國北方漢族人群的研究和Shin等對中國上海女性乳腺癌的研究中的MMP-12A-82GSNP基因分型結(jié)果一致。由于所研究人口中G等位基因頻率極低(3.0%),這種基因型的不均衡分布也會(huì)降低統(tǒng)計(jì)學(xué)效力,而我們的部分結(jié)果又是在分層分析后樣本量較小的基礎(chǔ)上得到的,因此有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究證實(shí)這種趨勢。Yang等報(bào)道MMP-12在結(jié)直腸癌中的過表達(dá)與延長病人存活期和減少腫瘤血管形成有關(guān),與此類似,Kerkel?等的研究也表明MMP-12在腫瘤部位巨噬細(xì)胞中的表達(dá)與高分化的腫瘤細(xì)胞相關(guān)。這些研究顯示,MMP-12可能通過分解纖溶酶原和Ⅴ型、ⅩⅢ型膠原產(chǎn)生血管抑素和內(nèi)抑素抑制血管生成的作用對組織癌變起到防